CC BY
8Порфирины Porphyrins
Макрогэтэроцмклы
http://macroheterocycles.isuct.ru
Статья Paper
Protecting Effect of the Free Base Porphyrin on the Rate of Hydrogen Peroxide Decomposition by Hemolysate of Human Blood Erythrocytes in the Presence of Mercury and Tin Compounds
E. M. Mukhatova,a N. T. Limonova,a M. N. Kolyada,b V. P. Osipova,b N. T. Berberova,b@ Yu. T. Pimenov,a and E. R. Milaevac
aAstrakhan State Technical University, 414025 Astrakhan, Russia; E-mail: [email protected] bSouthern Scientific Centre RAS, 344006 Rostov-on-Don, Russia; E-mail: [email protected]
cM.V. Lomonosov Moscow State University, Chemistry department, 119991 Moscow, Russia; E-mail: [email protected] @Corresponding author E-mail: [email protected]
An influence of meso-tetraphenylporphyrin (TPPH) and its derivatives, i.e. meso-tetrakis(3,5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenyl)porphyrin (RfHJ, meso-tetra(4-sulfonatophenyl)porphine ((HO3S)4TPPH2), in the presence of mercury and tin compounds on the rate of hydrogen peroxide decomposition by hemolysate of laundered human blood erythrocytes was studied. The decrease of the decomposition rate of hydrogen peroxide by erythrocytes in the presence of TPPH2 and mercury (HgCl,, CHflgl, Hg(NO)2H2O) or tin ((CHJ£nCl2, (n-CflJ^nCl, (n-C fl)£n£l2, (C(H,)3SnCl, (CH)SnCl)) compounds was ascertained. (n-C4Hr)3SnCl, which is used as biocidal additive in paints, is the most toxic in this row; the addition of this compound decreases the rate of H2O2 decomposition by 70%. The influence of organotin compounds on the reaction rate depends on the nature of organic group and, in the case of butyl and methyl derivatives, on the quantity of these groups. The influence of addition of the extremely toxic methylmercury salts on the decomposition rate of hydrogen peroxide does not differ from the influence of inorganic mercury salts. The decrease of the H2O2 decomposition rate in the presence of tin and mercury compounds may be connected with inhibition of catalase enzyme. At these conditions, an excess of hydrogen peroxide is formed, what brings to the change of permeability of biomembranes and oxidative stress. When (HO3S)4TPPH2 is added in erythrocytes hemolysate the rate of enzymatic reaction is similar to control one. So an inclusion ofsulfo group on the periphery of porphyrin molecule TPPH2 eliminates the decrease of H2O2 decomposition rate. The UV-vis spectrum of (HO£)4TPPH2 indicates the broadening and a small hypsochromic shift of the Soret band (5 nm) if compared with that of TPPH2. Absorption intensity at the Q-band region (500-600 nm) is also decreased. An addition of R^H2 to erythrocytes hemolysate, containing tin compounds, causes an increase of catalase activity, thus the decrease ofH2O2 decomposition rate by toxicants is eliminated. Maximum efficiency of R^H2 additives was established in the presence of (n-C4H9)2SnCl2. An addition of TPPH2 leads to the further reduce of the rate of H2O2 decomposition by erythrocytes hemolysate in the presence of (CH)3SnCl and (n-C flJ^nCl. The additives of sulfoporphyrin in hemolysate, containing CH3Hgl, (CH3)3SnCl, Hg(NO3)2, HgCl2, results in in creasing ofH2O2 decomposition rate. Water-soluble (HO£)4TPPH2 decreases the negative impact of tin and mercury compounds to the rate of enzymatic reactions. An increase of the rate of hydrogen peroxide decomposition by hemolysate of the laundered human blood erythrocytes, caused by RpH2 in the presence of organotin derivatives, contributes to the antioxidant status of blood erythrocytes in the conditions of the toxicants action.
Keywords: Porphyrins, metalloorganic compounds, mercury, tin, erythrocytes, catalase.
Порфирины Porphyrins
Макрогэтэроцмклы
http://macroheterocycles.isuct.ru
Статья Paper
Протекторное влияние свободных оснований порфиринов на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови человека в присутствии соединений ртути и олова
Е. М. Мухатова,а Н. Т. Лимонова,а М. Н. Коляда,b В. П. Осипова,ь Н. Т. Берберова,ь Ю. Т. Пименов,a Е. Р. Милаевас
аАстраханский государственный технический университет, 414025 Астрахань, Россия; E-mail: [email protected] ьЮжный научный центр РАН, 344006 Ростов-на-Дону, Россия; E-mail: [email protected] Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва, Россия; E-mail: [email protected]
Исследовано влияние свободных оснований порфиринов мезо-тетрафенилпорфирина (TPPH), мезо-тетра(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)порфирина (R4PH), мезо-тетра(4-сульфофенил)порфирина ((HO3S)4TPPH2) на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом отмытых эритроцитов крови человека в присутствии соединений ртути и олова. Показано существенное снижение скорости разложения пероксида водорода в присутствии соединений ртути и олова. Установлено, что добавка (HO3S)4TPPH2 и R4PH2 снижает ингибирующее действие соединений ртути и олова на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом отмытых эритроцитов крови.
Ключевые слова: Порфирины, металлоорганические соединения, ртуть, олово, эритроциты, каталаза.
Введение
Согласно последним исследованиям определенный вклад в токсичность органических производных олова и ртути вносит развитие неконтролируемого окислительного стресса,[1-4] вследствие этого особое значение для резистентности организма к экстремальному воздействию данных соединений приобретает антиоксидантная защитная система. Одной из причин развития окислительного стресса, промотированно-го ртуть- и оловоорганическими соединениями, может быть снижение скорости разложения пероксида водорода.
Целью данной работы явилось изучение влияния свободных оснований порфиринов: мезо-тетра(4-сульфофенил)порфирина ((И0^)4ТРРН2), мезо-тетрафенилпорфирина (ТРРН2) и его производного, содержащего фрагменты стерически затрудненного фенола - мезо-тетракис(3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-фенил)-порфирина ^4РИ 2) на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом отмытых эритроцитов крови человека в присутствии сильных экотоксикан-тов - соединений олова и ртути.
Экспериментальная часть
мезо-Тетра(4-сульфофенил)порфирин ((И038)4ТРРН2), мезо-тетрафенилпорфирин (ТРРИ2) и мезо-тетракис(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)порфирин (Я4РИ2) синтезированы и предоставлены сотрудниками лаборатории биоэле-ментоорганической химии кафедры органической химии
химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова к.х.н. Д.Б. Шпаковским, Ю.А. Грачевой.
Эритроциты из периферической донорской крови выделяли по известному методу.[5] В кровь, обработанную гепарином, добавляли 4 мл физиологического раствора (9% №С1). Смесь перемешивали и центрифугировали при 2500 - 3000 об/мин в течение 5 минут. После оседания эритроцитов на дно верхний слой отсасывали пипеткой. Центрифугирование повторяли 2-3 раза, добавляя каждый раз по 4 мл физиологического раствора. После полного отмывания эритроцитов до образования над ними прозрачной и бесцветной жидкости к осадку добавляли дистиллированную воду в количестве одного объема эритроцитов и 2-3 капли хлороформа для растворения липохромных пигментов. Содержимое пробирки хорошо смешивали встряхиванием в течение минуты. Затем центрифугировали 15-30 минут при 6000-7000 об/мин. Гемолизат отсасывали пипеткой в маленькую пробирку, которую ставили в холодильник.
Активность каталазы определяли спектрофотометриче-ски по скорости разложения пероксида водорода по изменению оптической плотности раствора при длине волны 240 нм в течение 1 мин.[6] В кювету вносили 3 мл 0,05 М калийфосфатного буфера (рН 7,4) и добавляли 7 мкл 30% Н2О2. Начальная концентрация Н2О2 в среде измерения 22,4 мМ. Буферная смесь содержала Ш2ИР04 (1/15 М раствор - 11,876 г/л) + КИ2Р04 (1/15 М раствор - 9,078 г/л); соотношение 1/15 М растворов Ка2ИР04 : КИ2Р04 (в мл) - 8:2.[7] После этого вносили 50 мкл гемолизата эритроцитов, разведенного в 400 раз (уменьшение экстинции находилось в пределах 0,05-0,15).
Порядок добавления реагентов следующий: буфер, пе-роксид водорода, гемолизат, токсикант, порфирин. Концентрация порфиринов и токсикантов 1,6-10-4 моль/л. ТРРИ2 и Я4РИ2 растворяли в спирте, (И038)4ТРРН2 в бидистиллированной воде. Триметилоловохлорид растворяли в бидистиллирован-ной воде, а остальные оловоорганические соединения и соли
ртути HgCl2, CH3HgI, Hg(NO3)2-H2O вносили в среду измерения в виде спиртовых растворов, предварительно показав отсутствие влияния спирта.
Соединения ртути (HgCl2, CH3HgI, Hg(NO3)2-H2O) и олова ((CH3)3SnCl, (CH3)2SnCl2, (n-C4H9)3SnCl, (w-C4H 9)2SnCl2, (C6H5)3SnCl и (C6H5)2SnCl2) (Fluka) использовали без дополнительной очистки.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета статистических программ "Microsoft Excel".
Результаты и их обсуждение
Известно, что пероксид водорода, постоянно образующийся в живых организмах в процессе биологического окисления, является наиболее стабильной активированной формой кислорода, которая способна проникать через клеточные мембраны и вступать в реакции с удаленными от места ее синтеза клеточными компонен-тами.[8] В некоторых случаях Н2О2 является важным ин-термедиатом протекающих реакций,[9] однако, при разложении с участием ионов металлов[10] образуется реакци-онноспособный гидроксильный радикал О№, который может разрывать любую С-Н или С-С связь. Разложение пероксида водорода антиоксидантными ферментами -каталазой и пероксидазой эритроцитов крови защищает красные клетки крови от повреждающего действия данного соединения, в том числе препятствует окислению гемоглобина крови.[11]
В данном исследовании показано, что скорость фоновой реакции разложения пероксида водорода в среде измерения (0,05 М калийфосфатный буфер (рН 7,4)) при температуре 25оС, составляет 10% скорости ферментативной реакции. Результаты опытов по влиянию соединений ртути и олова на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови свидетельствуют о снижении скорости данной реакции при добавлении всех токсикантов (Рисунок 1).
Рисунок 1. Влияние соединений ртути и олова на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови: 1 - (СИ3)^пС1; 2 - (СИ3)28па2; 3 - («-^^01; 4 -(и-^ИДБпа^ 5 - (С6И5)^пС1; 6 - 7 - СИДО;
8 - Щ(Ы03)2-И20; 9 - ^С12. (скорость разложения Н2О2 в контроле принята за 100%).
В соответствии со степенью снижения скорости данной ферментативной реакции исследованные
соединения можно расположить в следующий ряд активности:
(w-C4H9)3SnCl > (w-C4H9)2SnCl2 > HgCl2 > CH3HgI > (CH3)3SnCl > Hg(NO3)2-H2O > (CH3)2SnCl2 > (C6H5)3SnCl
> (C6H 5)2SnCl2
Нами обнаружено значительное снижение скорости разложения Н2О2 гемолизатом эритроцитов крови под действием исследованных органических бутильных производных олова. Наиболее токсичным в этом ряду оказался трибутилоловохлорид, который используется в качестве биоцидных добавок в краски для предотвращения обрастания судна микроорганизмами,[12] добавка этого соединения на 70% снижает скорость разложения Н2О2. Данное металлоорганическое соединение относят к самым токсичным ксенобиотикам, поступающим в природные воды.[13] Уменьшение активности каталазы эритроцитов крови рыб при действии (w-C4H9)3SnCl раннее установлено в опытах по выращиванию годовиков стерляди, при добавлении в корм органических производных олова.[14] Подавление активности данного анти-оксидантного фермента сопровождалось возрастанием интенсивности пероксидного окисления липидов в печени, при этом наблюдалось угнетение роста молоди и снижение ее выживаемости.
Влияние оловоорганических соединений на скорость данной реакции определяется природой органической группы, а также, в случае бутильных и метильных производных, количеством этих групп. Если для диза-мещенных бутильных и метильных производных олова скорость процесса снижается на 59% и 45,8%, то в случае тризамещенных на 70% и 50%, соответственно, фе-нильные производные олова снижают скорость реакции на 40%. Как видно из графика (Рисунок 1) влияние добавки чрезвычайно токсичной соли метилртути на скорость разложения пероксида водорода незначительно и практически не отличается от влияния неорганической соли ртути. Снижение скорости разложения перокси-да водорода в присутствии соединений ртути и олова, можно предположительно объяснить ингибированием антиоксидантных ферментов - каталазы и пероксидазы, взаимодействием данных соединений с гемоглобином -основным компонентом гемолизата эритроцитов.[15]
Известно, что металлоорганические ^единения могут реагировать с Н2О2 с образованием соответствующих пероксидов:[16]
RMX + И00И ^ R М(00И)Х , + ИХ
п m П ^ ' m-1
При разложении металлоорганических пероксидов возможно образование пероксидных радикалов R02•, поглощающих в УФ - области (237-242 нм).[17] Проведенные ранее исследования свидетельствуют об отсутствии подобного взаимодействия в данных условиях.[18]
На следующем этапе исследования были проведены опыты по влиянию добавки исследуемых порфиринов к гемолизату эритроцитов крови, которые показали значительное снижение скорости разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов в присутствии ТРРИ2
N. Т. ВегЬе1^а et а1.
(Рисунок 2). Скорость разложения пероксида водорода при добавлении (Н0^)4ТРРН2 и R4PH2 сравнима с контролем.
Таким образом, введение сульфосодержащего
Рисунок 2. Влияние порфиринов на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови: 1 -ТРРН2; 2 - (Н038)4ТРРН2; 3 - R4PH2. (Скорость разложения Н2О2 в контроле принята за 100%).
Рисунок 3. Электронные спектры поглощения ТРРН2, (Н038)4ТРРН2 и R4PH2. С(порфиринов) = 1,6-10-4 М; (2,05 М калийфосфатный буфер (рН 7,4).
фрагмента на периферии молекулы порфирина нивелирует снижение скорости разложения Н2О2. Сравнение электронных спектров поглощения (ЭСП) ТРРН2, R4PH2 и (Н0^)4ТРРН2 показывает, что в рассматриваемых производных мезо-арилзамещенного порфирина сохраняется типичная структура спектра порфирина. Следует отметить характерное для спектра сульфосодержащего производного ТРРН2 расширение и небольшой гипохромный сдвиг полосы Соре (на 5 нм) (Рисунок 3). В области ^-зоны (500-600 нм) наблюдается уменьшение интенсивности поглощения.
Сравнивая скорость разложения Н2О2 в присутствии
R4PH2,
можно заключить,
ТРРН2, (Н0^)4ТРРН2 и что модификация периферии молекулы порфирина рассматриваемыми фрагментами оказывает значительное влияние на изучаемый процесс.
Для однозначной интерпретации полученных результатов изучалась возможность взаимодействия всех исследуемых соединений с Н2О2 - субстратом каталазы. Типичная структура спектров порфиринов после их инкубирования с Н2О2 в течение 10 мин в области 300-500 нм остается постоянной, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия субстрата каталазы с порфириновыми соединениями (Рисунок 4).
Далее было изучено влияние исследованных порфиринов на скорость разложения Н2О2 гемолизатом эритроцитов в присутствии соединений ртути и олова. Установлено, что добавка сульфосодержащего порфирина в гемолизат, содержащий СН3Щ1, (СН3)^пО Щ(К03)2, ЩС12 приводит к возрастанию скорости разложения пероксида водорода (Рисунок 5). Так, добавка (Н0^)4ТРРН2 в присутствии (СН3)^пС1 на 80% увеличивает скорость данной реакции.
Добавка R4PH2 в гемолизат эритроцитов, содержащий соединения олова, приводит к повышению скорости расщепления пероксида водорода, таким образом, полностью нивелируется снижение скорости расщепления пероксида водорода под действием токсикантов (Рисунок 6). Наибольшая эффективность добавки этого соединения установлена в присутствии дибутилоловодихлорида - добавка R4PH2 в гемолизат
и 1
и -
ТГГП2 —■— ТТТП21Ш02
К4РН2+Ш02
450 51)0
Длина волны, нм
450 500
Длина волны, нм
400 450 500
Длина волны, нм
б
Рисунок 4. Изменение ЭСП при инкубации ТРРН2, R4PH2, (Н038)4ТРРН2 и Н2О2; С(порфирина) = 1,6-10-4 М; 0,05 М калийфосфатный буфер (рН 7,4).
а
в
Рисунок 5. Влияние (Н03Б)4ТРРН2 на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови в присутствии соединений ртути и олова: 1 - (Н03Б)4ТРРН2 + СН3Щ1; 2 - (Н03Б)4ТРРН2 + (СН3)3БпС1; 3 - (Н03Б)4ТРРН2 + Щ(Ы03)2; 4 - (Н03Б)4ТРРН2 + НС12 (скорость разложения Н2О2 в присутствии соответствующего ртуть- и оловоорганического соединения без добавки порфирина принята за 100%).
эритроцитов, содержащий данный токсикант, на 40 % снижает его негативное влияние на рассматриваемый ферментативный процесс.
Рисунок 6. Влияние R4PH2 на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови в присутствии оловоорганических соединений: 1 - (CH3)3SnCl+ R4PH2; 2 - (CH3)2SnCl2+ R4PH2; 3 - (n-C4H9)3SnCl + R4PH2; 4 - (n^H^SnC^ + R4PH2; 5 - (C^SnCl + R4PH2; 66 -(C6H5)2SnCl2 + R4PH2 (скорость разложения Н2О2 в присутствии соответствующего оловоорганического соединения без добавки порфирина принята за 100%).
Полученные в работе данные о протекторном влиянии производного TPPH2, содержащего фрагменты стерически затрудненного фенола, на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов в присутствии (CH3)3SnCl согласуются с данными опытов in vivo, в которых установлено снижение негативного влияния (CH3)3SnCl на активность каталазы печени и почек крысы при добавлении в их рацион R4PH2.[19]
Таким образом, порфирины, содержащие как хелатирующие, так и антиоксидантные группы (R4PH2 и (HO3S)TPPH2) могут выступать в качестве потенци-
альных антиокислительных ловушек по отношению к токсичным металлоорганическим соединениям или продуктам их распада.
Исследования показали, что добавка TPPH2 приводит к еще большему снижению скорости разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови в присутствии (CH3)3SnCl и (n-C4H9)3SnCl, что вероятно можно объяснить негативным влиянием на данный ферментативный процесс самого TPPH2. В этих условиях образуется избыток пероксида водорода, приводящий к изменению проницаемости биомембран и развитию окислительного стресса.
Заключение
Таким образом, в данном исследовании показано снижение скорости разложения пероксида водорода в присутствии TPPH2, соединений ртути и олова. Свободное основание мезо-замещенного порфирина увеличивает токсическое действие соединений ртути и олова. Сульфосодержащий водорастворимый порфирин и порфирин, содержащий стерически затрудненный фрагмент, уменьшают негативное влияние соединений ртути и олова на скорость разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови. Повышение скорости разложения пероксида водорода гемолизатом эритроцитов крови под действием R4PH2 и (HO3S)4TPPH2 в присутствии органических производных олова способствует поддержанию антиоксидантного статуса эритроцитов крови в условиях действия данных токсикантов.
Благодарность. Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 20092013 г. г. (Регистрационный номер заявки 2011-1.3.1-200029/017 ), гранта РФФИ №" 11-03-00389-а".
Список литературы
References
1. Agarwal R., Goel S.K., Behari J.R. J. Appl. Toxicol. 2010, 30, 457-468.
2. Ali S.F., Lebel C.P., Bondy S.C. Neurotoxicology 1992, 13, 637-648.
3. Mizuhashi S., Ikegaya Y., Matsuki N. Neuroscience Research 2000, 38, 35-42.
4. Skaming C.R.-F., Varhaug L.N., Fonnum F., Osmundsen H. Biochem. Pharmacology 2002, 64, 657-667.
5. Kost E.A. Spravochnik po Klinicheskim Laboratornym Metodam Issledovaniya [Handbook of Clinical Laboratory Research Methods]. Moskva: Meditsina, 1975, 384 p. (in Russ.).
6. Beers R.F. Jr., Sizer I.W. J. Biol. Chem. 1952, 195, 133-140.
7. Berezova T.T. Rukovodstvo k Laboratornym Zanjatijam po Biologicheskoj Khimii [Instructions for Laboratory Works on Biological Chemistry]. Moskva: Meditsina, 1976, 81 p. (in Russ.).
8. Turpaev K.T. Biokhimiya 2002, 67, 339-352 (in Russ.).
9. Forman H.J., Thomas M.J. Ann. Revs. Physiol. 1986, 48, 669680.
N. T. Berberova et al.
10. Prajora U. Svobodnye Radikaly v Biologii [Free Radicals in Biology]. Moskva: Mir, 1979, 308 p. (in Russ.).
11. Nagababu E., Chrest F.J., Rifkind J.M. Biochim. Biophys. Acta 2003, 1620(1-3), 211-217.
12. Stewart C., de Mora S.S., Sones M.R.L., Miller M.C. Mar. Pollut. Bull. 1992, 24, 204- 209.
13. Franchet C., Goudeau M., Goudeau H. Aquat. Toxicol. 1999, 44, 213-228.
14. Esina O.I., Kolyada M.N., Pimenov Yu.T., Berberova N.T., Milaeva E.R. Fundamental'nye Issledovaniya 2005, 9, 30-31 p. (in Russ.).
15. Aldridge W.N., Brown A.W. The Biological Properties of Methyl and Ethyl Derivatives of Tin and Lead. The Biological
Alkylation of Heavy Elements (Craig P.J., Ed.). London: Royal Soc. Chem., 1988. p. 147-163.
16. Antonovskiy V.L., Hursan S.L. Fizicheskaya Khimiya Organicheskikh Peroksidov [Physical Chemistry of Organic Peroxides]. Moskva: IKC Akademkniga, 2003, 10 p. (in Russ.).
17. Mel'nikov M.Ya. Vestnik Moskovskogo Universiteta, Ser. 2. Khimiya 2001, 42, 188-193 (in Russ.).
18. Kolyada M.N., Osipova V.P., Limonova N.T., Lagutina E.M. Berberova N.T. VestnikAGTU2006, 6(35), 62-68 (in Russ.).
19. Milaeva E.R., Tyurin V.Y., Gracheva Y.A., Dodochova M.A., Pustovalova L.M., Chernyshev V.N. Bioinorg. Chem. Appl. 2006, 27, 1-5.
Received 03.05.2011 Accepted 22.07.2011
