CC BY
36
УДК: 616.33-006.6-091.8
пролиферативная активность клеток опухоли при кишечном и диффузном типах рака желудка
м.в. Эавьялова1-2, в.М. перельмутер12, И.в. Степанов1, С.в. Бторушин1-2 С.г. Афанасьев2, А.в. Августинович2
Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск1 НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск2 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, e-mail: zavyalovamv@mail.ru1
Изучалась пролиферативная активность клеток первичной опухоли в операционном материале от 65 больных кишечным и от 42 больных диффузным типом рака желудка, TNM стадии, получивших операционное лечение. Иммуноги-стохимическое исследование выполнялось по стандартной методике. Для изучения пролиферативной активности клеток новообразования использовались антитела фирмы «Dako» к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные). При кишечном типе рака желудка оценивали уровень экспрессии Ki67 в клетках железистоподобных, криброзных структур новообразования и в дискретных мелких группах опухолевых клеток, располагающихся в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки органа. При диффузном типе рака изучали уровень экспресии Ki67 в мелких дискретных группах опухолевых клеток, находящихся на разной глубине инвазии. Показано, что как при кишечном, так и при диффузном типе рака желудка по мере увеличения глубины инвазии опухоли в толщу стенки желудка снижается доля клеток, экспрессирующих Ki67. В случаях развития лимфогенных метастазов изучаемый параметр, напротив, повышался.
Ключевые слова: рак желудка кишечного и диффузного типа, пролиферативная активность, инвазия, лимфогенное метастазирование.
PROLIFERATIVE ACTIVITY OF TUMOR CELLS IN INTESTINAL AND DIFFUSE TYPES OF GASTRIC CANCER M.V. Zavyalova12, V.M. Perelmuter12, I.V Stepanov1, S.V. Vtorushin12 S.G. Afanasyev2, A.V. Avgustinovich2 Siberian state Medical University, Tomsk1 Cancer Research Institute, SB RAMS, Tomsk2 2, Moskovsky Tract, 634050-Tomsk,e-mail: zavyalovamv@mail.ru1
Proliferative activity of primary tumor cells in surgical specimens from 65 patients with intestinal type and from 42 patients with diffuse type of stage T N03 M0 gastric cancer was studied. Immunohistochemical studies were performed using standard methods. Antibodies (Dako) to Ki67 (MIB-1, RTU, murine) were used to study proliferative activity of tumor cells. In intestinal type of gastric cancer, the level of Ki67 expression in cells of gland-like, fibrous structures of a tumor and in discrete small groups of neoplastic cells located in mucosal, submucosal and serous layers of the gastric wall was studied. In diffuse type of gastric cancer, the level of Ki67 expression in small discrete groups of tumor cells located on different depths of invasion was studied. It was shown that in both intestinal and diffuse types of gastric cancer, the percentage of cells expressing Ki67 was decreased with increasing the depth of tumor invasion into the gastric wall. In cases with lymphogenic metastases, on the contrary, the studied parameter was increased.
Key words: gastric cancer of intestinal and diffuse types, proliferative activity, invasion, lymphogenic metastatic spread.
Рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований [2-4]. В настоящее время при изучении данной онкологической патологии придается большое значение различным морфологическим и генетическим параметрам опухолевых клеток, отражающих их биологические свойства, связанные с прогрессией болезни, которая и определяет в большей степени прогноз. Одним
из таких ключевых свойств является пролиферативная активность в опухоли. Известно, что традиционный подсчет митотической активности не отражает истинный пролиферативный потенциал опухоли, так как собственно митоз занимает несколько часов, а подготовка к нему - около 24 ч. В связи с этим наибольшее значение на сегодняшний день имеют два маркера клеточной пролиферации - КІ67 и PCNA
(Proliferating Cell Nuclear Antigen), которые являются ядерными антигенами и связаны со всеми фазами клеточного цикла, кроме G0 [9]. Биологическое значение экспрессии указанных маркеров проявляется в том, что они не только отражают пролиферативный потенциал клеток, но и сопряжены с другими характеристиками опухоли, такими как параметры апоптоза (p53), гиперэкспрессия онкопротеина Her2/neu [1, 5]. Прогностическая роль пролиферативной активности определяется в первую очередь взаимосвязью с регионарной распространенностью опухолевого процесса. Так, в ряде исследований было показано, что повышение уровня экспрессии Ki67 коррелирует с наличием метастазов в лимфатических узлах [6, 14]. Для PCNA такой связи обнаружено не было, однако экспрессия данного ядерного антигена была связана с глубиной инвазии опухоли. Так, Maedera et al. [12] обнаружили, что у больных раком желудка при прорастании опухоли в мышечный слой и глубже индекс иммунореактивности PCNA был значительно выше, чем у больных с инвазией в пределах слизистой оболочки желудка или до подслизистой основы. Elpek et al. [7] показали, что уровень экспрессии PCNA возрастал с увеличением гистологической стадии рака желудка и в опухолях больных с наличием метастазов в лимфатических узлах. Muller et al. [13] выявили различия в пролиферации клеток в зависимости от варианта рака по классификации Lauren. Авторы показали, что в опухолях кишечного типа экспрессия Ki67 обнаруживалась чаще, чем в диффузных и раках желудка с перстневидноклеточным компонентом. Однако указанные исследователи не обнаружили какой-либо корреляции между пролиферативной активностью и глубиной инвазии, а также поражением лимфатических узлов и степенью дифферен-цировки опухоли. По данным Lee et al. [10], в кишечном типе рака желудка экспрессия PCNA обнаруживалась чаще, чем при диффузном типе новообразования. Yonemura et al. [16] в своем исследовании указывают, что большие опухоли (диаметром более 6 см) характеризовались более высокой экспрессией Ki67, чем новообразования размером менее 6 см.
Таким образом, имеющиеся на сегодняшний день литературные данные свидетельствуют
о том, что высокие уровни экспрессии Ki67 и PCNA могут быть сопряжены не только с гистологическим типом рака желудка по классификации Lauren, но и со степенью злокачественности опухоли, ее размером и поражением регионарных лимфатических узлов. Вместе с тем, несмотря на большое число исследований, посвященных пролиферативной активности, в литературе отсутствуют сведения об изучении данного параметра в зависимости от детального морфологического строения опухоли и локализации тех или иных опухолевых структур в разных слоях стенки желудка.
Цель исследования - изучить пролиферативную активность клеток опухоли в зависимости от морфологического строения новообразования при кишечном и диффузном типе рака желудка.
Материал и методы
В исследование было включено 107 больных раком желудка T1-4N0-3M0 стадии, проходивших лечение в торакоабдоминальном отделении НИИ онкологии СО РАМН и в клиниках ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России за период с 2004 по 2009 г. Средний возраст больных составил 58,7 ± 10,3 года. В исследование вошли 56 (52 %) мужчин и 51 женщина (48 %). Предоперационной терапии пациенты не получали. Объем выполненных операций: 63 (58,8 %) больным была проведена субтотальная дистальная резекция желудка, 36 (34 %) - гастрэктомия, 3 (2,8 %) - проксимальная резекция желудка, 3 (2,8 %) - паллиативная субтотальная резекция желудка, 1 (0,8 %) - панкреато-дуоденальная резекция, 1 (0,8 %) - операция по типу Льюиса. Во всех случаях выполнялась перигастральная лимфодиссекция в объеме D2.
Морфологическому исследованию подвергался операционный материал. Проводились макроскопическая оценка удаленного или резецированного желудка и анализ распространенности опухолевого процесса. Гистологически изучались ткань первичной опухоли и все удаленные лимфатические узлы. Гистологические препараты изготавливались по стандартной методике. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака желудка устанавливали согласно классификации, пред-
ложенной P. Lauren (1965), с делением опухоли на кишечный и диффузный типы. В паренхиматозном компоненте опухолей выделяли железистоподобные, криброзные, трабекулярные, солидные структуры, дискретно расположенные группы опухолевых клеток и перстневидноклеточные элементы. Нами оценивалась глубина инвазии слоев стенки желудка разными типами опухолевых структур. В изучаемых структурах паренхиматозного компонента опухоли подсчитывался процент клеток с митотическими фигурами (на 100 клеток при увеличении микроскопа *400). В регионарных лимфатических узлах отмечали наличие метастатического поражения. Иммуногистохимическое исследование выполнялось по стандартной методике. Для изучения пролиферативной активности клеток новообразования использовались антитела фирмы «Dako» к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные). При кишечном типе рака желудка оценивали процент клеток, экспрессирующих Ki67 отдельно в железистоподобных, криброзных структурах новообразования и в дискретных мелких группах опухолевых клетках. Подсчет проводили раздельно в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки органа. При диффузном типе рака изучали уровень экспре-сии Ki67 в мелких дискретных группах опухолевых клеток, находящихся на разной глубине инвазии. Статистическая обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 6.0».
Результаты и обсуждение
Исследование митотической активности в опухоли показало некоторые отличия, связанные с гистотипом рака. При кишечном типе рака желудка фигуры митоза были обнаружены в 35 случаях. При этом оказалось, что число митозов
несколько ниже в наименее дифференцированных структурах - дискретных опухолевых клетках, по сравнению с железистоподобными структурами, которые считаются высокодифференцированными (таблица).
Фигуры митоза удалось обнаружить в 12 наблюдениях при диффузном типе рака желудка. Однако при этом типе опухоли относительное количество клеток с фигурами митоза существенно не отличалось в разных структурах паренхиматозного компонента новообразования (группы клеток - 0,3 ± 0,4 и перстневидноклеточные элементы - 0,6 ± 0,5).
Анализ пролиферативной активности (Ю67) в зависимости от морфологического строения и типа опухоли выявил ряд существенных отличий, связанных с глубиной инвазии. При кишечном типе рака желудка уровень экспресии Ю67 был значимо ниже (4,8 ± 3,3%) в клетках, формирующих железистоподобные структуры, располагающиеся в серозной оболочке, по сравнению с экспрессией в подобного рода структурах, находящихся в слизистой оболочке (33,7 ± 22,7 %; р=0,02). Аналогичная закономерность прослеживалась и в отношении экспрессии Ю67 в клетках, формирующих кри-брозные структуры. Уровень экспрессии Ю67 в этих структурах в серозной оболочке был меньшим (12,7 ± 15,6 %) по сравнению с этим показателем в структурах, обнаруживаемых в слизистом слое (48,4 ± 27,2 %; р=0,009). При кишечном типе рака желудка пролиферативная активность в дискретно расположенных группах опухолевых клеток не была существенно связана с глубиной их инвазии стенки органа, но отличалась от таковой в железистоподобных структурах. Так, уровень экспрессии Ю67 в группах опухолевых клеток, выявляющихся в
Таблица
доля клеток с фигурами митоза в разных структурах паренхиматозного компонента
опухоли при кишечном типе рака желудка
Тип структур Кол-во клеток с фигурами митоза, %
1. Железистоподобные 0,8±0,3 (n=13)
2. Криброзные 0,5±0,3 (n=9)
3. Солидные 0,5±0,4 (n=2)
4. Трабекулярные 1,0 (n=1)
5. Группы клеток 0,3±0,8 (n=10) р,=0,02
слизистой оболочке, составил 19,5 ± 18,7 %, а в железистоподобных структурах на этой же глубине инвазии - 33,7 ± 22,7 % (р=0,09). При диффузном типе рака уровень экспрессии Ю67 в мелких группах опухолевых клеток, находящихся в серозной оболочке, был существенно ниже (3,2 ± 1,6 %) по сравнению с этим показателем в аналогичных структурах, но располагающихся в слизистой оболочке (24,5 ± 27,9 %; р=0,07).
Сопоставление изучаемых параметров с лимфогенным метастазированием позволило выявить ряд закономерностей. При кишечном типе рака желудка в случаях наличия лимфогенных метастазов обнаруживался больший процент клеток, формирующих железистоподобные структуры с фигурами митоза, в сравнении со случаями, когда в лимфатических узлах метастазов не было - 1,0 ± 0,2 и 0,6 ± 0,3 соответственно (р=0,007). В наблюдениях с диффузным типом рака желудка взаимосвязи между митотической активностью клеток новообразования и лимфогенным метастазированием не выявлено.
Однако такой признак, как процент клеток, экспрессирующих Ю67, оказался связан с лимфогенным метастазированием как при кишечном, так и при диффузном типах рака желудка. При наличии лимфогенных метастазов процент клеток, экспрессирующих Ю67, был выше в сравнении со случаями с отсутствием лимфогенной диссеминации. Важно отметить, что данная зависимость при кишечном типе рака желудка прослеживалась лишь в отношении клеток, формирующих криброзные структуры, располагающиеся в слизистой оболочке стенки желудка - 21,1 ± 12,7 и 4,5 ± 3,3 соответственно (р=0,04).
При диффузном типе новообразования при наличии лимфогенных метастазов отмечался более высокий уровень экспрессии Ю67 в дискретных группах опухолевых клеток, расположенных в слизистой оболочке, по сравнению со случаями, когда лимфатические узлы были интактными - 33,0 ± 30,4 и 7,5 ± 10,5 (р = 0,07).
Таким образом, проведенное исследование показало, что при кишечном типе рака желудка имеются различия в пролиферативной активности клеток различных морфологических структур опухоли. Так, наименее дифферен-
цированные структуры паренхиматозного компонента - дискретные группы опухолевых клеток - характеризовались низкой пролиферативной активностью по сравнению с более дифференцированными - железистоподобными структурами.
У больных с разными типами рака желудка была обнаружена взаимосвязь пролиферативной активности с глубиной инвазии опухоли. По мере увеличения глубины прорастания стенки желудка наблюдалось снижение процента экспрессии Ю67 опухолевыми клетками. При кишечном типе рака желудка наиболее отчетливо это проявлялось в железистоподобных и кри-брозных структурах, а при диффузном типе - в дискретных группах опухолевых клеток.
Как при кишечном, так и при диффузном типе рака желудка отмечалась связь пролиферативной активности опухолевых клеток с развитием лимфогенного метастазирования. В случаях с наличием лимфогенной диссеминации опухоль характеризовалась более высокой пролиферативной активностью в слизистом слое желудка.
Снижение пролиферативной активности опухолевых клеток в железистоподобных и криброзных структурах при кишечном типе рака и в дискретных группах опухолевых клеток при диффузном, по-видимому, отражает явление эпителиально-мезенхимального перехода, одним из ключевых факторов которого является TGF-B. Известно, что трансформирующий фактор роста TGF-P увеличивает метастатический и инвазивный потенциал раковых клеток желудка, повышая их способность изменяться и проникать через барьеры базальной мембраны, а также увеличивая адгезивную и двигательную активность опухолевых клеток [8, 11, 15]. Помимо указанных эффектов данного ростового фактора, одним из важных его свойств является способность снижать пролиферацию клеток. Исходя из этого, можно полагать, что опухолевые элементы, находящиеся в более глубоких отделах стенки желудка, пребывают в более продвинутой фазе эпителиально-мезенхимального перехода.
Данные о более высокой частоте лимфогенного метастазирования при выраженной пролиферативной активности опухолевых
элементов в слизистом слое стенки желудка можно объяснить тем, что, достигнув лимфатического узла и претерпев обратный процесс мезенхимально-эпителиального перехода, интенсивно пролиферирующие клетки, скорее, превращаются из микрометастаза в «макрометастаз», диагностируемый клиникоинструментальными методами.
Выявленные отличия пролиферативной активности клеток новообразования, связанные с глубиной инвазии стенки желудка, могут являться основой для проведения фундаментальных исследований механизма инвазивного роста при раке желудка. Неодинаковая направленность изменений пролиферативной активности при инвазивном росте и лимфогенном метастази-ровании может явиться дополнительным фактором, указывающим на независимость развития разных форм опухолевой прогрессии.
Настоящая работа выполнена при частичном финансировании в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг., госконтракт № 02.740.11.0769, и Международного научно-технического центра № 3909).
ЛИТЕРАТУРА
1. Волков Н.М., Суспицын Е.Н., Иевлева А.Г. и др. Выбор терапии у больных раком желудка на основе молекулярногенетических маркеров // Материалы XIV Российского онкологического конгресса. М., 2010. С. 161-165.
2. Давыдов М.И., Аксель ЕМ. Заболе ваемость злокаче ственными новообразованими населения России и стран СНГ в 2006 г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. 2008. Т. 19, № 2. Прил. 1. С. 56.
3. Злокачественные новообразования в России в 2008 г. (заболеваемость и смертность) / Под ред. В.И. Чиссова,
В.В. Старинского, ГВ. Петровой. М., 2010. С. 11-19.
4. Писарева Л.Ф., Бояркина А.П., Ушакова И.В. Рак желудка в регионе Сибири и Дальнего Востока (1991-2005 гг.) // Сибирский онкологический журнал. 2009. № 3 (33). С. 36-43.
5. Степанов И.В., Завьялова М.В., Григорьева Е.С. и др. Клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности интестинального и диффузного типа карцином желудка // Сибирский онкологический журнал. 2010. № 4 (40).
С. 55-66.
6. Al-Moundhri M.S., Nirmala V, Al-Hadabi I. et at. The prognostic significance of p53, p27 kip1, p21 waf1, HER-2/neu, and Ki67 proteins expression in gastric cancer: a clinicopathological and im-munohistochemical study of 121 Arab patients // J. Surg. Oncol. 2005. Vol. 91 (4). P. 243-252.
7. ElpekG.O., Gelen T.,AksoyN.H. Microvessel count, proliferating cell nuclear antigen and Ki-67 indices in gastric adenocarcinoma // Pathol. Nocol. Res. 2000. Vol. 6. P. 59-64.
8. Guo W., Dong Z., Guo Y. et al. Polymorphisms of transforming growth factor-p1 associated with increased risk of gastric cardia adenocarcinoma in north China // Int. J. Immunogenet. 2011. Vol. 38 (3). P 215-224.
9. Holte H., Suo Z., SmelandE.B., Kvaloy S. Prognostic value of lymphoma specific S-phase fraction compared with that of other cell proliferation markers // Acta Oncol. 1999. Vol. 38. P. 495-503.
10. LeeK.E., LeeH.-J., Kim Y.H. Prognostic Significance of p53, nm23, PCNA and c-erbB-2 in Gastric Cancer // Japan. J. Clin. Oncol. 2003. Vol. 33. P. 173-179.
11. Li T., Cao B.W., Dai Y. et al. Correlation of transforming growth factor beta-1 gene polymorphisms C-509T and T869C and the risk of gastric cancer in China // J. Gastroenterol. Hepatol. 2008. Vol. 23 (4). P. 638-642.
12. Maedera K., Chung Y., Onoda N. Proliferating cell nuclear antigen labeling index of preoperative biopsy specimens in gastric carcinoma with special reference to prognosis // Cancer. 1994. Vol. 73. P. 528-533.
13. Muller W., Schneiders A., Meier S., Hommel G. Immunohis-tochemical study on the value of MIB-1 in gastric carcinoma // Br. J. Cancer. 1996. Vol. 74. P. 759-765.
14. Tzanakis N.E., Peros G., Karakitsos P. et al. Prognostic significance of p53 and Ki67 proteins expression in Greek gastric cancer patients // Acta Chir. Belg. 2009. Vol. 109 (5). P. 606-611.
15. Van Cutsem E., Dicato M., Geva R. et al. The diagnosis and management of gastric cancer: expert discussion and recommendations from the 12th ESMO/World Congress on Gastrointestinal Cancer. Barcelona, 2010 // Ann. Oncol. 2011. Vol. 22. Suppl. 5. V. 1-9.
16. Yonemura Y., Ohoyama S., Kimura H. Assessment of tumor cell kinetics by monoclonal antibody Ki-67 // Eur. Surg. Res. 1990. Vol. 22. P. 365-370.
Поступила 18.04.11
