CC BY
19и юл ь
- АВГУСТ 2О 1 1
УДК 546.174:582:57.02
Влияние интоксикации окислами азота на физиолого-метаболические характеристики эритроцитов и профилактика нарушений растительными полифенолами
Показана возможность восстановления мембран эритроцитов, поврежденных окислами азота, с помощью препарата «Калифен», выделенного из калины (УтЬитыт эа^епШКоескпе) и экстракта элеутерококка. Биологически активная добавка калифен позволяет нормализовать соотношение индивидуальных липидных компонентов в мембранах эритроцитов, средний объем и диаметр. Восстановление липидных компонентов мембран эритроцитов обусловило нормализацию их осмотической резистентности и повышение гемолитической устойчивости.
Ключевые слова: окислы азота, эритроциты, калифен, элеутерококк, липиды
Кушнерова Н.Ф.1, Фоменко С.Е1., Кушнерова Т.В. 2
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН, г Владивосток; 2Инсттут биологии моря
им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, г Владивосток.
Введение. Стремительные темпы развития промышленного производства, химизация народного хозяйства ведут к появлению во внешней среде большого количества разнообразных химических соединений, постоянно загрязняющих биосферу и пагубно влияющих на живой организм. Основными антропогенными источниками, содержащими окислы азота (гидратированные формы азотной и азотистой кислот, нитрат- и нитрит-ионы, перокси-нитриты), являются процессы горения при температуре выше 1000оС (автотранспорт, стационарные источники). Это наиболее распространенные загрязнители атмосферного воздуха, относящиеся к классу высоко опасных химических веществ. Известно, что при воздействии химических, физических и других факторов на биомембраны происходит изменение их конформационных состояний с кооперативными переходами между ними [5]. В результате структурных перестроек происходит изменение каталитической активности многих мембраносвязанных ферментов, процессов проницаемости и транспорта ионов и других соединений [4]. Установлено, что длительный контакт с ни-трогазами приводит к снижению содержания эритроцитов, достоверному повышению гематокрита, среднего клеточного объема эритроцитов, анизоцитозу и ретикулоцитозу, а также к увеличению проницаемости их мембран [6]. Вместе с тем, изучение эритроцитов как модели для исследования химической нагрузки на биомембраны не получило должного развития.
В настоящее время остро стоит вопрос разработки медицинских технологий защиты организма человека от воздействия вредных химических веществ техно- и антропогенного происхождения. Одним из способов является профилактическое использование растительных препаратов, содержащих комплексы биологически активных полифенолов, обладающих способностью гасить свободно-радикальные реакции [17]. Ранее нами были опубликованы данные, свидетельствующие о широком спектре биологической активности растительных биологически активных добавок (БАД), выделенных из отходов от переработки дикорастущих видов Дальневосточной тайги, благодаря проявлению ими антиоксидантных, мембрано- и гепатопро-текторных, антирадикальных свойств [8]. В связи с этим была создана и предлагается к употреблению биологически-активная добавка к пище «Калифен» (патент RU № 2199249, ТУ 9168-079-00480052-07, свидетельство на товарный знак RU № 228327), которая была выделена из калины Саржента (Viburnum sargentii Koehne). Химический состав препарата был исследован с помощью жидкостного хроматографа «Controller LCC 500» (Pharmacia) [11]. Калифен - водно-спиртовый (40%) экстракт, который представляет собой композицию различных классов веществ: лейкоантоцианов, катехинов и их полимерных форм, оли-гомерных таннинов, лигнина, флавонолов, органических кислот (фумаровой, аскорбиновой, глицериновой, галак-туроновой и др.), свободных аминокислот (гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, треонина, серина, глицина, цистеина, метионина, изолейцина, тирозина и др.), сахаров (сахарозы, рафинозы) и других органических соединений. Полифенолы составляют свыше 60% сухого остатка экстракта. В качестве препарата сравнения использовали «Экстракт элеутерококка», защитное действие которого при гипоксии связывают с регулирующим влиянием на углеводный и пластический обмен [9].
Целью работы явилось изучение профилактического влияния калифена и элеутерококка при моделировании у животных интоксикации окислами азота.
Материалы и методы исследования. Эксперимент проводили на крысах самцах Вистар массой 180-200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Ингаляционное воздействие окислами азота осуществляли в затравочной камере, сконструированной по типу камер Б.А. Курляндского. Животных помещали в условия относительной влажности воздуха (40-60%), заданных параметров температуры (20-220С), с автономной системой очистки и регенерации воздуха. Концентрация окислов азота в камере поддерживалась на уровне 4,0 мг/м3, что соответствует ПДК для паров окислов азота в воздухе рабочей зоны (ГН 2.2.5.1313-03). Ингаляцию осуществляли в течение 6 мин. Схема эксперимента заимствована из работы А.В. Кропотов и соавт. [7]. Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс в каждой: 1-я группа (контроль) - интактные животные; 2-я - интоксикация окислами азота; 3-я - профилактическое введение калифена в течение 14 дней до интоксикации окислами азота, с последующей интоксикацией в течение 6 мин, 4-я - профилактическое введение элеутерококка в течение 14 дней до интоксикации окислами азота с последующей интоксикацией в течение 6 мин. Водные растворы сухого остатка из калифена и элеутерококка (предварительно освобожденные от спирта экстракты путем упаривания в вакууме) вводили внутри-желудочно в количестве 0,4 мл, что соответствовало 100 мг/кг массы тела общих полифенолов. Доза в 100 мг/кг соответствует известной терапевтической дозе для полифе-нольных гепатопротекторов [2]. Крыс выводили из эксперимента через 60 мин после интоксикации окислами азота методом декапитации под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986).
Кровь для исследований собирали из шейной вены животных в пробирку с 1% раствором гепарина. Гепарин готовили из расчета 0,02 мл раствора на 1 мл крови. В мазках крови, окрашенных азур-эозиновой смесью, с помощью окуляр-микрометра определяли средний диаметр эритроцитов. Средний объем эритроцитов и осмотическую резистентность к снижению концентраций №С1 определяли по общепринятым методам. Для выделения эритроцитов гепаринизированную кровь центрифугировали 10 мин при 3000 g, затем эритроциты отмывали 0,9% раствором №С1 и осаждали центрифугированием [10]. Для получения эритроцитарных мембран эритроциты помещали в дистиллированную воду, где происходил их гемолиз. Затем центрифугировали 10 мин при 3000 g, супернатант удаляли [10]. Липидные экстракты из эритроцитарных мембран готовили по методу [14]. Общие фосфолипиды определяли по методу [19]. Приготовление хроматографи-ческих пластинок проводили по методу [18]. Хроматогра-фическое распределение нейтральных липидов проводили на стеклянных пластинках (6х6 см) методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей гексан : серный эфир : уксусная кислота в соотношении 90:10:1 (об/об). Идентификацию пятен липидов проводили с помощью очищенных препаратов отечественного производства. Количественное определение фракций нейтральных липидов выполняли по методу [12]. После хроматографирования стандарты и пробы обнаруживали парами йода. Идентифицированные фракции с пластинок специальным шпателем переносили в пробирки, добавляли в них по 2 мл бихроматного реактива (2,3 г бих-ромата калия растворяли в 14 мл дистиллированной воды
и доводили полученный раствор до 1 л концентрированной серной кислотой) и нагревали на кипящей водяной бане 15 минут. В охлажденные пробы добавляли по 4 мл дистиллированной воды, перемешивали и центрифугировали при 3000 об./мин в течение 10 минут. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре при длине волны 440 нм. Результаты выражали в % от суммы всех фракций.
Результаты обрабатывали по параметрическому критерию Стьюдента (t), используя статистическую программу Instat (Graph Pad Software Inc.USA).
Результаты и обсуждение.Выживаемость животных после интоксикации окислами азота составляла 40%, тогда как предварительное введение калифена или элеутерококка способствовало выживаемости 60-70% животных.
При исследовании среднего диаметра эритроцитов (СДЭ) и их среднего объема (СОЭр) после интоксикации окислами азота отмечались однонаправленные изменения в сторону увеличения. Так, СДЭ превышал контрольные значения на 27% (7,62 ±0,04 мкм против 6,00±0,02 мкм в контроле; р<0,001), а СОЭр в два раза (88,50±2,76 мкм3 против 43,20±0,80 мкм3; р<0,001). Сдвиг порога начала гемолиза эритроцитов до 0,75±0,02% NaCl и окончания гемолиза при концентрации NaCl 0,70±0,02% (в норме гемолиз эритроцитов начинается при концентрации 0,45% NaCl, заканчивается - 0,35% NaCl) свидетельствует о том, что мембрана эритроцитов обладает пониженной устойчивостью к гемолизирующему агенту. На 35% (р<0,001) снизилось количество общих фосфолипидов (ФЛ) в эритроцитах (40,28±1,82% против 61,91±1,36% в контроле). При исследовании содержания холестерина (ХС) было обнаружено его увеличение на 33% (р<0,01) (Табл.). В связи с этим увеличился коэффициент ХС/ФЛ до 0,74±0,03 (в контроле 0,36±0,01), который свидетельствует о повышении жесткости мембран и снижение их лабильности.
В составе нейтральных липидов эритроцитарных мембран после интоксикации окислами азота относительно контрольных значений отмечалось достоверное увеличение триацилглицеринов (ТАГ) на 40% (р<0,001) и свободных жирных кислот (СЖК) на 30% (р<0,001) (табл.). Одновременно происходило снижение эфиров холестерина (ЭХС) на 45% и эфиров жирных кислот (ЭЖК) на 33%, (р<0,001). Данные факты указывают на нарушение соотношения липидов в липопротеинах (источники липидов для эритроцитарных мембран) из-за увеличения интенсивности липолитических процессов в жировой ткани (химический стресс) и токсического поражения печени. Известно, что в результате встраивания ХС в мембрану эритроцитов увеличиваются их размеры и изменяется форма: происходит превращение двояковогнутых дисков в сфероциты и эхиноциты [15]. Кроме того известно, что ХС и ТАГ играют важную роль в регуляции текучести мембран (в мембранах с высоким содержанием холестерина низкое содержание воды) и оказывают существенное влияние на степень ее проницаемости, а также вязко-эластические характеристики, снижая способность эритроцитов к деформации, т.е. прохождению по мелким капиллярам (меньше диаметра эритроцита) [13].
Введение калифена или элеутерококка в течение 14 дней до интоксикации сероуглеродом (соответственно, 3-я и 4-я группы) способствовало тенденции к сохранению изученных физиологических и биохимических характеристик эритроцитов по сравнению с таковыми показателями во 2-й группе (окислы азота). Так, значения СДЭ (6,60±0,03 мкм и 7,00±0,05 мкм) и СОЭр (57,50±2,00 мкм3 и 68,60±2,19 мкм3) были достоверно ниже. Начало
20
Токсикологический вестник №4 (ю9)
гемолиза эритроцитов снизилось до 0,55±0,02% NaCI при введении калифена и 0,60±0,02% №С1 при введении элеутерококка, а завершение гемолиза до 0,45±0,01% №С1 и 0,50±0,01% NaCl, соответственно. То есть, устойчивость к гемолизирующему агенту несколько увеличилась относительно 2-й группы. Количество ФЛ в 3-й и 4-й группах также было выше: на 34% при введении калифена (53,90±1,21%; р<0,01) и на 19% (47,84±1,34%; р<0,05) при введении элеутерококка. При этом снизилось количество ХС на 8% и 4%, соответственно (р<0,05-0,01), в связи с чем коэффициент ХС/ФЛ был ниже (0,51±0,02 и 0,60±0,03, соответственно).
Исследование показателей нейтральных липидов в эритроцитах крыс в 3-й и 4-й группах показало тенденцию к восстановлению. Так, количество ТАГ по сравнению со 2-й группой (окислы азота) было ниже при введении кали-фена на 11% (р<0,05), а при введении элеутерококка - на 7% (р<0,05) (табл.). При этом количество СЖК при введении как калифена, так и элеутерококка уменьшилось, в среднем, на 5-8% (р<0,05). При исследовании величин ЭЖК следует отметить их увеличение в обеих группах (при введении калифена на 19%, а при введении элеутерококка на 12%; р<0,05-0,01). Количество ЭХС при введении калифена возросло на 56% (р<0,001), при введении элеутерококка на 38% (р<0,001).
Биохимическим механизмом восстановления размерных характеристик эритроцитов, их осмотической устойчивости, липидной составляющей мембран эритроцитов является свойство полифенольных структур, входящих в калифен и элеутерококк, улавливать свободные и оксиген-ные радикалы [17]. Мембранопротекторный эффект объясняется тем, что молекулы полифенолов, взаимодействуя с поверхностью мембран, способны образовывать мономолекулярные слои, увеличивающие прочность поверхностного слоя клеток, и, соответственно, снижая возможность атаки радикалами [1]. Кроме того установлено, что растительные полифенолы обладают выраженным гипохоле-стеринемическим действием за счет активации фермента лецитин: холестеринацилтрансферазы (ЛХАТ) [3]. При сравнении выраженности восстанавливающего эффекта действия калифена и элеутерококка, проявляются определенные преимущества первого, так как большинство исследуемых показателей были наиболее близкими к контрольным значениям. Известно, что в состав элеутерококка входит активная группа изомерных флавоноидных соединений (элеутерозиды), не образующих олигомерных форм. В составе калифена присутствуют полимерные вещества (олигомерные и полимерные проантоцианидины), которые демонстрируют антиоксидантные свойства в большей степени, чем мономеры элеутерококка [8]. Таким образом, калифен, обладая антиоксидантными, антирадикальными и мембраностабилизирующими свойствами, по-видимому, снимал опасность глубокого нарушения функционального состояния эритроцитов, что увеличивало выживаемость животных.
Выводы.
Интоксикация окислами азота в концентрации 4,3 мг/м3 сопровождается рассогласованием липидной составляющей мембран эритроцитов, что обусловливает увеличение их размера и ослабление осмотической резистентности.
Растительные полифенольные препараты калифен и элеутерококк повышают выживаемость животных при профилактическом введении до интоксикации окислами азота.
Предварительное введение полифенольных препаратов до интоксикации способствует меньшему поражению физиолого-метаболических характеристик эритроцитов.
Предварительное введение калифена в большей степени обладало защитным эффектом на размерные характеристики и липидную составляющую мембран эритроцитов, чем таковое при введении элеутерококка.
Применение калифена или элеутерококка к ежедневной диете или в составе продуктов питания (калифеновый или элеутерококковый сахар, столовые воды и др.) позволит решить проблему выживания в районах возможных техногенных катастроф и экологически неблагоприятных регионах.
21
и юл ь
- АВГУСТ 2О 1 1
Таблица
Влияние калифена и элеутерококка на содержание нейтральных липидов в эритроцитах ^ крыс при поражении окислами азота (М±м7
Фракции липидов 1 группа Контроль (интактные) 2 группа Окислы азота 3 группа Калифен +окислы азота 4 группа Элеутерококк +окислы азота
| ТАГ 16,94±0,46 23,72±0,60а 21,18±0,63' 22,02±0,4Г
| СЖК 13,57±0,24 17,64±0,36а 16,28±0,39' 16,73±0,22'
| ЭЖК 17,89±0,41 11,99±0,52а 14,31±0,482 13,42±0,40'
ХС 22,40±0,46 29,79±0,48а 27,55±0,592 28,47±0,36'
|эхс 17,14±0,40 7,71±0,24а 12,00±0,383 10,63±0,433
Остаточная фракция 12,06±0,93 9,15±0,86 8,68±0,72 8,63±0,82
Примечание: достоверные различия с контролем: а- р<0,001; со 2-й группой - 1 - р<0,05; 2 - р<0,01; 3 - р<0,001. ТАГ - триацилглицерины, СЖК - свободные жирные кислоты, ЭЖК - эфиры жирных кислот, ХС - холестерин, ЭХС - эфиры холестерина.
22
Токсикологический вестник n<->4 (109)
1. Афанасьева Ю.Г., Фахретдинова Е.Р, Спирихин Л.В., Насибуллин РС. О механизме взаимодействия некоторых флавоноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран // Хим.-фарм. журнал. - 2007. - Т. 41. - № 7. - С. 12-14.
2. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фарм. комитета. - 1999. - № 2. - С. 9-12.
3. Гаскина Т.К., Курилович С.А., Горчаков В.Н. Изменение скорости лецитинхолестеролацилтрансферазной реакции и липидных показателей сыворотки крови под влиянием катергена в условиях острого экспериментального перерождения печени // Вопр. мед. хим. -1989. - Т. 35, № 4. - С. 24-28.
4. Забродский П.Ф., Германчук В.Г. Влияние острого отравления ацетонитрилом на неспецифическую и иммунологическую резистентность организма // Ток-
сикол. вестник. - 2000. - № 5. - С. 12-15.
5. Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: Физиологические аспекты // Успехи физиол. наук. - 2001. -Т. 32. - № 3. - С. 66-78.
6. Иванова А.С., Ситникова О.Г, Назаров С.Б. Состояние свободнорадикальных процессов у беременных крыс и их плодов при хронической нитритной токси-кации // Гиг и сан. - 2008. - № 4. - С. 72-75.
7. Кропотов А.В., Веселков О.В., Челомин В.П., Бута-ков В.Н. Роль мембранотропных эффектов антигипок-сантов в реализации эдематозных реакций. // Успехи физиол. наук. - 1994. - Т. 25, № 3. - С. 60.
8. Кушнерова Н.Ф., Спрыгин В.Г, Фоменко С.Е., Куш-нерова Т.В. Биологически активные добавки как основа сохранения здоровья и продления профессионального долголетия // Вестник ДВО РАН. - 2007. - № 6. - С. 65-72.
9. Кушнерова Н.Ф., Рахманин Ю.А. Влияние интоксикации оксидами азота на метаболические реакции печени и профилактика поражений // Гиг и сан. - 2008.
- № 1. - С. 70-73.
10. Новгородцева Т.П., Эндакова Э.А., Янькова В.И. Руководство по методам исследования параметров системы «Перекисное окисление липидов - антиокси-дантная защита» в биологических жидкостях. - Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2003. - 80 с.
11. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф. Калина - новый нетрадиционный источник олигомерных проантоци-анидинов // Хим-фарм. журнал. - 2004. - Т. 38, № 2.
- С. 41-45.
12. Amenta J. S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography //J. Lipid. Res. - 1964. - Vol.5, N 2. - P. 270-272.
13. Filippov A., Oradd G., Lindblom G. The effect of
23
