CC BY
36
© СТУДЕНИКИН А.В., НУЗОВА О.Б., СТАДНИКОВ А.А. — 2015 УДК 616-001.4-002.3-08-031.84:616.379-008.64-092.9
ПРИМЕНЕНИЕ МИЛИАЦИЛА И КВЧ-ТЕРАПИИ В ЛЕЧЕНИИ ГНОЙНЫХ РАН НА ФОНЕ АЛЛОКСАНОВОГО ДИАБЕТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Александр Викторович Студеникин, Ольга Борисовна Нузова, Александр Абрамович Стадников (Оренбургский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. В.М. Боев, кафедра факультетской хирургии, зав. — д.м.н., доц. Д.Б. Демин, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии,
Резюме. Изучена эффективность сочетанного применения милиацила и КВЧ-терапии в лечении гнойных ран на фоне аллоксанового диабета у 24 крыс. В I контрольной группе у 24 крыс лечение ран не проводилось, у 24 крыс II контрольной группы использовали милиацил, у 24 крыс III контрольной группы применяли КВЧ-терапию. На основании клинических, гистологических исследований выявлено, что процесс заживления ран протекает наиболее благоприятно при применении милиацила и КВЧ-терапии.
Ключевые слова: милиацил, КВЧ-терапия, аллоксановый диабет, гнойные раны, S. aureus, антилактоферрино-вая активность.
APPLICATION OF MILIACILE AND EHF-THERAPY IN THE TREATMENT OF PURULENT WOUNDS ON THE BACKGROUND OF ALLOXAN DIABETES IN RATS
A. V. Studenikin, O.B. Nuzova, A.A. Stadnikov (Orenburg State Medical University, Russia)
Summary, ^e efficacy of combined use of Miliacile and EHF-therapy in the treatment of purulent wounds on the background of alloxan diabetes has been studied in 24 rats. In the rats of control group I (24 rats) the wounds were not treated, ^e wounds in 24 rats of control group II were treated with Miliacile. ^e rats in control group III (24 rats) were treated by applying the EHF-therapy. On the basis of clinical and histological studies it was found that the healing process proceeds more favorably when applying Miliacile and EHF-therapy.
Keywords: Miliacile, EHF-therapy, alloxan diabetes, purulent wounds, S. aureus, antilactoferrine activity.
В числе самых распространенных эндокринных заболеваний сахарный диабет рассматривается как заболевание, имеющее стремительный рост. Лечение хирургических заболеваний, возникающих на фоне сахарного диабета, считается сложной и трудно решаемой проблемой в хирургии [1, 12]. Одной из причин неблагоприятного течения инфекционных заболеваний считается инфицирование возбудителем, способным секретировать биологически активные вещества, инак-тивирующие защитные механизмы хозяина и оцениваемые, как факторы бактериальной персистенции [3, 8]. Антилактоферриновая активность микроорганизмов является фактором персистенции бактерий, способствующим выживанию в организме хозяина [4].
Успех лечения больных с гнойной хирургической инфекции во многом зависит от местного лечения [6,5, 9,2,14, 15]. Остается важным поиск новых методов и средств местного лечения, обладающих разнонаправленным действием [11]. Этим требованиям отвечает разработанный в Оренбургской государственной медицинской академии профессором Б.Г. Нузовым и профессором Л.Е. Олифсоном препарат милиацил (просяное масло). Благоприятные результаты использования милиацила обусловлены его составными частями, являющимися биокатализаторами, ускоряющими обменные процессы в тканях [13, 10].
Сегодня широкое применение в клинической практике получили физические методы воздействия, в том числе и КВЧ-терапия. Однако изучение эффективности сочетанного применения милиацила и КВЧ-терапии в комплексном лечении гнойных ран на фоне диабета не проводилось.
Цель исследования: определить клиническую эффективность местного применения милиацила и КВЧ-терапии в лечении гнойных ран на фоне аллоксанового
Материалы и методы
Экспериментальные исследования проведены на 96 белых беспородных крысах-самцах с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспери-
ментальных животных» согласно приказу Минздрава СССР Ns755 от 12.08.1977 г., Федеральному закону РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 01.12.1999 г., «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (Страсбург, 1985).
У подопытных животных после суточного голодания был вызван аллоксановый диабет путем введения подкожно крысам 5% раствора аллоксана. Диабет возникал через 2 суток после введения указанного раствора. С 6-х суток после возникновения диабета с целью его компенсации ежедневно в течение всего периода проведения эксперимента вводился подкожно раствор протамин-цинк-инсулина в дозе 4 ЕД крысам.
У крыс через 30 дней после получения аллоксанового диабета моделировали гнойно-воспалительный процесс задних конечностей. Подопытным крысам после удаления волосяного покрова и обработки кожи настойкой йода и спиртом в стерильных условиях внутримышечно в область бедра вводился 1 мл взвеси суточной культуры стафилококка (2 млрд. микробных тел) и 0,25 мл 25% раствора сульфата магния. 48 животным инфицирование производили введением S. aureus с антилак-тоферриновой активностью (АЛфА+) и 48 животных — микробным штаммом стафилококка без аналогичной активности (АЛфА ). В работе использованы музейные микробы, полученные в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Сульфат магния применен в связи с тем, что помимо микроорганизмов, в образовании гнойного очага большое значение имеет наличие некробиотических тканей [7]. После получения экспериментальной модели гнойно-воспалительного очага производилась его хирургическая обработка в объеме, обеспечивающем удаление нежизнеспособных тканей. Оперативное вмешательство проводилось под общей анестезией. Далее у крыс основной группы в местном лечении ран использовали КВЧ-терапию, затем на рану наносилось 0,3 мл милиацила, накладывалась марлевая повязка. В I контрольной группе исследован характер течения гнойно-воспалительного процесса без лечебной коррекции. Во II контрольной группе лечение гнойно- воспалительного очага осуществля-
67
Группы крыс Стафилококк Медиана, интерквартильный размах. Сроки (в днях)
Очищение ран Появление грануляций Начало эпителизации Заживление
Первая контрольная группа (без лечения) АЛфА+ 11 [11; 12]* * (п=9) 10 [9; 11]** (п=9) 15,5 [15; 1б]**** (п=б) На 28 сутки не происходило заживления ран (п=б)
АЛфА- 9[9; 10]* (п=9) 8[8; 9]* (п=9) 14[13; 14]* (п=9)
Вторая контрольная группа (милиацил) АЛфА+ б[5;б]* (п=12) 5[5;б]* (п=12) )] * 14[12; 15]** (п=б) 13 [12; 15]*
АЛфА- 5[5;б]* (п=12) 5[5;б]* (п=12) 8[7;8]* (п=12) 12[12; 13] (п=9)
Третья контрольная группа (КВЧ-терапия) АЛфА+ 9[8; 9]**** (п=9) 8[8; 9]** (п=9) 12[12; 13]** (п=9) На 28 сутки не происходило заживления ран (п=б)
АЛфА- 8[8; 9]* (п=9) 7[б; 7]* (п=12) 9[9; 10]* (п=9)
Основная группа (милиацил и КВЧ-терапия) АЛфА+ 4[3; 4] (п=12) 4[3; 4] (п=12) б[б; 7] (п=12) 12[11; 12] (п=9) 12[11; 12]*
АЛфА- 4[3,5;4] (п=12) 4[3; 4] (п=12) б[5; б] (п=12) 11[11; 12] (п=9)
лось милиацилом, в III контрольной группе применяли КВЧ-терапию. В каждой группе взято по 24 крысы (12 инфи-цированых S. aureus АЛфА+ и 12 крыс — S. aureus АЛфА-).
В процессе исследования проведены клинические наблюдения за животными, выполнены морфологические исследования тканей из края
21-й и 28-й день лечения после забоя
крыс.
Местное течение патологического про-
но по клиническим признакам — срокам очищения гнойных ран от гнойно-некротического содержимого, срокам появления грануляций, краевой эпителиза-ции и заживления. Полученные объекты изучены на светооптическом уровне.
Полученные данные были обработаны с помощью программы «Statistica» v. 6.1 (StatSoft, USA, 1999). Проводилась проверка данных на соответствие нормальному закону распределения. Проверка нормальности распределений выполнялась визуально по графикам на вероятностной бумаге и наблюдающийся большой разброс точек говорит о том, что данные не соответствуют нормальному закону. Поэтому данные, полученные в результате исследования, анализировались с применением непараметрических методов статистики. Количественные признаки были подвергнуты статистической обработке путём подсчёта медианы и интерквартильного интервала. Для сравнительной характеристики независимых выборок в работе был использован непараметрический критерий Манна-Уитни. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез р=0,05.
Результаты и обсуждение
Результаты экспериментальных исследований, проведенных на 96 крысах, представлены в таблице 1. Данные таблицы свидетельствуют о высокой эффективности сочетанного применения милиацила и КВЧ-терапии в лечении гнойно-воспалительного процесса у крыс. Медиана сроков заживления гнойных ран на фоне аллоксанового диабета у крыс основной группы, леченных местно милиацилом и КВЧ-терапией составила 12 дней с интерквартильным интервалом [11; 12], что меньше аналогичных показателей 13 [12; 15] тех животных, у которых использовали только милиацил и у крыс, которым применяли КВЧ-терапию и лечение которым не проводилось (не заживали к 28 суткам).
Приведенные в таблице 1 данные также свидетельствуют о том, что в у крыс основной группы медиана сроков заживления гнойных ран равна 12 дней с интерквартильным интервалом [11; 12], инфицированных S. aureus АЛфА+ и для S. aureus АЛфА- аналогичные показатели составили 11 [ 11; 12]. Статистической значимости различий в сроках заживления не выявлено (р>0,05), что не отмечено в контрольных группах. Это
Результаты лечения гнойных ран крыс в зависимости от характера местного воздействия и свойств стафилококков
Таблица 1
Примечания:
* — статистическая значимость различий показателей от таковых основной серии (р<0,001); ** — статистическая значимость различий показателей от таковых основной серии (р<0,01); *** — статистическая значимость различий показателей от таковых основной серии (р<0,05);
* — статистическая значимость различий показателей в зависимости от штамма стафилококка (р<0,001); " — статистическая значимость различий показателей в зависимости от штамма стафилококка (р<0,01);
— различий показателей в зависимости от штамма стафилококка (р<0,05).
обусловлено значительным противовоспалительным и стимулирующим репаративную регенерацию тканей действием милиацила и КВЧ-терапии.
Данные клинических исследований полностью коррелировали с результатами, полученными при морфологическом исследовании. Гистологический анализ исследованных объектов у крыс I контрольной группы, которые не подвергались лечебной коррекции, выявил, что морфологические изменения в раневой области укладывались в картину общеизвестного течения раневого процесса (альтерация тканевых структур, экс-
Рис. 1. Область раневого дефекта через 7дней лечения
у крыс III контрольной группы.
Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина.
Окраска: гематоксилин-эозин.
Ув.: об. 10, ок.8.
68
Рис. 2. Эпителизация раневого дефекта через 7дней лечения у крыс основной группы. Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина. Окраска: гематоксилин-эозин. Ув.: об. 10, ок.20.
В воспалительном экссудате превалировали нейтро-фильные гранулоциты. Эпителиальные структуры в раневой области находились в состоянии деструкции, некробиоза без формирования пограничных «пиогенных мембран».
Экспериментальный гнойный процесс, вызванный золотистым стафилококком с антилактоферриновой активностью, носил более затяжной характер и характеризовался появлением значительных участков не-кротизированных тканей кожи и прилежащих мышц, наличием большого числа гранулоцитов, находящихся в состоянии дегенерации и цитолиза, по сравнению с раневым процессом крыс, вызванных золотистым стафилококком без антилактоферриновой активности.
На 7 день лечения гнойных ран милиацилом у крыс II контрольной группы отмечалась значительная пролиферация эпидермиса. Очаги альтерации были небольших размеров или отсутствовали. В очагах продуктивного воспаления обнаруживалось усиленное созревание фибробластов и волокнистых структур. Новообразование малодифференцированной грануляционной соединительной ткани приводило к мобилизации камбиальных элементов адвентициальных клеток, миоэпительных клеток желез кожи, базальных эпите-лиоцитов покровного эпителия, малодифференциро-ванных клеток волосяных фолликулов. К 14 дню раны подопытных животных заживали. В заживших ранах
была выражена типичная рубцовая ткань, представленная волокнистыми структурами, зрелыми клетками соединительной ткани — фиброцитами. Через 7 дней в области раневых дефектов крыс у крыс III контрольной группы выявлялась грануляционная ткань в разной степени созревания, на поверхности дефектов сохранялись некротические массы. Под некрозом в дерме отмечалась обильная воспалительная инфильтрация. Волокнистая ткань дермы сохранялась в виде небольших участков (рис. 1). Через 14 дней лечения в области раневых дефектов выявлялась грануляционная ткань, в толще которой имелись участки с различной степенью регенерации. В поверхностных отделах наблюдались очаги альтерации с эозинофильной инфильтрацией вокруг них. Через 21 день лечения ран наблюдалась значительная атрофия эпидермиса. В толще грануляционной ткани определялись лимфогистиоцитарные инфильтраты. Через 28 дней лечения в тканях краев раны обнаруживались разной величины некрозы. В глубоких отделах дермы выявлялась формирующаяся грануляционная ткань в разной степени созревания.
Сравнительные изучения тканевых структур гнойных ран в различных условиях воздействия показало большую лечебную эффективность сочетанного использования милиацила и КВЧ-терапии. В этих случаях усиливались лейкоцитарные и макрофагальные реакции, ускорялось купирование воспалительного процесса и отделение некротических масс. При использование милиацила и КВЧ-терапии возникали более благоприятные условия для последующей дифференцировки грануляционной ткани (рис. 2) и продолжающегося васкулогенеза. Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать заключение о высокой эффективности сочетанного местного применения в лечении гнойных ран на фоне аллоксанового диабета милиацила и КВЧ-терапии. Заживление гнойных ран у крыс основной группы были меньше по сравнению со II контрольной группой в 1,2 раза. У животных I и III контрольных групп раны не заживали к 28 суткам.
Таким образом, на основе структурно-функционального анализа биоптатов гнойных ран установлен феномен потенцирования противовоспалительного и регенераторного эффекта милиацила и КВЧ-терапии.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсут-
Прозрачность исследования. Исследование не имело спонсорской поддержки. Исследователи несут полную ответственность за предоставление окончательной версии рукописи в печать.
Декларация о финансовых и иных взаимодействиях. Все авторы принимали участие в разработке концепции и дизайна исследования и в написании рукописи. Окончательная версия рукописи была одобрена всеми авторами. Авторы не получали гонорар за исследование.
Работа поступила в редакцию: 30.12.2014 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блатун Л.А., Митиш В.А., Пасхалова Ю.С. и др. Рациональная системная антибактериальная терапия у больных сахарным диабетом и инфекционными процессами // Сахарный диабет и хирургические инфекции: материалы Международного научно-практического конгресса, посвященного 40-летию отдела ран и раневых инфекций Института хирургии им. A.B. Вишневского. — М., 2013. — С. 24-25.
2. Бордуновский В.Н., Тертышник С.С., Еремин И.В. Вакуумная терапия ран // Сборник научно-практических работ, посвященный 70-летию Южно-Уральской железной дороги и 60-летию Челябинской медицинской академии. — Челябинск, 2004. — С. 349-353.
3.Бухарин О.В., КурлаевП.П., ЧерновО.Л. Прогнозирование течения постинфекционных абсцессов с использованием математической модели // Хирургия. — 1999. — №7. — С. 46-48.
4. Валышева И.В. Антилактоферриновая активность микроорганизмов: автореф. дис.... канд. мед. наук — Оренбург,
5. Егоров В.А. Организационно-экономические исследования по обоснованию создания и внедрения в медицинскую практику новых отечественных фитопрепаратов антимикробного действия. — М., 2001. — 562 с.
Программированное орошение и дренирование в лечении больных с местной гнойной инфекцией мягких тканей. // Вестник хирургии. — 2000. — № 1. — С. 57-59.
7. Жадинский Н.В., Кондратенко ПП„ Руденко A.A. К механизму возникновения постинъекционных абсцессов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. —
8. Курлаев П.П. Роль факторов бактериальной персистенции в патогенезе, прогнозирование и обосновании выбора лечения больных гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей: автореф. дисс... д-ра мед. наук. — Оренбург,
9. Лохвицкий C.B. Хирургия гнойной раны стопы //
Хирургия. — 2001. — №3. — С. 34-35.
10. Нузов Б.Г. Комплексное лечение гнойных ран с использованием ненасыщенных жирных кислот и растительных стероидов (экспериментально-клиническое исследование): авто-реф. дис.... д-ра мед. наук. — М., 1991. — 43с.
11. Нузов Б.Г., Стадников А.А., Нузова О.Б. Оптимизация ре-паративной регенерации тканей. — М.: Медицина, 2012. — 200 с.
12. Оболенский В.Н. Хроническая рана: обзор современных методов лечения // Российский медицинский журнал. —
13. ОлафсонЛ.Е., Осадная Н.Д., Нузов Б.Г. Состав экстракта из просяной мучели // Пищевая промышленность. — 1989. —
14. Conley ]. Biofilm formation by group A streptococci: is there a relationship with treatment failure? // J. Clin. Microbiol. — 2003. — Vol 41, N 9. — P. 4043-4048.
15. Koseoglu H. Ultrastructural stages of biofilm development of Escherichia coli on urethral catheters and effects of antibiotics on biofilm formation // Urology. — 2006. — Vol. 68, N 5. — P. 942946.
REFERENCES
1.Blatun L.A., Mitish V.A., Paskhalova Yu.S., et.al. Rational systematic antibacterial therapy in patients with diabetes mellitus and surgical processes // Diabetes Mellitus and Surgical Infections: materials of the International scientific-practical congress devoted to the 40th anniversary of the Department of Wounds and Wound Infections of the Institute of Surgery named after A.V. Vishnevsky. — Moscow, 2013. — P. 24-25. (in Russian)
2. Bordunovskij V.N., Tertyshnik C.C., Yeremin I.V. Vacuum therapy of wounds // Collection of scientific-practical works devoted to the 70th anniversary of the South-Urals Railways and the 60th anniversary of the Chelyabinsk Medical Academy. — Chelyabinsk, 2004. — P. 349-353. (in Russian)
3. Bukharin O. V., Kurlaev P.P., Chernov O.L. Prognostication of the course of post-infectious abscesses by means of mathematical modeling // Khirurgiya. — 1999. — № 7. — P. 46-48. (in Russian)
4. Valysheva I.V. Antilactoferrin activity of microorganisms: Thesis PhD. — Orenburg, 2005. — 24 p. (in Russian)
5. Yegorov V.A. Organizational and economic studies to substantiate the creation and practical introduction of new, home-produced, antimicrobial phyto-preparations. — Moscow, 2001. — 562 p. (in Russian)
6. Yepifanov M.V., Yusupov Yu.N., Danilin V.N. Programmed irrigation and drainage use in the treatment of patients with local purulent infection of soft tissues. // Vestnik Khirurgii. — 2000. —
7. Zhadinsky N.V., Kondratenko G.P., Rudenko A.A. On the mechanism of post-injection abscesses occurance // Zhurnal
mikrobiologii, epidemiologii i immunologii. — 1989. — P. 80-83. (in Russian)
8. Kurlaev P.P. 'tte role of factors of bacterial persistence in pathogenesis, prediction and substantiation of treatment choice of patients with purulent — inflammatory diseases of soft tissues: Thesis DSc. — Orenburg, 2001. — 35 p. (in Russian)
9. Lokhvitsky S.V. Surgery of purulent wounds on foots // Khirurgiya. — 2001. — №3. — P. 34-35. (in Russian).
10. Nuzov B. G. Complex treatment of purulent wounds applying unsaturated fatty acids and vegetable steroids (experimental-clinical study): Thesis DSc. — Moscow, 1991. — 43 p. (in Russian).
11. Nuzov B.G., Stadnikov A.A., Nuzova O.B. Optimization of reparative tissues regeneration — Moscow: Meditsina, 2012. — 200 p. (in Russian)
12. Obolensky V.N. Chronic wounds: survey of modern treatment methods // Rossiyskiy Meditsinskiy Zhurnal. — 2013. —
13. Olifson L.E., Osadchaya N.D., Nuzov B.G. Composition of millet waste meal // Pishchevaya promyshlennoct'. — 1989. — №
14. Conley J. Biofilm formation by group A streptococci: is there a relationship with treatment failure? // J. Clin. Microbiol. —
15. Koseoglu H. Ultrastructural stages of biofilm development of Escherichia coli on urethral catheters and effects of antibiotics on biofilm formation // Urology. — 2006. — Vol. 68, N 5. — P. 942946.
e-mail: stydenikinl8@rambler.ru; Нузова Ольга Борисовна — д.м.н., профессор кафедры факультетской хирургии, e-mail: nuzova_27@mail.ru; Стадников Александр Абрамович — д.б.н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, e-mail: k_histology@orgma.ru, тел. (3532) 772275.
Information About the Authors: Studenikin Alexander Viktorovich — postgraduate student at the Department of Faculty Surgery, e-mail: stydenikinl8@rambler.ru; Nuzova Olga Borisovna — MD, PhD, DSc, Professor of the Department of Faculty Surgery, e-mail: nuzova _27@mail.ru; Stadnikov Alexander Abramovich — MD, PhD, DSc, Professor, Honoured Scientist of the Russian Federation, Head of the Department of Histology, Cytology and Embryology, e-mail: k_histology@
orgma.ru, (3532) 772275.
© ТЫЖИГИРОВА B.B. — 2015 УДК 615.281.8-073.585
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ТЕСТА «РАСТВОРЕНИЕ» ДЛЯ ТАБЛЕТОК РИМАНТАДИНА
Валентина Викторовна Тыжигирова (Иркутский государственный медицинский университет, ректор — д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра фармацевтической и токсикологической химии, зав. — д.х.н., проф. Е.А. Илларионова)
Резюме. Разработана методика определения римантадина в среде растворения фотометрическим методом. Проведенные валидационные исследования показывают ее пригодность для оценки качества таблеток римантадина по тесту «Растворение».
Ключевые слова: римантадин, тест «Растворение», фотометрическое определение, валидация.
DEVELOPMENT AND VALIDATION OF DISSOLUTION PROCEDURE FOR RIMANTADINE TABLETS
V.V. Tyzhigirova (Irkutsk State Medical University, Russia)
Summary. ^e method of determination of rimantadine in the dissolution medium by the photometric method has been developed. ^e performed validation studies indicate its adaptability for assessing the quality of rimantadine tablets by "dissolution" test.
Key words: rimantadine, dissolution test, photometric determination, validation.
70
