CC BY
39
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
УДК: 619: 616.98: 578.833.3: 636.2(571.1/.5)
Частота выявления посредством ОТ-ПЦР и выделения в культуре клеток вируса диареи крупного рогатого скота в Сибири
О.В. Семенова, старший научный сотрудник лаборатории вирусологии ([email protected]), Т.И. Глотова, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией вирусологии ([email protected]), А.Г. Глотов, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией биотехнологии—диагностический центр ([email protected]), А.В. Нефедченко, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии — диагностический центр, доцент ([email protected]).
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (630501 Новосибирская область, Новосибирский район, Краснообск, а/я 463).
Вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV) принадлежит к роду РезЫуииз, семейству Р1ау1утд.ае. Он представлен двумя генетическими типами — BVDV-1 и BVDV-2, а также двумя фенотипами — цитопатогенным (ЦП) и нецитопатогенным (НЦП) [21]. По данным некоторых исследователей, насчитывается не менее 21 субтипа BVDV-1 [9, 11, 14, 16, 18] и 4 субтипа BVDV-2 (2а.2й). Актуальность получения изолятов вируса продиктована фрагментарными сведениями в отечественной литературе о данных видах исследований. Кроме того, описанные изоляты относятся в основном к ЦП биотипу, являющемуся тупиковой ветвью эволюции возбудителя. Цель работы. Изучить частоту выявления BVDV среди крупного рогатого скота в Сибири и особенности его выделения в первичной культуре клеток тестикул бычка (ТБ).
Материалы и методы. Работу выполняли в 2007-2015 гг. на молочных комплексах Сибири, где не проводилась специфическая профилактика BVDV. Исследовали 1275 проб биоматериала посредством ОТ-ПЦР на присутствие генома вируса. Для выделения BVDV брали пробы биоматериала, положительные в ОТ-ПЦР, и первичную культуру клеток ТБ.
Заключение. Частота выявления вируса в пробах биоматериала составила 52,3 %, а выделения в культуре клеток — 38,1 %. Получено 25 изолятов вируса BVDV (из них ЦП — 17, НЦП — 18) с характерными для представителей рода Ре8Ыу1ти8 антигенными свойствами. Они были выделены из проб биоматериала от животных преимущественно с респираторной и генитальной формами болезни, а также от персистентно инфицированных. Лучше всего вирус размножался и накапливался в первичной культуре клеток ТБ, в которой к 3...5-му пассажу его титр составлял 5,25.6,75 ^ ТЦД50/мл. После адаптации к перевиваемым линиям культур клеток ЦП и НЦП агенты к 5-му пассажу накапливались в титрах 4,5.6,5 ^ ТЦД50/м^ в культуре коронарных сосудов теленка (КСТ) и 3,25.4,5 ^ ТЦД50/мл в культуре клеток почки теленка (MDBK).
Ключевые слова: вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, крупный рогатый скот, изолят, генотип, фенотип, субтип, цитопатогенный, нецито-патогенный
Сокращения: КРС — крупный рогатый скот, НЦП— нецитопатогенный, ОТ-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ПИ — персис-тентная инфекция, РН — реакция нейтрализации, РНК — рибонуклеиновая кислота, ТЦД — тканевая цитопатогенная доза, ЦП — цитопатогенный, ЦПД — цитопатогенное действие, BVDV — Bovine viral diarrhoea virus (вирус диареи крупного рогатого скота), KST (КСТ) — culture of calf coronary vessels (перевиваемая культура клеток коронарных сосудов теленка), MDBK — madin-darby bovine kidney cells (перевиваемая культура клеток почки теленка), TB (ТБ) — bovine testicle primary cell culture (первичная культура клеток тестикул бычка)
Введение
Вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV) принадлежит к роду Pestivirus, семейству Flaviviridae. Он представлен двумя генетическими типами — BVDV-1 и BVDV-2, а также двумя фенотипами — ЦП и НЦП [21] и распространен по всему миру [2, 6, 15, 12, 20]. По данным некоторых исследователей, нас-
читывается не менее 21 субтипа BVDV-1 [9, 11, 14, 16, 18] и 4 субтипа BVDV-2 (2а...2ф. Вызывает широкий спектр клинических признаков, но наиболее значимыми последствиями инфекции являются репродуктивные проблемы и болезни респираторного тракта [1, 6, 15].
Особенность вируса — способность преодолевать плацентарный барьер и инфицировать плод. Если заражение пришлось на 40.125-й день стельности, рождаются персистентно инфицированные телята [1, 6, 10]. Устанавливать такую форму инфекции способны только НЦП штаммы. По мере изучения молекулярной биологии вируса стало известно, что ЦП фенотип возникает путем мутаций из НЦП [17, 19].
Выделение BVDV в культуре клеток — трудоемкий процесс, в котором используют различные клеточные линии, однако предпочтение отдается первичным культурам клеток [2.4, 7].
Сведения о выделении и характеристиках изолятов BVDV в России фрагментарны. Актуальность исследования обусловлена тем, что полученные и охарактеризованные ранее на территории Российской Федерации изоляты вируса относились, в основном, к ЦП фенотипу первого типа [2, 8]. Кроме того, в научной литературе нет данных за последнее десятилетие о выделении BVDV на территории Сибири.
Цель исследования
Изучить частоту выявления BVDV среди КРС в Сибири и особенности его выделения в первичной культуре клеток ТБ.
Материалы и методы
Исследования выполнены в 2007-2015 гг. на молочных комплексах, где не проводили специфической профилактики вирусной диареи.
Посредством ОТ-ПЦР исследовали 1275 проб биоматериала от телят до 6-ти месячного возраста, нетелей, коров и быков-производителей.
Для изоляции вируса использовали пробы крови, мезентериальных и легочных лимфатических узлов, селезенки, легких и влагалищных выделений. Из них готовили 10%-е суспензии на стерильном фосфатном буферном растворе (рН 7,4...7,6) с добавлением 100 ед/мл канамицина и 500 ед/мл гентамицина. Суспензии выдерживали при 4 °С в течение 2.3 ч, затем центрифугировали 30 мин при 3000 мин-1. Полученные супернатанты очищали путем фильтрации через фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
Выделяли BVDV в 24-луночных культуральных планшетах (TPP, Швейцария) в ТБ c последующей адаптацией к субкультуре ТБ и перевиваемым линиям культур клеток КСТ и MDBK. В качестве ростовой использовали питательную среду Игла МЕМ с однократным или двойным набором аминокислот и витаминов, 0,06 % L-глутамина, 100 мкг/мл канамици-на. Клетки культивировали при 37 °С в присутствии 5 % СО2. Для предупреждения возможной контаминации культуры клеток BVDV использовали сыворотку крови лошади (Биолот, Санкт-Петербург).
Выделенные ЦП агенты идентифицировали в РН при помощи моноспецифической сыворотки к референтному штамму вируса. Параллельно вирус титровали с нормальной сывороткой. Индекс нейтрализации, равный 2 lg ТЦД50/мл и выше, свидетельствовал о принадлежности изолята к BVDV. Моноспецифические гипериммунные сыворотки к выделенным изолятам и референтному штамму получали путем гипериммунизации кроликов по схеме [5].
Антигенное родство изолятов определяли в перекрестной РН с сыворотками, полученными на выделенные ЦП агенты и референтный штамм вируса ВК-1. Степень антигенного родства рассчитывали по формуле R%=100Vr1...r2, где:
_ индекс нейтрализации сыворотки 1 к вирусу 2 индекс нейтрализации сыворотки 1 к вирусу 1
_ индекс нейтрализации сыворотки 2 к вирусу 1 индекс нейтрализации сыворотки 2 к вирусу 2
НЦП изолятов идентифицировали после пяти «слепых» пассажей в культуре клеток ТБ путем исследования культуральной жидкости в ОТ-ПЦР.
Статистическую обработку данных осуществляли с использованием пакета программ для статистической обработки Microsoft Office Excel, 2003 по общепринятым методам описательной статистики.
Результаты и обсуждение
В 52,3 % исследованных проб биоматериала установили присутствие генома BVDV. Максимальное количество положительных проб (78,1 %) выявили на молочных комплексах с наличием импортного скота. На таких же комплексах без импорта животных количество положительных проб составило 65,5 %; в закрытых средних и мелких товарных хозяйствах без импорта скота — 48,5 %.
Для выделения BVDV использовали первичную культуру ТБ (рис. 1). Сложности получения изолятов вируса обусловлены тем, что животные с наличием клинических признаков болезни не всегда являются подходящим источником для этой цели. Кроме того, выделение вируса во многом зависит от правильного отбора, хранения и транспортировки проб биоматериала, а также от качества используемых культур клеток, которые должны быть свободными от инфицирования НЦП штаммами BVDV
В первичной культуре клеток ТБ на 3.5-е сутки инкубации при 37 оС к 3.5-му пассажу ЦП изоляты вируса вызывали видимые дегенеративные изменения в монослое и накапливались в титрах 5,25.6,75 ^ ТЦД50/мл. ЦПД вируса выражалось в появлении мелкоочаговой, мелкозернистой дегенерации и округлении клеток, истончении и разрыве монослоя и отслоении клеток. В некоторых случаях наблюдали вакуолизацию цитоплазмы пораженных клеток. Конечная картина ЦПД характеризовалась гибелью клеток, их отслоением, наличием на поверхности роста отдельных тяжей и фрагментов (рис. 2).
Характеристика изолятов BVDV, выделенных при разных клинических формах болезни Characterization of virus isolates obtained from different clinical forms
Наименование изолята ЦПД, +/- Клиническая форма болезни
Крем +
К-9 +
К-5 +
Соло -
Бон - Респираторная
1140 -
К-3 -
Бизон -
Ирма 01/06 -
Соло-1 -
И-4 +
СВ-4 +
Т-1 +
11/07 +
Т-2 - Генитальная
РА -
Т-3 -
Кремль -
Благо -
Ирма 05/07 -
Маяк -
С-1 -
Ембай - Персистентная
Бор -
Рам -
О.В. Семенова, Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, А.В. Нефедченко
Рис. 1. Первичная культура клеток ТБ, неин-фицированная (48 ч инкубации), х1000 (Ок. 10. Об. 100) (фото О.В. Семеновой) Fig.1. Primary cell culture TB non-infected with BVDV (48 h incubation), x1000 (Oc. 10. L. 100) (photo by O.V. Semenova)
Рис. 2. Первичная культура клеток ТБ, инфицированная ЦП изолятом BVDV (72 ч инкубации), х1000 (Ок. 10. Об. 100) (фото О.В. Семеновой) Fig.2. Primary cell culture TB infected with CP BVDV isolate (48 h incubation), x1000 (Oc. 10. L. 100) (photo by O.V. Semenova)
Рис. 3. Перевиваемая культура клеток КСТ, неин-фицированная (48 ч инкубации) х1000 (Ок. 10. Об. 100) (фото О.В. Семеновой) Fig. 3. Continuous cell culture КСТ non-infected with BVDV isolate (48 h incubation), x1000 (Oc. 10. L. 100) (photo by O.V. Semenova)
Размножение НЦП изолятов BVDV не сопровождалось видимыми морфологическими изменениями монослоя клеток.
Всего было получено 25 изолятов BVDV (из них ЦП — 7, НЦП — 18) (табл.). Они были выделены из проб биоматериала, отобранного от животных преимущественно с респираторной и генитальной клиническими формами болезни, а также от персистентно инфицированных. При респираторной форме инфекции выделено 3 ЦП изолята, а при генитальной — 4. Максимальное число НЦП изолятов вируса получено от животных с респираторной формой болезни — 7. От животных с ПИ удалось выделить только НЦП изоляты вируса.
Антигенные свойства ЦП изолятов изучали в перекрестной РН с постоянной дозой сыворотки (разведение 1:10) и десятикратными разведениями вируса, в трехкратной повторности. Гипериммунная сыворотка к референтному штамму ВК-1 нейтрализовала все изоляты BVDV. Были получены также высокие индексы в перекрестной РН изолятов вируса. Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что референтный штамм и выделенные полевые изоляты вируса являются близкородственными: степень их родства находится в диапазоне 85,7.92,7 %.
Существуют определенные трудности получения первичной культуры клеток животных, поэтому актуальным является расширение спектра перевивае-
мых клеточных линий для возможного размножения и накопления в них вируса.
Изоляты BVDV были адаптированы к культуре клеток КСТ (рис. 3), в которой на 3.5-е сутки инкубации при 37 °С к 3.5-му пассажу ЦП (рис. 4) и НЦП агенты накапливались в титрах 4,5.6,5 ^ ТЦД50/мл. К 10-му пассажу ЦП изоляты вызывали видимые изменения в монослое через 24.48 ч при дозе заражения 1 ТЦД50/мл на клетку. В культуре клеток MDBK (рис. 5) на 4.5-е сутки инкубации при 37 °С к 3.5-му пассажу ЦП (рис. 6) и НЦП агенты накапливались в титрах 3,25.4,5 ^ ТЦД50/мл.
Заключение
Максимальная частота выявления вируса была отмечена на крупных молочных комплексах с наличием импортных животных — 78,1 %, в то время как в закрытых средних и мелких товарных хозяйствах без импорта скота достигала 48,5 %.
Всего удалось получить 25 изолятов вируса, причем из них: ЦП — 7, НЦП — 18. Они были выделены из проб биоматериала, отобранных от животных с респираторной (10), генитальной (10) и персистентной (5) формой BVDV-инфекции.
Лучше всего вирус размножался и накапливался в первичной и субкультуре ТБ, к 5-му пассажу титр его достигал 6,75 ^ ТЦд50/мл.
Рис. 4. Перевиваемая культура клеток КСТ, инфицированная ЦП изолятом BVDV(96 ч инкубации), х1000 (Ок. 10. Об. 100) (фото О.В. Семеновой) Fig. 4. Continuous cell culture КСТ infected with CP BVDV isolate (48 h incubation), x1000 (Oc. 10. L. 100) (photo by O.V. Semenova)
Рис. 5. Перевиваемая культура клеток MDBK, неин-фицированная (48 ч инкубации), х1000 (Ок. 10. Об. 100) (фото О.В. Семеновой) Fig. 5. Continuous cell culture MDBK non-infected with BVDV (48 h incubation), x1000 (Oc. 10. L. 100) (photo by O.V. Semenova)
Рис. 6. Перевиваемая культура клеток MDBK, инфицированная ЦП изолятом BVDV (72 ч инкубации), х1000 (Ок. 10. Об. 100) (фото О.В. Семеновой) Fig. 6. Continuous cell culture MDBK infected with CP BVDV isolate (48 h incubation), x1000 (Oc. 10. L. 100 ) (photo by O.V. Semenova)
Процесс выделения BVDV из различных проб биоматериала в культурах клеток является достаточно трудоемким, длительным и материально затратным. Очень часто он осложняется наличием контаминации НЦП вариантами BVDV большинства линий перевиваемых культур и некоторых серий сыворотки крови, используемых для их культивирования в диагностических лабораториях.
Библиография
1. Глотов, А.Г. Вирусная диарея: значение в патологии воспроизводства крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова // Ветеринария. — 2015. — №4. — С. 3-8.
2. Глотова, Т.И. Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота: распространение, особенности клинического проявления, характеристика изолятов вируса / Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, В.А. Качанов // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — 2005. — №6. — С. 62-66.
3. Жестерев, В.И. Чувствительность культур клеток перевиваемых линий к вирусу вирусной диареи КРС / В.И. Жестерев, Т.В. Каламина, Ю.Ф. Калантаенко [и соавт.] // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию ВНИИВВИМ, 9-10 декабря 1998 г., г. Покров, 1998. — С. 117-118.
4. Левченко, С.В. Изучение иммунобиологических свойств возбудителя вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, используемого для изготовления инак-тивированных вакцин: автореф. дис. ... канд. биол. наук (Защищена 29.04.2008) — Владимир: ВНИИЗЖ, 2008. — 25 с.
5. Методы научных исследований в ветеринарии / Под ред. Г.Ф. Коромыслова // Бюллетень Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии. — 1979. — Вып. 34. — 63 с.
6. Нефедченко, А.В. Выявление животных, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС крупного рогатого скота, методом ПЦР/ А.В. Нефедченко, А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, О.В. Кун-гурцева // Ветеринария. — 2011. — №12. — С. 21-25.
7. Халенев, Г.А. Изучение антигенных связей между инактивированными штаммами вируса диареи крупного рогатого скота / Г.А. Халенев, Т.В. Лосева // Проблемы вирусологии, молекулярной биологии и гистологии сельскохозяйственных животных. — 1983. — №4. — С. 22-24.
8. Шилова, Е.Н. Вирусная диарея — болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота в Уральском регионе / Е.Н. Шилова, М.В. Ряпосова, А.И. Шкуратова, И.В. Вялых // Ветеринария. — 2014. — №5. — С. 19-21.
9. Booth, R.E. A phylogenetic analysis of Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) isolates from six different regions of the UK and links to animal movement data / R.E. Booth et al. // Veterinary Research. — 2013. — No. 44. — pp. 43-57.
10. Deregt, D. Bovine viral diarrhea virus: biotypes and disease / D. Deregt, K.G. Loewen // Can. Vet. J. — 1995. — Vol. 36 (6). — pp. 71-78.
11. Factor, C. Genetic diversity of bovine viral diarrhea viruses from the Galicia region of Spain / C. Factor et al. // Veterinary Record Open. — 2016. — No. 3. — e000196. (doi:10.1136/vetre-co-2016-000196).
12. Giangaspero, M. Characterization of genotypes among bovine viral diarrhea virus type1 strains according to palindromic nucleotide substitutions in the genomic 5-untranslated region/ M. Giangaspero, R. Harasawa // J. Virol. Methods. — 2014. — Vol. 195. — pp. 34-53.
13. Giangaspero, M. Numerical taxonomy of the genus Pestivirus: New software for genotyping based on the palindromic nucleotide substitutions method/ M. Giangaspero, С. Apicellab, R. Harasawa // J. Virol. Methods. — 2013. — Vol. 192. — pp. 59-67.
14. Giammarioli, M. Increased genetic diversity of BVDV-1: recent findings and implications thereof./ M. Giammarioli et al. // Virus Genes. — 2015. — No. 50. — pp. 147-151.
15. Houe, H. Epidemiological features and economical importance of bovine virus diarrhoea virus (BVDV) infections/ H. Houe // Vet. Microbiol. — 1999. — Vol. 64. — pp. 89-107.
16. Jackova, A. The extended genetic diversity of BVDV-1: typing of BVDV isolates from France /A. Jackova et al. // Vet Res Commun. — 2008. — No. 32(1). — pp. 7-11.
17. Kummerer, B.M. The genetic basis for cytopathogenicity of pestiviruses / B.M. Kummerer, N. Tautz, P. Becher [et al.] // Veterinary Microbiology. — 2000. — Vol. 77. — pp. 117-128.
18. Luzzago, C. Spatial and temporal reconstruction of bovine viral diarrhea virus genotype 1 dispersion in Italy / C. Luzzago et al. // Infection, Genetics and Evolution. — 2012. — No. 12. — pp. 324-331.
19. Meyers, G. Molecular characterization of pestiviruses /G. Meyers, H-J. Thiel // Adv Virus Res. — 1996. — Vol. 47. — pp. 53?118.
20. Ridpath, J.F. Bovine viral diarrhea virus: global status /J.F. Ridpath // Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract. — 2010. — No. 26(1). — pp. 105-121.
21. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses/ edit. A.M. King, E. Lefkowitz, M.J. Adams et al. San Diego: Academic Press. 2011. —1327 p.
References
1. Glotov A.G., Glotova T.I., Veterinaria, 2015, No. 4, pp. 3-8.
2. Glotova T.I., Glotov A.G., Kachanov V.A., Sibirskij vestnikselskohozyajstvennojnauki, 2005, No. 6, pp. 62?66.
3. Zhesterev V.I., Kalamina T.V., Kalantaenko Y.F., Diagnostika, profilaktika i mery borby s osobo opasnymi i ehkzoticheskimi boleznyami zhivotnyh: materialy mezhdunarodnoj nauchno-prak-ticheskoj konferencii, posvyashchennoj 40-letiyu VNIIVVIM. (Proceedings of the International Conference dedicated to 40-th anniversary of VNIIVVIM «Diagnostics, preventive maintenance and the measure of fight with the separately dangerous and exotic diseases of the animals», 9?10 decembre, 1998, Pokrov, pp. 117-118.
4. Levchenko S.V., Izuchenie immunobiologicheskih svojstv vozbuditelya virusnoj diarei-bolezni slizistyh obolochek krupnogo rogatogo skota, ispolzuemogo dlya izgotovleniya inaktivirovannyh vakcin (The study of immunobiological properties of the pathogen of bovine viral diarrhea-mucos-al disease, which used for the manufacture of inactivated vaccines): Extended abstract of candidate's thesis in biol. Science (It is protected 29.04.2008), Vladimir, VNIIZZH, 2008, 25 p.
5. Metody nauchnyh issledovanij v veterinarii (Methods of scientific studies in the veterinary science ), Ed. G.F. Koromyslov, Byulleten Vsesoyuznogo instituta ehksperimentalnoj veterinarii, 1979, Is. 34, 63 p.
6. Nefedchenko A.V., Glotov A.G., Glotova T.I., Kungurceva O.V., Veterinariya, 2011, No. 12, pp. 21-25.
7. Halenev G.A., Loseva T.V., Problemy virusologii, molekulyarnoj biologii igistologii selsko-hozyajstvennyh zhivotnyh, 1983, No. 4, pp. 22-24.
8. Shilova E.N., Ryaposova M.V., Shkuratova A.I., Vyalyh I.V. Veterinariya, 2014, No. 5, pp.19-21.
9. Booth R.E. et al., Veterinary Research, 2013, No. 44, pp. 43-57.
10. Deregt D., Loewen K.G., Can. Vet. J., 1995, Vol. 36 (6), pp. 71-78.
11. Factor C. et al. Veterinary Record Open, 2016, No. 3, e000196. (doi:10.1136/vetreco-2016-000196).
12. Giangaspero M., Harasawa R., J. Virol. Methods., 2014, Vol. 195, pp. 34-53.
13. Giangaspero M., Apicellab C., Harasawa R., J. Virol. Methods., 2013, Vol. 192, pp. 59-67.
14. Giammarioli M. et al., Virus Genes, 2015, No. 50, pp. 147-151.
15. Houe H., Vet. Microbiol., 1999, Vol. 64, pp. 89-107.
16. Jackova A. et al., Vet Res Commun., 2008, No. 32(1), pp. 7-11.
17. Kummerer B.M., Tautz N., Becher P. et al., Veterinary Microbiology, 2000, Vol. 77, pp. 117-128.
18. Luzzago C. et al. Infection, Genetics and Evolution, 2012, No. 12, pp. 324-331.
19. Meyers G., Thiel H-J., Adv Virus Res., 1996, Vol. 47, pp. 53-118.
20. Ridpath J.F., Vet. Clin. North. Am. Food. Anim. Pract,, 2010, No. 26(1), pp. 105-121.
21. Virus Taxonomy: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses/ edit. A.M. King, E. Lefkowitz, M.J. Adams et al., San Diego, Academic Press, 2011, 1327 p.
ABSTRACT
O.V. Semenova, T.I. Glotova, A.G. Glotov, A.V. Nefedchenko.
Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnologies of the Russian Academy of Sciences (Krasnoobsk Novosibirsk region) (630501 Novosibirsk region Novosibirsk district, Krasnoobsk, post office box 463).
Frequency Detection by RT-PCR and BVDV Isolation in Cell Culture in Siberia. Virus of bovine viral diarrhea — mucosal disease (BVDV) belongs to the genus Pestivirus within the family Flaviviridae. It is represented by two genetic types — BVDV-1 and BVDV-2, and two phenotypes — cytopathic and noncytopathic [21]. According to some researchers, there are at least 21 subtypes BVDV-1 [9, 11, 14, 16, 18] and 4 subtypes BVDV-2 (2a ... 2d).The urgency of the virus isolation is dictated by the fragmentary information in Russian literature of such scientific data. In addition, the described isolates are related mainly to the cytopathic biotype, which is a dead-end branch of the pathogen evolution.
Purpose. To study the frequency of detection of BVDV in cattle of Siberia and to characterize the virus isolation in bovine testicle primary cell culture (TB).
Materials and methods. The work was performed in 2007-2015 in dairy complexes of Siberia, where it is not carried out specific prevention of BVDV. 1275 biomaterial samples were examined by RT-PCR for presence of the virus genome. For BVDV isolation were used biomaterial samples are positive in RT-PCR and bovine testicle primary cell culture (TB).
Conclusion. The detection rate of the virus in samples of biological material was 52.3%. Obtained 25 BVDV virus isolates (among them: cytopathic are 7, noncytopathic are 18) with typical antigenic properties for representatives of the genus Pestivirus. They have been isolated from samples of biological material from animals mainly with respiratory and genital forms, as well as persistently infected animals. The best way the virus replicated and accumulated in the TB primary cell culture, in which of the 3 ... 5th passage the virus titer was 5.25 ... 6.75 lg TCD50/ml. After adaptation of continuous cell lines cytopathic and noncytopathic agents accumulated at the titer 4.5 ... 6.5 lg TCD50/ml in the 5th passage in the culture of calf coronary vessels (KST) and at the titer 3.25...4.5 lg TCD50/ml in the culture of bovine kidney cells (MDBK).
Keywords: bovine viral diarrhea-mucosal disease virus, cattle, virus isolations, cytopathic and noncytopathic strains.
