CC BY
172016, т. 6, №4
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
УДК 615.811.1:612.128616-005.4:577.11/12:616-092.4
Харченко В. З., Кубышкин А. В., Анисимова Л. В., Жукова А. А., Бекетов А. А., Писарев А. А., Боровская А. И., Рогозенко О. А.
ПРОТЕОЛИЗ И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕПЕРФУЗИОННОГО СИНДРОМА НА ФОНЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И КРОВОПОТЕРИ
Кафедра общей и клинической патофизиологии Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295006, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия.
Для корреспонденции: Анисимова Людмила Васильевна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей и клинической патофизиологии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского, E-mail: anisanislv@mail.ru
For correspondence: Lyudmila V. Anisimova, PhD. PhD of the Depatment of general and clinical pathophysiology, Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, E-mail: anisanislv@mail.ru
INFORMATION ABOUT AUTHORS
Anisimova L.V., http://orcid.org/0000-0001-9412-5071 Kubyshkin A.V., http://orcid.org/0000-0002-1309-4005
РЕЗЮМЕ
Экспериментальные исследования, проведенные на 56 белых крысах линии «Vistar» выявили, что при моделировании реперфузионного синдрома, РС, осложненного кровопотерей и комбинированного радиационно-реперфузионного поражения происходит снижение активности ингибиторов протеиназ и антиоксидантных ферментов, что свидетельствуют о ведущей роли процессов свободнорадикального окисления и активации протеолиза в патогенезе реперфузионного синдрома, РС, осложненного кровопотерей и РС, отягощенного воздействием ионизирующего излучения, как одного из важных механизмов формирования полиорганной недостаточности.
Ключевые слова: реперфузионный синдром, протеиназ-ингибиторная система, свободно-радикальное окисление, полиорганная недостаточность.
SUMMARY
PROTEOLYSIS AND FREE RADICAL OXIDATION IN THE PATHOGENESIS OF REPERFUSION SYNDROME ON THE BACKGROUND OF IONIZING RADIATION AND BLOOD LOSS
Kharchenko V. Z., Kubyshkin A. V., Anisimova L. V., Zhukova A. A., Beketov A. A., Pisarev A. A., Borovskaia A.I., Rogozenko O. A.
Experimental study conducted on 56 white rats of Vistar lineage revealed that development of reperfusion syndrome (RS) complicated by blood loss and action of ionizing radiation is accompanied by decrease in activity of proteinase inhibitors and antioxidant enzymes. Received data testify that processes of free radical oxidation and activation of proteolysis play the major role in pathogenesis of the RS complicated with blood loss and ionizing radiation injury as one of the causative mechanisms of multi organ failure development.
Key words: reperfusion syndrome, proteinase inhibitory system, free radical oxidation, multi organ failure.
Опасность развития техногенных катастроф на предприятиях атомной энергетики и их последствия вызывает повышение интереса к изучению комбинированных поражений, которые могут развиться. Пострадавшие при таких катастрофах, зачастую длительное время находятся под завалами, что в последующем приводит к развитию реперфузионного синдрома (РС) и шоковых состояний, которые могут сопровождаться кровопотерей, а также и воздействием ионизирующего излучения, которые в последствии приводят к необратимым изменениям в организме и развитию синдрома полиорганной недостаточности (СПОН) [1]. В основе патогенеза реперфузионных нарушений лежит процесс поступления накопившихся в ранее ише-
мизированных тканях биологически-активных веществ (БАВ) в системный кровоток, что собственно и приводит к формированию тяжелых осложнений, которые в итоге приведут к СПОН. В результате поступления БАВ из ранее ишеми-зированной ткани в системный кровоток происходит чрезмерная активация процессов про-теолиза и процессов свободно-радикального окисления (СРО) [2-4]. Кроме этого воздействие на организм ионизирующего излучения также приводит активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [5,6]. В свою очередь острая кровопотеря нарушает кислородтран-спортную функцию крови, уменьшая при этом поступление кислорода в ткани, что приводит к гипоксическому повреждению клеток и по-
ступлению в кровь эндогенных токсинов. При нарушении проницаемости лизосомальных мембран происходит высвобождение проте-олитических ферментов в кровь, вызывая нарушение протеиназ-ингибиторного баланса и неконтролируемый генерализованный протео-лиз [2,6,7]. Однако, до последнего времени роль активации протеолиза и свободно-радикального окисления в патогенезе реперфузионного синдрома, осложненного кровопотерей и комбинированного радиационно-реперфузионного поражения остаются недостаточно изученными.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследования были проведены на 56 белых крысах линии «Vistar» (массой 180-200 граммов). Экспериментальное действие ионизирующего излучения осуществляли путем воздействия на животных однократного тотального облучения с использованием гамма-терапевтического аппарата «АГАТ-Р1» (60Со) на базе отделения радиологии КРУ и КБ им. Н.А. Семашко при следующих условиях: доза 6 Гр, поле 24х24, РИК=90 см, глубина=3 см (89,6%), Р=1,155 сГр/с, длительность экспозиции 580 с. Во время облучения животные находились в изготовленных клетках-фиксаторах из органического стекла с отверстиями для свободного поступления воздуха.
Острую кровопотерю вызывали с помощью забора крови из хвостовой вены из расчета 10 % от ОЦК. Непосредственно после острой кровопотери формировали ишемию, путем наложения резиновых жгутов на уровне паховой складки на обе задние конечности сроком 6 часов под легким эфирным наркозом с последующей реваскуляризаци-ей ранее ишемизированных конечностей.
Забор биологического материала производили через 12 часов после снятия жгутов. Кровь для исследований получали путем де-капитации наркотизированных крыс. Экспериментальные исследования проводились в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях» (Strasburg, 18.03.1986).
Исследуемые животные были разделены на 5 групп: I группа - контрольная, интакт-ные животные (n=12), II группа - ишемия 6ч, без реперфузии, (n=10), III группа - РС 12ч, (n=12), IV группа - РС 12ч, осложненный кро-вопотерей (n=12), V группа - РС 12ч, осложненный ионизирующим излучением (n=10).
Для оценки степени метаболических нарушений определяли следующие показатели про-теиназ-ингибиторной и окислительно-антиок-сидантной систем. Активность протеиназ и их
ингибиторов исследовали с использованием энзиматических методов [8]. Эластазоподобую активность (ЭПА) определяли по скорости ферментативного гидролиза синтетического субстрата N-т-бок-Ь-аланил-п-нитрофенилового зфира (БАНФЭ), трипсиноподобную активность (ТПА) по скорости отщепления бензоил-аргинина от N-a-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира (БАЭЭ), антитриптическую активность (АТА) и кислотостабильные ингибиторы (КСИ) по торможению биологическим материалом ферментативного гидролиза трипсином БАЭЭ.
Уровень ТБК активных продуктов (ТБК-АП) в крови оценивали по реакции с тиобарбиту-ровой кислотой в присутствие ионов Fe3+, что характеризовало уровень вторичных активных продуктов ПОЛ [9]. Каталазоподобную активность (КПА) оценивали по остаточному количеству перекиси водорода в реакции с солями молибдена [10]. Пероксидазоподобную активность (ППА) определяли по степени торможения окисления индиготетрасульфоната калия пероксидазой сыворотки крови в присутствии перекиси водорода [11]. Уровень церулоплазмина (ЦП) выявляли по степени расщепления р-фенилендиамина при его инкубации с сывороткой крови [11]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) выявляли по степени ингибирования нитросинего тетразо-лия до гидразинтетразолия, при конкурировании супероксиддисмутазы с нитросиним-тетразолием за супероксидные анионы [12].
Статистическая обработка полученных данных проведена с применением методов вариационной статистики с вычислением средних величин (M), оценкой вероятности расхождений (m), оценкой достоверности изменений с использованием t-критерия Стьюдента. За достоверную принималась разность средних значений при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе проведенных исследований было выявлено, что у животных, которым моделировалась ишемия, происходило снижение по сравнению с контрольной группой уровня ТПА на 29,7 %, а ЭПА практически не изменялась. При этом у крыс данной группы было выявлено незначительное увеличение уровня АТА на фоне выраженного снижения уровня КСИ на 62,3 % по сравнению с интактными животными (табл.1). В то же время исследование прооксидантно-ок-сидантной системы у крыс с моделью ишемии была выявлена тенденция к росту ТБК-АП, которая сопровождалась незначительным снижением уровня ЦП на 15,0%, и увеличением количества остальных антиоксидантных ферментов:
2016, т. 6, №4
крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины
КПА на 83,8%, ППА на 74,3%, СОД на 86,0% по сравнению с интактными животными (табл.2).
У животных с моделью РС наблюдалось увеличение активности трипсиноподобных проте-иназ на фоне снижения количества АТА и КСИ в зависимости от вида повреждающего фактора. Так у животных с моделью РС, осложненного кровопотерей наблюдалось повышение ТПА на
67,5 % и снижение уровня а1-ингибитора про-теиназ на 64,9 %, а КСИ - на 49,2 % по сравнению с контрольной группой. Самый высокий уровень ТПА был выявлен при комбинированном радиационно-реперфузионном поражении, при этом ТПА выросла на 108,1% по сравнению с интактными животными, а уровень а-1-ИП снизился на 22,7 %, количество КСИ на 71,32 %.
Таблица 1
Изменения протеиназ-ингибиторной системы крови при реперфузионном синдроме, осложненном кровопотерей и ионизирующим излучением через 12 часов после реваскуляризации тканей
Группа Показатели
ТПА Мк/Мл*мин ЭПА МкМ/ мл*мин АТА ИЕ/мл*мин КСИ ИЕ/мл*мин
I группа 0,37ст±0,05 2,48s±0,15 39,3s±2,54 11,4s±0,14
II группа 0,26s±0,01* 2,02s±0,19 44,1s±1,47 4,3s±0,69*
III группа 0,56s±0,05* 0,89s±0,03* 22,4s±1,98* 3,03s±0,50*
IV группа 0,62s±0,07* 1,78s±0,09* 13,8s±1,53* 5,8s±0,33*
V группа 0,77±0,07* 0,81±0,0*5 30,35±2,24* 3,27±0,17*
Примечание: *p<0,05, по сравнению с группой контроля
У экспериментальных животных с моделями реперфузионнгого сиднома, РС, осложненного кровопотерей и комбинированным радиационно-реперфузионным поражением происходило увеличение содержания ТБК-АП, которое сопровождалось снижением уровня как сывороточных антиоксидантов (церуло-плазмин), так и внутриклеточных антиокси-
дантных ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза). В ходе исследований был отмечен выраженный рост относительно контроля содержания ТБК-АП у животных с РС, осложненным кровопотерей, и составил 91,7%. Также в данной группе происходило снижение ППА на 42,8%, СОД - на 63,5%, а ЦП - на 57,1% по сравнению с контролем.
Таблица 2
Изменения окислительно-антиоксидантной системы крови при реперфузионном синдроме, осложненном кровопотерей и ионизирующим излучением через 12 часов после реваскуляризации тканей
Группа Показатели
ТБК-АП нМ МДА/мл ЦП мг/л КПА мМ/gHb. ППА мМ/gHb СОД Ед/мг*Hb
I группа 88,6s±18,89 208,6±17,17 0,31±0,03 6,12±0,31 131,5±5,18
II группа 98,6 s±8,40 172,2±17,40* 0,57±0,04* 10,67±0,44* 244,7±21,69*
III группа 160,2±10,12* 110,1±5,21* 0,37±0,05 3,32±0,10* 62,5±3,22*
IV группа 169,8±7,32* 89,4±1,62* 0,23±0,02* 2,72±0,28* 47,9±7,09*
V группа 182,93±5,91* 94,41±9,25* 0,34±0,05 1,63±0,11* 39,03±7,73*
Примечание: *p<0,05, по сравнению с группой контроля
Самая высокая концентрация ТБК-АП в сыворотке крови была зафиксирована у крыс с комбинированным радиационно-реперфузи-онным поражением. Так, ТБК-АП в сыворотке крови животных данной группы были на 106,47 % выше показателя интактной группы. Кроме того в этой группе было выявлено сни-
жение концентрации ЦП на 54,74 %, выраженное падение уровня СОД на 73,3 % и ППА на 73,4 % по сравнению с интактными животными.
Таким образом, в ходе проведенных исследований было выявлено, что при ишемии задних конечностей крыс происходит повышение анти-триптической и снижение трипсиноподобной
активностей сыворотки крови. По-видимому, такое изменение протеолитической активности вызвано активацией антипротеазной системы, что является отражением «острофазной» реакции организма и носит защитный характер. На что указывает и рост активности антиоксидант-ных ферментов крови на фоне незначительного увеличения уровня ТБК-АП сыворотки крови.
Моделирование реперфузионного синдрома, РС, осложненного кровопотерей и комбинированного радиационно-реперфузионного поражения вызвало выраженный рост активности неспецифических протеиназ в сыворотке крови, который сопровождался снижением их ингибиторов. Причем наиболее выраженное увеличение ТПА на фоне снижение уровня их ингибиторов было выявлено при моделировании комбинированного радиационно-реперфу-зионного поражения, что отражает силу воздействия повреждающих факторов, состояние защитных сил организма. Также моделирование реперфузионного синдрома, РС, осложненного кровопотерей и комбинированного радиаци-онно-реперфузионного поражения приводит к значительному росту содержания вторичных продуктов ПОЛ на фоне снижения активности всех звеньев антиоксидантной защиты. Снижение активности ингибиторов протеиназ и анти-оксидантных ферментов указывает на истощение компенсаторных возможностей организма, при воздействии повреждающего фактора высокой интенсивности. Данные, полученные в ходе экспериментальных исследований, свидетельствуют о ведущей роли процессов сво-боднорадикального окисления и активации протеолиза в патогенезе реперфузионного синдрома, РС, осложненного кровопотерей и РС, отягощенного воздействием ионизирующего излучения, как одного из важных механизмов формирования полиорганной недостаточности.
ВЫВОДЫ
1. Моделирование реперфузионного синдрома вызывает активацию протеолиза и пере-кисного окисления липидов, что приводит к дисбалансу протеиназ-ингибиторной, проок-сидантно-антиоксидантной систем и к снижению компенсаторных возможностей организма и развитию полиорганной недостаточности.
2. Кровопотеря и воздействие ионизирующего излучения на фоне реперфузи-онного синдрома усугубляет его течение, и проявляется более выраженным, чем при изолированном реперфузионном синдроме дисбалансом протеиназ-ингибиторной и прооксидантно-антиоксидантной систем.
3. Определение показателей пртеиназ-ин-гибиторной и окислительно-антиоксидантной систем при комбинированном реперфузион-ном воздействии с ионизирующем излучением и/ или кровопотерей может использоваться в качестве эффективного диагностически-прогностического маркера формирования синдрома полиорганной недостаточности.
Работа выполнена при поддержке Минобрна-уки РФ в рамках базовой части государственного задания по проекту № 3884 и проекта сети академической мобильности РНИЭМ в рамках взаимодействия с Сибирским государственным медицинским университетом (г.Томск).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Анисимова Л.В. Роль активации неспецифических протеиназ сыворотки крови в формировании синдрома полиорганной недостаточности. Вестник неотложной и восстановительной медицины.2013;14(2):193-195.
2. Анисимова Л.В., Кубышкин А.В. Неспецифические протеиназы и их ингибиторы при синдроме острого повреждения легких в эксперименте. Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2014; 15(2): 9-12.
3. Неронова Е.Г. Алексанин С.С. Оценка цитоге-нетических показателей у лиц, контактировавших с ионизирующими излучениями. Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях.2014; (1):70-76.
4. Makam P. BTK Stenting in Critical Limb Ischemia. Endovascular Today.2010;69-72.
5. Гурьянова В.А. Тарасова Н.Б. Перекисное окисление липидов при поражении печени ионизирующей радиацией. Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2013; 213:76-80.
6. Баврина А. П., Монич В. А., Ермолаев В. С., Дружинин Е. А., Лютов С. И. Фотомодификация свобод-норадикального окисления в мягких тканях крыс после воздействия ионизирующей радиации. Вестник новых медицинских технологий. 2012;19 (3):173-174.
7. Храмых Т.П., Долгих В.Т. К вопросу о эндоток-семии при геморрагической гипотензии. Патологическая физиология и экспериментальная терапия.2009;. (1):28-30.
8. Кубышкин А.В., Фомочкина И.И. Эластолитиче-ская активность бронхоальвеолярного лаважа при моделировании воспалительного процесса в легких. Укр. б^м. Журн. 2008; 80. (1): 89-95.
9. Гаврилов В.Б., Мешкорудая М.И. Спектрофото-метрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови.1983; (3):33-36.
10. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Б. Метод определения активности каталазы. Лабораторное дело.1988; (1):16-19.
2016, т. 6, №4
крымский журнал экспериментальной и клинической медицины
11. Попов Т., Нейковская Л. Метод определения пероксидазной активности крови. Гигиена и санитария. 1971; (10):89-91.
12. Дубинина Е.Е., Сальникова Л.А., Ефимова Л.Ф. Активность и изоферментный спектр супероксиддисму-тазы эритроцитов и плазмы крови человека. Лабораторное дело.1983; (10): 30-33.
REFERENCES
1. Anisimiva L.V. The role of the activation nonspecific serum proteases in forming of multiple organ dysfunction syndrome. Bulletin of Urgent and Recovery Medicine.2013;14(2):193-195. (In Russ).
2. Anisimova L.V., Kubyshkin A.V. Nonspecific proteases and their inhibitors in acute lung injury in experiment. Bulletin of Urgent and Recovery Medicine. 2014; 15(2): 9-12. (In Russ).
3. Neronova E.G., Alexanin S.S. Assessment of cytogenetic indices in persons exposed to ionizing radiation. Medico-Biological and Socio-Psychological Problems of Safety in Emergency Situations.2014; (1):70-76. (In Russ).
4. Makam P. BTK Stenting in Critical Limb Ischemia. Endovascular Today. 2010; P.69-72.
5. Guryanova V.A., Tarasova N.B. Lipid peroxygenation at liver injury by ionizing radiation. Scientific notes of Kazan Bauman State Academy of Veterinary Medicine. 2013; 213:76-80. (In Russ).
6. Bavrina A.P., Monich V.A., Yermolaev V.S., Druzhinin YE.A., Lyutov S.I. Photomodification of free radical oxidation in soft tissues of rats after the effect of ionizing radiation . Journal of New Medical Technologies. 2012;19 (3):173-174. (In Russ).
7. Khramykh T.P., Dolgikh V.T. Endotoxemia in hemorrhagic hypotension. Pathological physiology and experimental eherapy 2009; (1):28-30. (In Russ).
8. Kubyshkin A.V., Fomochkina I.I. Elastolytic activity in bronchoalveolar lavage fluid in acute lung inflammatory injury. The Ukrainian Biochemical Journal. 2008; 80. (1): 8995. (In Russ).
9. Gavrilov V.B. Meshkorudaya M.I. Spektrofotometricheskoe opredelenie soderzhaniya gidroperekisej lipidov v plazme krovi. 1983; (3):33-36. (In Russ).
10. Korolyuk M.A., Ivanova L.I., Majorova I.B. The method for determining the activity of catalase. Laboratory work. 1988; (1):16-19. (In Russ).
11. Popov T., Nejkovskaya L. Method of determining the peroxidase activity of blood. Hygiene and sanitation.1971; (10):89-91. (In Russ).
12. Dubinina E.E., Salnikova L.A., Efimova L.F. The activity and isoenzyme spectrum of superoxiddismutase of erythrocyte and human plasma. Laboratory work .1983; (10): 30-33. (In Russ).
