CC BY
62. Ендальцева С.М. // Журн. неврологии и психиатрии. 2008. № 2. С. 14—17.
3. Ермолов А.С., Епифанова Н.М., Ромасенко М.В. и др. // Анестезиология и реаниматология. 1998. № 6.
С. 16—19.
4. Ефуни С.Н. // Клин. мед. 1988. Т. 66, № 9. С. 51—57.
5. Куценко С.А. Основы токсикологии. С.-Пб: Фолиант, 2004.
6. Лужников Е.А. // Клиническая токсикология: Учебник / Е.А. Лужников, Г.Н. Суходолова. М.: ООО «Мед. инф. агентство», 2008. С. 514—523.
7. Лужников Е.А. // Острые отравления у взрослых и детей / Е.А. Лужников, Г.Н. Суходолова. М.: ЭК-
СМО, 2009. С. 452—465.
8. Лужников Е.А. Неотложные состояния при острых отравлениях / Е.А. Лужников, Ю.Н. Остапенко, Г.Н. Суходолова. М.: Медпрактика-М, 2001.
9. Остапенко Ю.Н., Литвинов Н.Н., Батурова И.В. и др. // 3-й Съезд токсикологов России: Тезисы докладов (Москва, 2—5 декабря 2008). М., 2008. С. 22—24.
10. Отравления ингаляционные монооксидом углерода (угарным газом) // Клин. рекомендации. Стандарты ведения больных. Вып. 2. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. С. 676—680.
11. Полозова Е.В., Шилов В.В., Кузнецов О.А. // Эфферентная терапия. 2009. № 3—4. С. 35—40.
12. Полозова Е.В., Шилов В.В., Андрианов А.Ю. // Вестн. Военно-мед. академии. 2008. № 3. С. 166—167.
13. Рябов Г.А. Гипоксия критических состояний. М.,
1988.
14. Тиунов Л.А., Кустов В.В. // Токсикология окиси углерода. М.: Медицина, 1980. С. 75—92.
15. Шафран Л.М., Леонова Д.И., Пресняк И.С. и др. // 3-й Съезд токсикологов России: Тезисы докладов (Москва, 2—5 декабря 2008). М., 2008. С. 340—342.
16. Шилов В.В., Сосюкин А.Е., Калмансон М.Л. // Вестн. Рос. Военно-мед. академии. 2008. № 1. Приложение. С. 144—146.
Поступила 11.01.12
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Шилов Виктор Васильевич,
руководитель отдела клинической токсикологии, докт. мед. наук, профессор. E-mail: vshilov@inbox.ru Васильев Сергей Анатольевич,
ст. научн. сотрудник отдела клинической токсикологии, докт. мед. наук. E-mail: sergey.a.vasilyev@ gmail.com Кузнецов Олег Анатольевич,
врач анестезиолог-реаниматолог отделения реанимации и интенсивной терапии № 3 (токсикология). Тел.
(812) 709-61-28.
Батоцыренов Баир Васильевич,
врач анестезиолог-реаниматолог отделения реанимации и интенсивной терапии № 3 (токсикология), докт. мед. наук. E-mail: bbair@mail.ru Лоладзе Александр Тариэлович,
врач анестезиолог-реаниматолог отделения реанимации и интенсивной терапии № 3 (токсикология).
Тел.: (812) 709-61-28.
УДК 616.94:546.265.1:616.155.1
Т.В. Момот1, Е.С. Другова2, Н.Ф. Кушнерова2, С.Е. Фоменко2
профилактика интоксикации сероуглеродом на липидную составляющую мембран эритроцитов в эксперименте
1 Учреждение РАН «Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского» ДВО РАН, г. Владивосток; 2 Учреждение РАН «Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева» ДВО РАН, г. Владивосток
Показано, что профилактическое введение экстракта из калины «Калифен» до интоксикации и в период интоксикации сероуглеродом способствовало сохранению липидной составляющей мембран эритроцитов крыс.
Ключевые слова: сероуглерод, эритроциты, нейтральные липиды, фосфолипиды, профилактика, растительные полифенолы, калифен.
T.V. Momot, E.S. Drugova, N.F. Koushnerova, S.E. Fomenko. Prophylaxis of carbon bisulphide poisoning effects on lipid component of RBC membrane in experiment
1 Institution of the Russian academy of sciences A.V. Zhirmunsky institute of marine biology
FEBRAS
2 Institution of the Russian academy of sciences V.I. Ilichev's pacific oceanological institute FEBRAS
Preventive injection of "Kalifen" extract of high cranberry before and during intoxication with carbon bisulphide appeared to preserve lipid component of RBC membrane in rats.
Keywords: carbon bisulphide, RBC, neutral lipids, phospholipids, prophylaxis, vegetable polyphenols, kalifen.
В настоящее время наиболее стабильной отраслью экономики является газоперерабатывающая промышленность. При довольно высоком уровне автоматизации и механизации технологических процессов на данных производствах имеются отдельные операции, выполнение которых связано с интенсивным загрязнением рабочей зоны вредными веществами [11]. Одним из распространенных токсикантов на таком производстве является сероуглерод (CS2) [9]. Основным путем проникновения данного токсического вещества в организм является ингаляционный. Сероуглерод депонируется жировыми тканями, в меньшей степени — периферическими нервами, головным мозгом, паренхиматозными органами. Отравление токсикантом характеризуется проявлением психиатрических и неврологических симптомов (изменение настроения, психоз, галлюцинации, раздражительность, желудочно-кишечные расстройства) [21]. В качестве основного поражающего агента при интоксикации сероуглеродом является как сам токсикант, так и продукты его метаболизма в организме — сульфаты, окисленные и эфиросвязанные фракции серы. Накопление окисленных форм серы с их дальнейшей диссоциацией, в свою очередь, способствует усилению как радикального повреждения, так и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах [8]. В связи с тем что антирадикальная и антиоксидантная системы защиты организма не рассчитаны на длительный уровень воздействия, то происходит истощение и срыв защитных механизмов. Поэтому влияние химических факторов способствует накоплению в организме своеобразного «биохимического груза» в виде метаболических и структурно-функциональных изменений биомембран. Известно, что мембрана эритроцитов является универсальной интегрально-модулирующей клеточной системой организма. Следовательно, изучение липидной составляющей их мембран является тонким показателем, определяющим состояние мембран других клеток органов и тканей на уровне целого организма [6].
Для решения такой кардинальной проблемы как сохранение здоровья и профилактики повреждающего действия при профессиональном контакте с химическими загрязнителями необходимо систематическое применение компонентов, защищающих организм от агрессивного действия
ксенобиотиков и способствующих устранению нарушений, ими вызванных. Одним из перспективных подходов является использование биологически активных добавок (БАД) растительного происхождения, содержащих комплексы полифенолов. Полифенольные соединения, в частности флавоноиды, являются высокоактивными соединениями, обладающими антиоксидантной и антирадикальной активностью. Они способны подавлять перекисные процессы, выступая как «ловушки» свободных радикалов, блокируя дальнейшее развитие свободно-радикальных реакций [18]. К таким БАД относится экстракт «Калифен»™ (свидетельство на товарный знак № 228327), выделенный из калины (Viburnum sargentii Koehne) и запатентованный как средство, обладающее антирадикальной активностью (патент № 2220614) и биологически активная добавка к пище (патент № 2199249). В составе экстракта содержится широкий диапазон поли-фенольных соединений: флавонолы, катехины, лейкоантоцианы, проантоцианидины, таннины, лигнин и др., которые составляют свыше 60% сухого остатка экстракта.
Целью работы явилось исследование липид-ной составляющей мембран эритроцитов крыс в условиях интоксикации сероуглеродом и возможность использования БАД «Калифен»™ как профилактического средства для ее сохранения.
М а т е р и а л ы и м е т о д и к и. Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180 — 200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Для интоксикации сероуглеродом животных помещали в специальную затравочную камеру, сконструированную по типу камер Б.А. Курляндского [5], в условиях относительной влажности воздуха (40—60 %), заданных параметров температуры (20—22°С), с автономной системой очистки и регенерации воздуха. Концентрация сероуглерода в камере поддерживалась на уровне 1,0 мг/м3, что соответствует ПДК для концентрации сероуглерода в воздухе рабочей зоны (ГОСТ 12.1.005—88; ГН 2.2.5.1313—03). Расход пропускаемого через камеру воздуха и сероуглерода составлял не менее 10 л/мин. Время воздействия составляло 6 ч в сутки на протяжении 3 недель в монотонном режиме, кроме выходных дней, и определялось исходя из конкретных параметров моделирования условий труда на производстве.
Экстракт из калины «Калифен»™ готовили из высушенного отжима после отделения сока калины (кожица, косточки, оси соцветий) с использованием в качестве экстрагента 40 % этиловый спирт. В процессе многократной пер-коляции из 1 кг сырья выход экстракта составлял 1 л. Полученный водно-спиртовый экстракт (40 %) относится к малотоксичным (DL50 = 48,6 мл/кг) для организма животных (крысы линии Вистар). Химический состав препарата был исследован с помощью жидкостного хроматографа «Controller LCC 500» (Pharmacia). Готовый экстракт «Калифен»™ освобождали от спирта путем упаривания в вакууме, затем доводили дистиллированной водой до концентрации общих полифенолов 100 мг в 2 мл раствора. Выбор дозировки введения экстракта осуществлялся исходя из оптимальных терапевтических доз, разработанных на крысах и мышах при введении в желудок, и составлял для растительных полифенольных гепатопротекторов — 100 мг/кг массы животного [2]. В связи с этим полученный водный раствор полифенольных комплексов из калины вводили животным внутрижелудочно в количестве 0,2 мл на 100 г массы 1 раз в сутки.
Части животных до интоксикации сероуглеродом в течение 3 нед вводили внутрижелудочно через зонд калифен в эффективной терапевтической дозе. Другой части животных вводили внутрижелудочно калифен до интоксикации (3 нед) и в течение всего периода интоксикации (3 нед). Контролем служили животные, находящиеся в стандартных условиях вивария. Таким образом, в ходе эксперимента были выделены следующие группы животных по 10 крыс в каждой: 1-я — контроль (интактные); 2-я — интоксикация сероуглеродом в течение 3-х нед;
3-я — введение калифена в течение 3-х нед с последующей интоксикацией сероуглеродом;
4-я — введение калифена в течение 3-х нед до интоксикации сероуглеродом и в период интоксикации в течение 3-х нед. Крыс выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом, с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов (Страсбург, 1986).
Выделение эритроцитов из гепаринизирован-ной крови и получение их мембран осуществляли согласно методическому руководству Т.П. Новгородцевой и соавт. [7]. Экстракцию общих липидов из эритроцитарных мембран проводили по методу J. Folch et al. [14]. Фракции фосфоли-пидов (ФЛ) разделяли методом двумерной микротонкослойной хроматографии на стеклянных
пластинках 6х6 см с суспензией силикагеля и гипса [19]. В качестве разделяющих систем использовали смеси растворителей, разработанные G. Rouser et al. [17]. Идентификацию фосфоли-пидных фракций на хроматограммах проводили с помощью специфических реактивов [10], а их количественное определение по методу V. Vas-kovsky et al. [20]. Для разделения нейтральных липидов (НЛ) использовали одномерную микротонкослойную хроматографию на силикагеле в системе растворителей, разработанных J. Amenta [13]. Визуализацию пятен нейтральных липидов осуществляли в йодной камере, а их идентификацию с помощью коммерчески доступных очищенных стандартов. Количественное содержание отдельных фракций выражали в процентах от суммы НЛ и ФЛ, соответственно.
Результаты обрабатывали по параметрическому критерию Стьюдента (t), используя статистическую программу Instat (GraphPad Software Inc. USA, 2005).
Р е з у л ь т а т ы. Интоксикация крыс сероуглеродом в течение 3-х нед (2-я группа) сопровождалась рассогласованием компонентов липидной составляющей мембран эритроцитов по сравнению с контрольной группой. Отмечалось снижение количества общих фосфолипидов на 20 % (р < 0,001), что составляло 50,38 ± 1,54 % против 62,74 ± 1,22 % в контроле. При исследовании соотношения фракций нейтральных липидов следует отметить увеличение количества холестерина (ХС) на 25 % (р < 0,01), в связи с чем увеличился коэффициент ХС/ФЛ до 0,57 ± 0,01 (в контроле 0,37 ± 0,02; р < 0,001), который свидетельствует о повышении жесткости мембраны и снижении ее лабильности [12]. Этот феномен может означать активизацию в мембране эритроцитов адаптационных процессов, направленных на ее стабилизацию, за счет увеличения содержания ХС. Одновременно отмечалось увеличение триацилглицеринов (ТАГ) на 31 % (p < 0,001) и свободных жирных кислот (СЖК) на 23 % (p < 0,001). Это обусловлено стрессовой реакцией на токсический агент, сопровождающейся активацией липолиза в жировой ткани и разбалансировкой в соотношении липидов в составе липопротеинов крови (источники липидов для мембран эритроцитов) из-за поражения печени.
Изменения в фосфолипидном спектре мембран эритроцитов после интоксикации сероуглеродом проявлялись в увеличении лизофос-фатидилхолина (ЛФХ) на 27 % (p < 0,001) и снижении основного структурного компонента клеточной мембраны фосфатидилхолина (ФХ)
на 5 % (р < 0,05) относительно контрольной группы, что определяет повышение проницаемости мембран. Известно, что такая деградация ФЛ обусловлена резкой активацией фосфоли-пазы А2 под действием токсиканта и продуктов его метаболизма [15]. Однако компенсаторной реакцией на повышение проницаемости мембран эритроцитов явилось увеличение количества сфингомиелина (СМ) на 26 % (р < 0,01). Обращает на себя внимание разбалансировка в соотношении метаболически активных фракций фосфолипидов в сторону снижения их концентраций. Так, количество фосфатидилинозита (ФИ) снизилось на 28 % (р < 0,001), а количество фосфатидной кислоты (ФК) на 46 % (р < 0,001), что обусловливает угнетение активности мембраносвязанных ферментов, таких как глю-козо-6-фосфатдегидрогеназа и №+-К+-АТФаза [1], являющихся жизнеобеспечивающими функциональные свойства эритроцитов.
При профилактическом введении калифена в течение 3-х нед до интоксикации сероуглеродом (3-я группа) в мембранах эритроцитов отмечалось снижение по сравнению со 2-й группой количества СЖК на 17 % (р < 0,01) и ТАГ на 23 % (р < 0,01). При этом возросло содержание эфирных фракций: ЭЖК на 19 % (р < 0,001), ЭХС на 63 % (р < 0,001). Количество ХС снизилось на 16 % (р < 0,001) при одновременном увеличении общих ФЛ на 15 % (р < 0,001), что обусловило снижение коэффициента ХС/ ФЛ до 0,42 ± 0,02. То есть профилактическое введение экстракта снимало состояние токсического стресса.
При сравнении величин фосфолипидных фракций в эритроцитарных мембранах крыс 3-й группы с таковыми во 2-й группе также наблюдались статистически достоверные различия. Так, количество ФХ увеличилось на 5 % (р < 0,05) при одновременном снижении ЛФХ и СМ, в среднем, на 15 % (р < 0,01—0,001). Следует отметить более высокие величины метаболически активных фракций: на 22 % (р < 0,01) выше количество ФИ, на 59 % (р < 0,001) — ФК. То есть, предварительное введение калифена до интоксикации CS2 сопровождалось снижением активности фосфолипазы А2 и сохранением липидной составляющей мембран эритроцитов. Однако при сравнении количественных характеристик липидов эритроцитарных мембран крыс 3-й группы с таковыми в контроле (1-я группа) следует отметить, что не все показатели нормализовались. Остался достоверно пониженным уровень общих ФЛ (на 8 %, р < 0,05) и ФИ (на 12 %, р < 0,001), а повышенным — коэф-
фициент соотношения ХС/ФЛ (на 14 %, р < 0,05), ЭЖК (на 12 %, р < 0,001) и ЛФХ (на 9 %, р < 0,05).
В следующей серии экспериментов по профилактическому применению калифена мы исследовали его влияние до- и в период интоксикации CS2 (4-я группа), то есть на модели, наиболее приближенной к условиям применения БАД человеком, находящимся в условиях вредного воздействия токсиканта. При сравнении полученных величин относительно 2-й группы (интоксикация CS2) отмечались достоверные отличия. Так, количество общих ФЛ возросло на 25 % (р < 0,001), а количество ХС снизилось на 20 % (р < 0,001), что сохранило коэффициент ХС/ФЛ на уровне контроля (0,37 ± 0,01). При этом количество ТАГ было ниже на 26 % (р < 0,01), а количество СЖК на 22 % (р < 0,01) при одновременном увеличении количества ЭЖК на 41 % (р < 0,001).
Сравнение величин фосфолипидных фракций в мембранах эритроцитов крыс 4-й группы с таковыми во 2-й группе показало, что у первых количество ФХ было выше на 6 % (р < 0,05), а СМ и ЛФХ ниже на 10 и 18 % (р < 0,05—0,001), соответственно. При этом количество ФИ отличалось от такового во 2-й группе в сторону увеличения на 40 % (р < 0,05), а ФК на 80 % (р < 0,001). Сравнивая показатели липидной составляющей мембран эритроцитов крыс 4-й группы с контрольными величинами, следует отметить их полную сопоставимость, то есть профилактическое введение калифена оказало выраженный нормализующий эффект.
Таким образом, профилактическое введение калифена как до интоксикации сероуглеродом, так и в период до и во время интоксикации спо -собствовало восстановлению липидной составляющей мембран эритроцитов. Биохимический механизм данного феномена обусловлен тем, что полифенолы ингибируют активность фосфоли-паз [16], что способствует снижению уровня лизофракций фосфолипидов в мембранах эритроцитов и восстановлению их проницаемости. Снижение уровня холестерина можно объяснить тем, что молекулы полифенолов активируют фермент лецитин : холестерин-ацилтрансферазу (ЛХАТ) [3], который обусловливает выведение холестерина из мембран и поступление в гепатоцит возросшего потока холестерина в этерифицированной форме в составе липопроте-инов высокой плотности. Сохранение липидной составляющей мембран эритроцитов при профилактическом приеме калифена также можно объяснить тем, что полифенолы встраиваются
как в наружный, так и во внутренний монослои липидного бислоя мембран и, являясь ловушками свободных радикалов, защищают их фосфо-липиды от атаки как свободных радикалов, так и супероксиданионов [4].
В ы в о д ы. 1. Интоксикация сероуглеродом в течение 3 нед сопровождается выраженными нарушениями в соотношении нейтральных и фосфолипидных фракций мембран эритроцитов крыс. 2. Профилактическое применение экстракта из калины «Калифен»™ как до интоксикации сероуглеродом, так и в период до и в течение интоксикации способствует снятию токсического стресса и сохранению липидной составляющей мембран эритроцитов крыс. 3. Эффективность профилактического применения экстракта из калины «Калифен»™ до и в период интоксикации сероуглеродом превосходит таковую от его применения только в период до интоксикации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бурлакова Е.Б. // Липиды. Структура, биосинтез, превращения и функции: Сб. науч. трудов / Под ред. С.Е. Северина. М.: «Наука», 1977. С. 16—27.
2. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. // Ведомости фарм. комитета. 1999. № 2. С. 9—12.
3. Гаскина Т.К., Курилович С.А., Горчаков В.Н. // Вопр. мед. хим. 1989. Т. 35, № 4. С. 24—28.
4. Куркин В.А., Рыжов В.М., Бирюкова О.В. и др. // Хим.-фарм. журнал. 2009. Т. 43, № 2. С. 33—42.
5. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия) / И.В. Саноцкий. М.: Медицина, 1970.
6. Модификация состава жирных кислот крови при сердечно-сосудистых заболеваниях / Э.А. Эндакова, Т.П. Новгородцева, В.И. Светашев. Владивосток: Дальнаука, 2002.
7. Руководство по методам исследования параметров системы «Перекисное окисление липидов — антиокси-дантная защита» в биологических жидкостях / Т.П. Нов-городцева, Э.А. Эндакова, В.И. Янькова. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2003.
8. Сетко Н.П. // Гиг. и сан. 1998. № 2. С. 17—18.
9. Сетко Н.П., Бейлин С.М. // Мед. труда. 2008. № 7. С. 19—24.
10. Техника липидологии / М. Кейтс. М.: Мир, 1975.
11. Тимашева Г.В., Валеева О.В. // Мед. труда. 2009. № 11. С. 20—23.
12. Холистериноз / Ю.М. Лопухин, А.И. Арчаков, Ю.А. Владимиров, Э.М. Коган. М.: Медицина, 1983.
13. Amenta J.S. // J. Lipid Res. 1964. Vol. 5, N 2. P. 270—272.
14. Folch J., Less M, Sloane-Stanley G.H. // Biol. Chem. 1957. Vol. 226. P. 497—509.
15. Kabarowski H.S., Xu Y, Witte O.N. // Biochem. Pharmacol. 2002. Vol. 64. P. 161—166.
16. Kropacova K., Misurova E., Hakova H. // Radiats. Biol. Radioecol. 1998. Vol. 38, N 3. P. 411—415.
17. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. // Lipid chromatogr. Anal. N.-Y.: Dekker. 1967. Vol. 1. P. 99—162.
18. Sanz M.J., Ferrandiz M.L., Cejudo M. et al. // Xenobiotica. 1994. Vol. 24, N 7. P. 689—699.
19. Svetachev V.I., Vaskovsky V.E. // J. Chromatography. 1972. Vol. 67, N 2. P. 376—378.
20. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M. // Ibid. 1975. Vol. 114, N 1. P. 129—141.
21. Wronska-Nofen T., Halatek T., Wisniewska-Knypl A. // Arch. Toxicol. 2002. Vol. 76. P. 152—157.
Поступила 21.06.11
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Момот Татьяна Викторовна,
научн. сотрудник Учреждения РАН «Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского» ДВО РАН, канд. мед. наук. E-mail: natasha50@mail.ru Другова Елена Сергеевна,
мл. научн. сотрудник Учреждения РАН «Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева»
ДВО РАН. Тел.: 8 (423) 231-30-61.
Кушнерова Наталья Федоровна,
профессор Учреждения РАН «Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева» ДВО РАН, докт. биол. наук. Тел.: 8 (423) 231-30-61. Фоменко Светлана Евгеньевна,
ведущий научн. сотрудник Учреждения РАН «Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева» ДВО РАН, канд. биол. наук. Тел.: 8 (423) 231-30-61.
