CC BY
17УДК 616-005.1-008.6:577.15:612-092.11.9
НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ИХ ИНГИБИТОРЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ РАЗВИТИЯ РЕПЕРФУЗИОННОГО СИНДРОМА, ОСЛОЖНЕННОГО КРОВОПОТЕРЕЙ
Жукова А. А.1, Харченко В. З.2, Бекетов А. А.3, Кубышкин А. В.2
1 Кафедра биологии медицинской
2 Кафедра общей и клинической патофизиологии
3 Кафедра патологической анатомии с секционным курсом, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Жукова Анна Александровна, кандидат биологических наук, ассистент кафедры биологии Медицинской академии имени С. И. Георгиевского, е-mail: anna_crimea09@mail.ru
For correspondence: Anna A. Zhukova, PhD, Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, E-mail: anna_crimea09@ mail.ru
Information about authors:
Zhukova A. A., http: // orcid.org./ 0000-0002-0725-2089 Kharchenko V. Z., http: // orcid.org/0000-0001-6607-1141 Beketov A. А., http://orcid.org 0000-0002-0369-5165 Kubyshkin A. V., http: // orcid.org./0000-0002-1309-4005
РЕЗЮМЕ
Экспериментальные исследования были проведены на 58 крысах линии «Wistar». Было выявлено, что развитие реперфузионного синдрома сопровождалось активацией протеолиза и снижением активности ингибиторов протеолиза. Развитие осложненного реперфузионного синдрома сопровождалось развитием более выраженного дисбаланса протеиназ-ингибиторной системы и увеличением летальности подопытных крыс
Ключевые слова: реперфузионный синдром, кровопотеря, протеиназы, ингибиторы протеиназ.
PATHOGENETIC THERAPY OF REPERFUSION SYNDROME COMPLICATED WITH BLOOD LOSS BY ANTIOXIDANTS AND PROTEASE INHIBITORS
Zhukova A. A., Kharchenko V. Z., Beketov A. A., Kubyshkin A. V.
Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
Experimental researches were performed with 58 Wistar rats. The development of reperfusion injury was accompanied by activation of proteolysis and a falling of the proteolysis inhibitors activity was found. The development of a complicated reperfusion injury was accompanied by the development of a more pronounced imbalance in the proteinase inhibitor system and causes rise of the lethality of the experimental rats.
Keywords: reperfusion injury, proteolytic enzymes, blood loss, protease inhibitors.
Изучение механизмов развития реперфузио-ного синдрома ^^ в настоящее время является одной из важных проблем современной медицины. На актуальность изучения постишемических расстройств указывают тяжелые последствия землетрясений, аварий в шахтах и на транспорте, которые ежегодно приводят к гибели большого количества людей. Восстановление кровотока в ранее ишемизированных тканях приводит к их дополнительному повреждению, которое происходит в результате образования большого количества активных форм кислорода. Супероксиды повреждают липиды мембран клеток, а также внутриклеточные органеллы, что приводит к их гибели. При этом увеличиваются адгезия, агрегация тромбоцитов и лейкоцитов, секреция мощных медиаторов (лейко-триенов, фактора активации тромбоцитов и др.),
которые повышают капиллярную проницаемость. Повреждение эндотелия биологически активными веществами ведет к значительной редукции микро-циркуляторного кровотока и прогрессированию тканевой ишемии [1, 2, 3]. Данные процессы приводят к нарушению проницаемости цитоплазматиче-ских мембран, высвобождению протеолитических ферментов и системной активации протеолиза. Активация клеточных протеаз, как правило, происходит на фоне изменения состояния их эндогенных ингибиторов с изменением протеиназ-инги-биторного баланса, что является важным патогенетическим звеном в развитии воспалительных и деструктивных процессов в организме [4, 5, 6, 7, 8].
Острая кровопотеря является фактором, который усугубляет течение и прогноз РС. Так, при острой кровопотере происходит нарушение кис-
2017, том 20, №3
лородтранспортной функции крови, что вызывает уменьшение поступления кислорода в ткани, приводя к их гипоксии и ишемии. В дальнейшем происходит увеличение образования свободных радикалов, повреждающих компоненты клеточных мембран, способствуя при этом активации проте-олиза [9, 10].
Однако состояние протеиназ-игибиторной системы в патогенезе развития реперфузионного синдрома, осложненного кровопотерей, остается малоизученной проблемой. В связи с этим целью нашей работы явилось установление роли протеи-наз и их ингибиторов в патогенезе реперфузионно-го синдрома, осложненного кровопотерей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для экспериментов было использовано 58 белых крыс линии «Ш1з1аг» (массой 180-200 граммов). Острую кровопотерю вызывали с помощью забора крови из хвостовой вены из расчета 10 % от ОЦК. Непосредственно после острой крово-потери формировали ишемию, путем наложения резиновых жгутов на уровне паховой складки на задние конечности сроком 6 часов под легким эфирным наркозом. РС моделировали путем ре-васкуляризации ранее ишемизированных тканей. Забор биологического материала производили через 6, 12 часов после реваскуляризации конечностей. Кровь для исследований получали путем декапитации наркотизированных крыс. Содержание, обезболивание и умерщвление животных соответствовали принципам Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Ис-
Выживаемость и летальность крыс в эксперимен
следуемые животные были разделены на 5 групп: I группа - контрольная, интактные животные (n=12), II группа - РС 6 ч, (n=12), III группа - РС 6 ч, осложненный кровопотерей (n=12), IV группа - РС 12 ч, (n=12), V группа - РС 12 ч, осложненный кровопотерей (n=10).
В ходе экспериментальных исследований были изучены показатели летальности подопытных крыс в разных экспериментальных группах.
Состояние протеиназ-ингибиторной системы оценивали с использованием энзиматических методов [11]. Эластазоподобую активность (ЭПА) определяли по скорости ферментативного гидролиза синтетического субстрата N-т-бок-Ь-аланил-п-нитрофениловогозфира (BANFE), трипсинопо-добную активность (ТПА) - по скорости отщепления бензоил-аргинина от N-a-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира (BAEE), антитриптическую активность (АТА) и кислотостабильные ингибиторы (КСИ) - по торможению биологическим материалом ферментативного гидролиза трипсином BAEE.
Все полученные результаты исследований подвергали статистической обработке методами вариационной статистики с использованием критерия достоверности Стьюдента, и достоверными считали различия показателей при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании выживаемости и летальности крыс на разных этапах эксперимента было выявлено, что во II экспериментальной группе произошла гибель 17,0 % процентов животных в течение 6 часов после реваскуляризации (табл. 1).
Таблица 1
льных группах без медикаментозной коррекции
Срок Общее количество Выживаемость Летальность
абс. отн. % абс. отн. %
Контроль 12 12 100 - 0
РС 6ч 12 10 83 2 17
РС 6с+кровопотеря 12 9 75 3 25
РС 12ч 12 10 83 2 17
РС 12с+кровопотеря 12 8 66 4 34
В группе животных с развитием РС продолжительностью 6 часов на фоне кровопотери было отмечено увеличение летальности, которая составила 25,0 %.
Увеличение длительности реперфузионного периода сопровождалось увеличением летальности среди экспериментальных животных. Так, при развитии РС и РС, осложненного кровопотерей,
через 12 часов после снятия жгутов летальность составила, соответственно, 17,0 % и 34,0 %, что свидетельствует о более тяжелом протекании РС, осложненного кровопотерей.
При исследовании протеиназ-ингибиторной системы сыворотки крови было выявлено, что через 6 часов после реваскуляризации задних конечностей крыс происходило незначительное
увеличение ТПА по сравнению со значениями здоровых животных. В группе с РС аналогичной продолжительности, осложненном кровопотерей, происходило более выраженное увеличение уров-
Динамика изменений протеиназ-ингибиторной
ня данного показателя: на 75,7 % по сравнению с аналогичным показателем группы здоровых животных и на 41,3 % по сравнению с показателем группы с развитием РС (табл. 2).
Таблица 2
стемы при РС и РС, осложненном кровопотерей
Группы животных Показатели
ТПА МкМ/ Мл*мин. ЭПА МкМ/ мл*мин. АТА ИЕ/мл*мин. КСИ ИЕ/мл*мин.
Контроль 0,37±0,05 2,48±0,15 39,26±2,5 11,42±0,14
Реперфузионный синдром, 6 часов 0,46±0,04 0,93±0,07*** 23,67±1,13* 5,04±0,32*
РС, осложненный кровопотерей, 6 часов 0,65±0,06* 1,64±0,1* 25,54±1,03* 3,24±0,3***
Реперфузионный синдром, 12часов 0,56±0,05* 0,89±0,03*** 22,4±1,98*** 3,03±0,50***
РС, осложненный кровопотерей, 12часов 0,62±0,07* 1,78±0,09* 13,8±1,53* 5,8±0,33*
Примечания: Звездочками показана достоверность различий (Р): * - по отношению к контролю (Р<0,05); ** - по отношению к группе с реперфузионным синдромом, осложненным кровопотерей (Р<0,05).
Увеличение продолжительности постишемиче-ского периода сопровождалось более выраженным ростом уровня ТПА сыворотки крови. Так, при моделировании РС продолжительностью 12 часов происходило увеличение ТПА на 51,3 % по сравнению со значениями здоровых животных. При комбинированном РС уровень ТПА был на 67,5% выше по сравнению с группой интактных крыс.
При этом моделирование РС через 6 ч. и 12 ч. после снятия жгутов сопровождалось падением уровня ЭПА в сыворотке крови по сравнению со здоровыми животными. Так, развитие РС продолжительностью 6 часов вызвало падение уровня ЭПА в сыворотке крови на 62,5 % по сравнению с группой здоровых животных. При аналогичном РС, осложненном кровопотерей, происходило менее выраженное снижение уровня ЭПА, которое было на 33,9 % ниже показателей интактных животных и на 76,3 % выше значений группы крыс с моделью изолированного РС.
Через 12 часов после реваскуляризации конечностей уровень ЭПА упал на 64,1 % по сравнению со значениями здоровых животных. При РС, осложненном кровопотерей, ЭПА снизилась на 28,2 % по сравнению со значениями здоровых животных и выросла в 2 раза по сравнению с показателями группы крыс с развитием изолированного РС.
При моделировании РС продолжительностью 6 часов также было выявлено падение уровня АТА на 39,7 % по сравнению с показателями здоровых
животных. Развитие РС, осложненного кровопо-терей, сопровождалось увеличением АТА на 34,9 % по сравнению с показателями интактных крыс. Дальнейшее увеличение постишемического периода вызвало выраженное снижение АТА в сыворотке крови крыс. Причем наибольшее падение уровня АТА было отмечено при развитии комбинированного поражения, данный показатель оказался на 64,9 % ниже аналогичного показателя здоровых крыс и на 38,7 % ниже показателей группы с изолированным реперфузионным синдромом.
При моделировании 12-часового РС и РС, осложненного кровопотерей, было отмечено снижение уровня КСИ в сыворотке крови крыс. При этом самые низкие показатели зафиксированы в группе с 12-часовым РС и были на 73,5 % ниже показателей интактных животных.
Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что развитие реперфузионно-го синдрома сопровождалось увеличением уровня трипсиноподобной активности на фоне снижения антитриптической активности и уровня кислото-стабильных ингибиторов. Активация протеолиза на фоне снижения уровней ингибиторов протеи-наз является одним из механизмов повреждения клеток и тканей при развитии реперфузионного синдрома. Также соотношение активности про-теиназ и их ингибиторов указывает на состояние защитных сил организма и может использоваться в качестве прогностического признака. Острая
2017, том 20, №3
кровопотеря вызывает развитие ишемических и гипоксических процессов в организме, которые сопровождаются активацией перекисного окисления липидов с последующим повреждением клеточных мембран и высвобождением протеолитических ферментов, таким образом утяжеляя течение ре-перфузионного синдрома. Моделирование репер-фузионного синдрома, осложненного кровопотерей, вызвало развитие более выраженного дисбаланса протеиназ-ингибиторной системы, а следовательно, более выраженное проявление деструктивного потенциала протеолитических ферментов, что проявилось в повышенной летальности данной группы животных.
ВЫВОДЫ
1. Развитие экспериментального реперфу-зионного синдрома у крыс сопровождается выраженной активацией неспецифических протеиназ в сыворотке крови и снижением уровня их эндогенных ингибиторов.
2. Развитие кровопотери в объеме 10 % ОЦК на фоне реперфузионного синдрома у крыс сопровождается более выраженной активацией про-теиназ и снижением уровня их ингибиторов, что сопровождается более высокой летальностью животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Маршалов Д. В., Петренко А. П., Глушач И. А. Реперфузионный синдром: понятие, определение, классификация. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2008; 3:67-72.
2. Francis A, Baynosa R. Ischaemia-reperfusion injury and hyperbaric oxygen pathways: a review of cellular mechanisms. Diving Hyperb Med. 2017 Jun.;47(2):110-117. Review.
3. Liu Z, Liu Y, Zhou H, Fu X, Hu G.Epoxyeicosatrienoic acid ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting inflammatory factors and pannexin-1 Mol Med Rep. 2017 Jun 21. doi: 10.3892/mmr.2017.6831.
4. Алиханов Р. Б., Кубышкин В. А. Патофизиологические аспекты реперфузионных повреждений печени. Кубанский научный медицинский вестник. 2013; 7: 170-172. Kunder M, Kutty AM, Lakshmaiah V, Sheela SR.
5. Correlation of Plasma Neutrophil Elastase Activity and Endogenous Protease Inhibitor Levels with the Severity of Pre-eclampsia. J Clin Diagn Res. 2017 Mar;11(3):BC09-BC12. doi: 10.7860/ JCDR/2017/24181.9469.
6. Шутов Ю. М., Щедрин А. С., Мезенцев Е. Н Вариантная анатомия патогенеза компартмент-синдрома. Медицина и образование в Сибири. 2015; 1: 42-45.
7. Завалий А. А., Кубышкин А. В., Жукова А. А. Динамика показателей неспецифических про-теиназ и их ингибиторов при лечении больных острым гнойным риносинуситом мукоактивными препаратами. Бюллетень сибирской медицины. 2017. 16 (1):27-35. Doi: 10.205 38/ 1682-0363-20171-27-35.
8. Лаптева Е. А. Состояние системы проте-олиза при хронической обструктивной болезни легких. Журнал Гродненского государственного медицинского университета. 2016; 3 (55): 90-93.
9. Braga D, Barcella M, DAvila F, Lupoli S, Tagliaferri F, Santamaria MH. Et al. Preliminary profiling of blood transcriptome in a rat model of hemorrhagic shock. Exp Biol Med (Maywood). 2017 Jan 1:1535370217717978. doi: 10.1177/1535370217717978.
10. Жукова А. А., Харченко В. З., Кубышкин А. В. и др. Патогенетическое обоснование сочетан-ного применения ингибиторов протеиназ и анти-оксидантов при осложненном реперфузионном синдроме. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2014; .4 (6): 18-21.
11. Кубышкин А. В., Фомочкина И. И. Эласто-литическая активность бронхоальвеолярного лава-жа при моделировании воспалительного процесса в легких. Укр. бiохiм. журн. 2008; 80 (1): 89-95.
REFERENCES
1. Marshalov DV, Petrenko AP, Glushach IA. Reperfusion syndrome: notion, definition, classification Circulation Pathology and Cardiac Surgery 2008, 3:6772 (In Russ)/
2. Francis A, Baynosa R. Ischaemia-reperfusion injury and hyperbaric oxygen pathways: a review of cellular mechanisms. Diving Hyperb Med. 2017 Jun.;47(2):110-117. Review.
3. . Liu Z, Liu Y, Zhou H, Fu X, Hu G.Epoxyeicosatrienoic acid ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting inflammatory factors and pannexin-1 Mol Med Rep. 2017 Jun 21. doi: 10.3892/mmr.2017.6831.
4. Alikhanov RB, Kubyshkin VA. Pathophisiology aspects of reperfusion injury of liver Kubanskii nauchnyi meditsinskii vestnik, 2013,7:170172 (In Russ)
5. Correlation of Plasma Neutrophil Elastase Activity and Endogenous Protease Inhibitor Levels with the Severity of Pre-eclampsia. J Clin Diagn Res. 2017 Mar;11(3):BC09-BC12. doi: 10.7860/ JCDR/2017/24181.9469.
6. Shutov YM, Shchedrin AS, Mezentsev EN. Alternative anatomy of pathogenesis of compartment-syndrome Medicine and Education in Siberia, 2015; 1:45-45. (In Russ)
7. Zavaliy АА., Kubyshkin AV, Zhukova AA Changes in non-specific proteases and their inhibitors
in the course of acute rhinosinusitis treatment with mucoactive drugs Bulletin of Siberian Medicine, 2017; 16(1): 27-35. (In Russ). Doi: 10.205 38/ 1682-03632017-1-27-35
8. Lapteva EA State of proteolysis system in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of the Grodno State Medical University, 2016, 55:90-93. (In Russ)
9. Braga D, Barcella M, D'Avila F, Lupoli S, Tagliaferri F, Santamaria MH. Et al. Preliminary profiling of blood transcriptome in a rat model of hemorrhagic shock. Exp Biol Med (Maywood). 2017 Jan 1:1535370217717978. doi: 10.1177/1535370217717978.
10. Zhukova AA, Kharchenko VZ, Kubyshkin AV et al. Pathogenetic basis of the combined application of proteinase inhibitors and oxidants in complicated reperfusion injury Crimea Journal of Experimental and Clinical Medicine ,2014, 6:18-21. (In Russ).
11. Kubyshkin A.V., Fomochkina I.I Elastoliticheskayaaktivnost' bronkhoal'veolarnogo lavazha pri modelirovanii vospalitel'nogo protsessa v legkikh [Elastolytic activity of bronchoalveolar lavage in modeling of the inflammatory process in lungs]. Ucr. biokhim. zhurnal - Ucrainian Biochemical Journal, 2008; 80 (1): 89-95 (In Rus).
