CC BY
32
Прогнозирование заживления гнойных ран на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии синтеза протеинов при различных способах лечения
О.Б. Нузова, д.м.н., профессор, А А. Стадников, д.б.н., профессор, НИ.Колосова ст. преподаватель, ФГБОУ ВО ОрГМУ, А.В. Студеникин, врач-хирург, ГБУЗ ООКБ
Лечение гнойных ран у больных сахарным диабетом является одной из важнейших проблем медицины, которой посвящены многочисленные исследования [1, 7, 8]. В общепринятом комплексе лечебных мероприятий особую роль играет местное лечение гнойных ран. Несмотря на применяемые в практике разнообразные хирургические и медикаментозные методы лечения гнойно-воспалительных процессов мягких тканей, имеются существенные ограничения клинических
репаративных эффектов в каждом способе ведения ран. Одной из важнейших задач в лечении больных с острой хирургической инфекцией мягких тканей является прогнозирование течения гнойно-воспалительных заболеваний [2, 3]. Актуальной является разработка методик прогнозирования репаративных процессов в гнойных ранах при различных способах лечения на основе иммуноци-тохимической идентификации экспрессии синтеза протеинов. Апоптоз или запрограммированная форма клеточной гибели наряду с делением, ростом, дифференцировкой играет чрезвычайно важную роль в формировании и функционировании многоклеточных организмов [2, 4].
Цель исследования — обоснование прогнозирования заживления гнойных ран на основе экспрессии синтеза проапоптотического белка р53 и белка Ki67 — маркера пролиферации при различных способах лечения гнойных ран на фоне аллоксанового диабета.
Материал и методы исследования. Лечебная эффективность милиацила и КВЧ-терапии изучена в опытах на 128 белых беспородных крысах-самцах, массой 260 — 330 г. Все манипуляции с животными выполнены в соответствии с требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985), Хельсинкской декларации «О гуманном отношении к животным» (2000 г.), приказа Министерства здравоохранения РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики».
После суточного голодания у подопытных животных был вызван аллоксановый диабет путём введения подкожно 5-процентного раствора аллоксана. Через 30 дн. после получения аллоксанового диабета у крыс моделировали гнойно-воспалительный процесс задних конечностей, в том числе при инфицировании 64 животных Staphylococcus aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) и 64 крыс штаммом стафилококка без антилактоферри-новой активности (АЛфА).
После получения экспериментальной модели гнойно-воспалительного очага производилась его хирургическая обработка в объёме, обеспечивающем удаление нежизнеспособных тканей. Оперативное вмешательство проводилось под общей анестезией. У крыс основной (IV) гр. в местном лечении ран использовали Милиацил и КВЧ-терапию от аппарата «Явь-1». Ранозаживляющий препарат Милиацил разработан профессором Б. Г. Нузовым и профессором Л. Е. Олифсоном в Оренбургском государственном медицинском университете. В лечении гнойных ран в последние годы успешно используют физические методы воздействия, в том числе КВЧ-терапию[2]. У животных I контрольной гр. был исследован характер течения гнойно-воспалительного процесса без лечебной коррекции. Во II контрольной гр. лечение гнойно-воспалительного очага у крыс осуществлялось Милиацилом. В III контрольной гр. применяли КВЧ-терапию от аппарата «Явь-1» с рабочей длиной волны 7,1 мм. Продолжительность проводимых ежедневно воздействий составляла от 5 до 6 мин. В каждой группе было взято по 32 крысы (16 инфицированных S. aureus АЛфА+ и 16 инфицированных S. aureus АЛфА—). Животных выводили из опыта путём ингаляции летальной дозы эфира. Ткани фиксировали в 10-процентном растворе нейтрального формалина и 2,5-процентном растворе глютарового альдегида (рН-7,3). Объекты были исследованы на светооптическом уровне. Гистосрезы толщиной
6 — 8 мкм, изготовленные на ротационном микротоме, после депарафинирования окрашивали гематоксилином Майера и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, метиловым зелёным и пиронином по Браше, перйодатом К и реактивом Шиффа по Мак Манусу. Для идентификации клеток с признаками апоптоза в регенерате гнойных ран применяли иммуноцитохимические реакции. Для определения экспрессии проапоптотического белка р53 и белка Ki-67 — маркера пролиферации серийные гистосрезы (толщиной 5 — 6 мкм) инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (фирма «Dako», Дания) в рабочем разведении 1:50.
Полученные данные были обработаны с помощью пакета программы Статистика 6.1.
Результаты исследования. Результаты проведённого обследования 128 крыс с гнойными ранами на фоне аллоксанового диабета свидетельствуют
0 том, что более эффективным оказалось сочетанное использование Милиацила и КВЧ-терапии, чем применение только Милиацила или КВЧ-терапии.
Сроки заживления гнойных ран у крыс на фоне аллоксанового диабета в основной IV гр., лечение которых проводили местно Милиацилом и КВЧ-терапией (11,91±0,28сут.), были короче, чем у животных, при лечении которых использовали только Милиацил (13,88+0,26 сут.), и у крыс, в лечении которых использовали только КВЧ-терапию (не заживали к 28 сут.).
Гистологический анализ исследованных объектов у крыс I контрольной гр. выявил, что в ранах преобладали некротические процессы. У животных на фоне выраженных альтеративных изменений отмечали вполне отчётливо все признаки сосудистой реакции с образованием экссудата. У животных этой группы, инфицированных S. aureus с анти-лактоферриновой активностью, наблюдались более выраженные нарушения кровообращения, некротические процессы, формирование микроабсцессов. Использование Милиацила во II контрольной гр. обусловило более выраженное усиление лейкоцитарной и макрофагальной реакции, быстрее на убыль шёл воспалительный процесс, чем у особей
1 и III контрольных гр.
У крыс на 7-е сут. лечения гнойных ран Милиацилом определялась грануляционная ткань. К 14-м сут. в заживших ранах была выражена типичная рубцовая ткань. У животных III контрольной гр. через 7 сут. лечения ран КВЧ-терапией в области раневого дефекта были выражены репаративные явления грануляционной ткани, сочетающиеся с очагами гнойного воспаления. Выявлялась грануляционная ткань в области раневых дефектов через 14 сут. лечения. Формирующаяся грануляционная ткань определялась через 28 сут. лечения в глубоких отделах дермы.
Сравнительное изучение тканевых структур гнойных ран в различных условиях воздействия
Морфометрические данные по анализу содержания иммунопозитивных клеток (%) в ране экспериментальных животных, инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+) и без антилактоферриновой активности (АЛфА—) в зависимости от способа их лечения (подсчёт проведён с помощью сетки Г.Г. Автандилова, об. 40, ок. 10)
Животные, инфицированные S. aureus с антилактоферриновой активностью Животные, инфицированные S. aureus без антилактоферриновой активности
Количество иммунопозитивных клеток, % I контрольная гр. (без лечения) (n=4) II контрольная гр. (Милиацил) (n=4) III контрольная гр. (КВЧ-терапия) (n=4) основная IV гр. (Милиацил и КВЧ-терапия) (n=4) I контрольная гр. (без лечения) (n=4) II контрольная гр. (Милиацил) (n=4) III контрольная гр. (КВЧ-терапия) (n=4) Основная IV гр. (Милиацил и КВЧ-терапия) (n=4)
Фибробласты Ki-67 - - - - - - - 1,8±0,2
р53 3,5±0,6 - 1,5±0,6 - 2,3±0,1 - - -
Эндотелиоциты Ki-67 - 1±0,4 - 1,8±0,5 - 1,4±0,1 0,6±0,1* 2,0±0,2
p53 3,3±0,5 2,3±0,3 3±0,4 - - - - -
Эпителиоциты Ki-67 - 1,0±0,4* - 3,5±0,6 - 1,8±0,1* - 4,0±0,1
регенерата p53 2,8±0,5 2,0±0,4 2,3±0,5 - 2,3±0,2 - 1,0±0,2 -
Примечание: * — статистическая значимость различий показателей от таковых по сравнению с основной группой
показало большую лечебную эффективность сочетанного использования Милиацила и КВЧ-терапии. Через 7 сут. лечения ран развивалась грануляционная ткань у животных основной IV гр. Регенеративные процессы распространялись и на мышечные волокна. Были идентифицированы плазматические клетки, диффузно распределённые в межкапиллярных пространствах. На 7-е сут. наблюдалась выраженная эпителизация раневого дефекта. Формированием лимфоидно-плазматических инфильтратов завершалось полное очищение раны и образование органотипического регенерата. Благоприятное воздействие Милиа-цила и КВЧ-терапии на заживление гнойных ран подтверждалось и экспрессией синтеза проапоп-тотического белка р53 и белка Ki-67 в регенерате гнойных ран.
Белок р53 является важным маркером биологического потенциала клеток, выполняет три основные функции: регуляцию клеточного цикла, индукцию апоптоза (в случаях, когда нарушения ДНК клетки не могут быть репарированы), стабилизацию генома [5]. Ki-67 — белок, являющийся клеточным маркером пролиферации, экспрессиру-ется в пролиферирующих клетках в течение фазы G1, но не обнаруживается в покоящихся клетках [6].
Сравнивая показатели экспрессии синтеза белков р53 и Ki-67, была установлена их разнонаправленная (реципрокная) реализация (табл.). На 7-е сут. лечения р53 положительные фибро-бласты у крыс основной IV и II контрольной гр., инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), обнаружены не были. У животных I и III контрольных гр. определялись р53 положительные фибробласты. Количество р53 положительных фибробластов на 7-е сут. было
больше у крыс I контрольной гр. в 2,3 раза по сравнению с аналогичным показателем у животных III контрольной гр.
У крыс основной IV гр., инфицированных S. aureus с антилактоферриновой активностью (АЛфА+), р53 положительные эндотелиоциты обнаружены не были, но определялись у животных контрольных групп. Количество р53 эндотелиоцитов у крыс I контрольной гр. было больше в сравнении с таким показателем у животных II и III контрольных гр. в 1,4 и 1,1 раза соответственно.
Также р53 положительные эпителиоциты не встречались у животных основной гр., у крыс контрольных гр. они были обнаружены. Количество р53 положительных эпителиоцитов было больше у крыс I контрольной гр. по сравнению с аналогичным показателем у животных II и III контрольных гр. в 1,4 и 1,2 раза. У животных основной IV, II и III контрольных гр., инфицированных S.aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА), на 7-е сут. р53 положительные фибробласты не были обнаружены, только определялись у крыс I контрольной гр. У крыс всех групп р53 положительные эндотелиоциты не определялись.
У крыс основной IV и II контрольной гр. р53 положительные эпителиоциты не определялись, а встречались только у животных I и III контрольных гр. Количество р53 положительных эпителиоцитов у животных I контрольной гр. было больше по сравнению с аналогичным показателем у крыс III контрольной гр. в 2,3 раза.
На 7-е сут. лечения у крыс всех групп, инфицированных S.aureusс антилактоферриновой активностью (АЛфА+), не определялись Ki-67 положительные фибробласты. Ki-67 положительные
эндотелиоциты были обнаружены у животных основной IV и II контрольной гр. Количество Ki-67 положительных эндотелиоцитов на 7-е сут. лечения у крыс основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных II контрольной гр. было больше в 1,8 раза.
У животных основной и II контрольной гр. определялись Ki-67 положительные эпителиоциты, которые не встречались у крыс I и III контрольных гр. На 7-е сут. лечения количество Ki-67 положительных эпителиоцитову крыс основной IV гр. по сравнению с аналогичным показателем у животных II контрольной гр. было больше в 3,5 раза.
У крыс основной группы, инфицированных S. aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА), определялись Ki-67 положительные фибробласты. У крыс контрольных групп Ki-67 положительные фибробласты обнаружены не были. Ki-67 положительные эндотелиоциты были обнаружены у животных основной, II и III контрольных гр. Количество Ki-67 положительных эндотелиоцитов у крыс основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных II и III контрольных гр. было больше в 1,4 и 3,3 раза. У животных основной и II контрольной гр., инфицированных S.aureus без антилактоферриновой активности (АЛфА), определялись Ki-67 положительные эпителиоциты. У животных I и III контрольных гр. Ki-67 эпителиоциты не были обнаружены. Количество Ki-67 положительных эпителиоцитов у крыс основной группы по сравнению с аналогичным показателем у животных II контрольной гр. было больше в 2,3 раза.
Выводы. Милиацил, особенно в сочетании с КВЧ-терапией, стимулирует пролиферативную
активность клеток раневой области и приводит к лимитированию апоптотической доминанты (противоапоптотическое действие). При этом у крыс I и III контрольных гр. обнаружено, что пролиферативная активность клеток была существенно снижена на фоне интенсивной экспрессии белка р53 и подавления экспрессии белка Ki-67. Полученные экспериментальные данные подтверждались иммуноцитохимическими исследованиями тканей гнойных ран на фоне аллоксанового диабета. Обоснован способ прогнозирования течения гнойных ран на основе иммуноцитохимической идентификации экспрессии проапоптотического белка р53, а также белка Ki-67 - маркера пролиферации.
Литература
1. Блатун JI.A. БАНЕОЦИН® (порошок, мазь) — перспективы использования в комплексном хирургическом лечении гнойно-некротических поражений нижних конечностей у больных с синдромом диабетической стопы // Раны и раневые инфекции. 2015. T. II. №3. С. 36 — 45.
2. Нузов Б.Г., Стадников А.А., Нузова О.Б. Оптимизация репаративной регенерации тканей. М.: Медицина, 2012. 199 с.
3. Фадеев С.Б. Хирургическая инфекция мягких тканей второго уровня, особенности этиотропной терапии: автореф. дисс.... докт. мед. наук. Оренбург, 2010. 38 с.
4. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптоза клеток крови// Лабораторная медицина. 2001. №4. С. 47-54.
5. Некоторые иммуногистохимические особенности мелано-цитарных образований кожи / И.А. Новикова, Н.А. Максимова, В.В. Позднякова, М.И. Максимова, М.Г. Ильченко, Е.П. Ульянова, А.О. Гранкина // Современные проблемы науки и образования. 2016. № 5. С. 22.
6. Лазукин А.В. Фактор пролиферации Ki-67 как показатель прогноза при раке молочной железы // Российский биотерапевтический журнал. 2014. Т. 13. №2. С. 29 — 34.
7. BowlerP.G., DuerdenB.I.,Armstrong D.G.Wound Microbiology and Associatend Approaches to Wound Management // ClinMicrobiol Rev. 2001. Vol. 14. №2. P. 244-269.
8. Cunha B.A. Antibiotic selection for diabetic foot infections a review // J Foot Ankle Surg.2000.Vol. 39, №4.P. 253-257.
