CC BY
85
УДК 615.322+577.121
КАЛИНА - ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ИСТОЧНИК СРЕДСТВ ПРОФИЛАКТИКИ СТРЕССА
© 2011 В.Г. Спрыгин1, Н.Ф. Кушнерова1, С.Е. Фоменко1, В.Ю. Мерзляков1, Т.В. Момот2, Е.С. Другова1, Л.Н. Лесникова1
1 Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН,
г .Владивосток
2 Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, г. Владивосток
Поступила в редакцию 27.04.2011
Показано, что комплекс биологически активных веществ, входящий в состав экстракта из отходов от переработки калины Саржента (Viburnum Sargentii) - «Калифен», нормализует соотношение фракций нейтральных и фосфолипидов в печени животных после вертикальной фиксации крыс за дорзальную шейную складку. «Калифен» обнаруживает более выраженные стресс-протекторные свойства, чем элеутерококк, по способности восстанавливать метаболические реакции липидного обмена печени.
Ключевые слова: вещества растительного происхождения, стресс, обмен липидов
Разработка безотходной технологии переработки ягодного сырья дикорастущих растений Уссурийской тайги является актуальной задачей. Сегодня в массовом масштабе происходит только получение сока, а отжим (кожица, косточки, околоплодники, оси соцветий) остается невостребованным и выбрасывается, чем засоряет окружающую среду. В тоже время известно, что в этих частях растений присутствует широкий спектр биологически активных веществ (БАВ) [5], способных инактивировать супероксиданио-ны и выступать в качестве ловушек свободных радикалов [9], являющихся центральным звеном развития патологии в условиях стресса. Экстракция этих веществ из отжима ягод даст возможность разработки на их основе профилактических средств (в виде биологически активных добавок (БАД)) для снятия нарушений метаболических реакций в организме при стрессе.
В настоящее время люди все чаще сталкиваются с различного рода стрессовыми, субэкстремальными и экстремальными факторами.
Спрыгин Владимир Геннадьевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии. E-mail: [email protected] Кушнерова Наталья Федоровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биохимии. E-mail: [email protected]
Фоменко Светлана Евгеньевна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии. E-mail: [email protected]
Мерзляков Валерий Юрьевич, младший научный сотрудник лаборатории биохими. E-mail: [email protected] Момот Татьяна Викторовна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории фармакологии. Email: [email protected]
Другова Елена Сергеевна, младший научный сотрудник лаборатории биохимии. E-mail: [email protected] Лесникова Лариса Николаевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биохимии. Email: [email protected]
Механизмы и последствия их действия на организм изучены еще очень слабо. Не вызывает сомнения одно: бурный научно-технический прогресс, урбанизация и акселерация жизни, повышение уровня эмоциональной напряженности, в том числе и вследствие развития международного терроризма привели к росту психосоматической патологии, включая широкий спектр сердечно-сосудистых заболеваний, среди которых атеросклеротический кардиосклероз, склероз коронарных сосудов, инфаркт миокарда вышли на первое место. Несмотря на то, что стресс является приспособительной реакцией организма в ответ на различные внешние и внутренние факторы воздействия, в жизни достаточно часто возникают ситуации, когда внутренних сил и резервов организма не хватает для поддержания гомеоста-за и противостояния стрессу. Поэтому возникает вопрос, как помочь организму и смягчить повреждающее действие стресса на организм, то есть осуществить регуляцию стрессового состояния. Известен целый ряд препаратов, обладающих стресс-протекторным действием, так называемых адаптогенов, включающих широко известные средства традиционной народной медицины: женьшень, элеутерококк, лимонник, аралия, ро-диола розовая и т.д. Однако практически все они относятся к лекарственным растениям, обладают определенным уровнем токсичности и не являются компонентом традиционной пищи человека. В связи с этим была создана и предлагается к употреблению биологически активная добавка (БАД) к пище «Калифен»™ (свидетельство на товарный знак № 228327, ТУ 9168-079-0048005207), которая была получена из калины (Viburnum sargentii) и запатентована как средство, обладающее антирадикальной активностью (патент RU 2220614).
Цель работы: изучение применения БАД «Калифен»™ для профилактики нарушений метаболических реакций в крови и печени животных при стрессе
Методы исследования. Суховоздушное сырье экстрагировали 40% этиловым спиртом методом реперколяции. Выход экстракта составлял 1л на 1кг сырья. Калифен - водно-спиртовый (40%) экстракт, который представляет собой композицию различных классов веществ: лейко-антоцианов, катехинов, олигомерных проанто-цианидинов, лигнина, флавонолов, органических кислот (фумаровой, аскорбиновой, глицериновой, галактуроновой и др.), свободных аминокислот (гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, треонина, серина, глицина, цистеина, метионина, изолейцина, тирозина и др.), сахаров (сахарозы, рафинозы) и других органических соединений. Полифенолы составляют свыше 60% сухого остатка экстракта. В качестве препарата сравнения использовали известный стресс-протектор «Экстракт элеутерококка» [4]. Эксперимент проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г, содержавшихся на стандартном рационе питания. Водные растворы комплекса полифенолов из калифена и аптечного экстракта элеутерококка (предварительно освобожденные от спирта экстракты путем упаривания в вакууме) вводили в дозе, эквивалентной 100 мг общих полифенолов/кг массы тела. Доза в 100 мг/кг соответствует известной терапевтической дозе для полифенольных гепа-топротекторов [2]. Количество общих полифенолов в растворе определяли с помощью реактива Фолина-Чокальтеу [10]. В качестве экспериментальной модели острого стресса использовали вертикальную фиксацию животных за дорзаль-ную шейную складку на 22 часа. Препараты вводили животным перорально 2 раза в течение эксперимента (до вертикальной фиксации и через 4 часа после). Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс в каждой: 1-я - контроль (ин-тактные животные), 2-я - стресс, 3-я -стресс+калифен, 4-я - стресс+элеутерококк. Крыс выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Экстракты общих липидов из ткани печени готовили по методу [7]. Фракционное разделение фосфолипидов осуществляли методом двумерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле [11], а их количественное определение по методу [12]. Хромато-графическое распределение нейтральных липи-дов и их количественное определение проводили
методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле по методу [6]. Обнаружение пятен нейтральных липидов осуществляли с помощью паров йода. Количественное содержание отдельных фракций выражали в процентах от общей суммы нейтральных липи-дов и фосфолипидов, соответственно. Результаты обрабатывали по параметрическому критерию Стьюдента (t), используя статистическую программу Instat (Graph Pad Software Inc.USA, 2005).
Результаты и обсуждение. Изучение состояния липидного обмена печени животных 2-й группы (стресс) относительно контрольных значений (таблица) характеризовалось увеличением свободных жирных кислот (СЖК) на 10% (р<0,05), что связано с активизацией периферического липолиза в жировой ткани в ответ на выброс в кровь катехоламинов. Отмеченное увеличение содержания триацилглицеринов (ТАГ) в печени на 9% (р<0,05) объясняется их ресинте-зом из жирных кислот и глицерина, мобилизуемых при липолизе. Увеличение уровня холестерина (ХС) на 10% (р<0,05) можно объяснить активацией его синтеза из ацетил-КоА, который образуется в избытке при липолизе. Уменьшение содержания эфиров жирных кислот (ЭЖК) на 24% (р<0,001) и эфиров холестерина (ЭХС) на 15% (р<0,001) определяет нарушение этерифи-цирующей функции печени и, как следствие, синтеза и катаболизма липопротеинов. Полученные данные свидетельствуют о мобилизации ли-пидов, как главных источников энергии, которые транспортируются в ткани в виде СЖК.
В печени стрессированных крыс наблюдались изменения в составе фракций фосфолипи-дов. Так, стресс вызвал равнозначное увеличение в 1,5 раза (р<0,001) содержания лизофракций фосфолипидов - лизофосфатилхолина (ЛФХ) и лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ), что обусловлено увеличением активности фосфолипазы А2. Одновременно отмечалось уменьшение содержания фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатиди-лэтаноламина (ФЭ) на 15% (р<0,01-0,001). Повышение содержания метаболически активных фракций фосфатидилсерина (ФС) на 50% (р<0,01) и фосфатидилинозита (ФИ) на 29% (р<0,01) при стрессе обусловлено реализацией гормональных эффектов через аденилатциклазную систему, запускающую каскад химических реакций липоли-за при стрессе. Уменьшение количества дифос-фатидилглицерина (ДФГ) на 28% (р<0,05), маркерного фосфолипида мембран митохондрий, указывает на угнетение процессов синтеза АТФ, так как этот фосфолипид необходим для функционирования ферментов дыхательной цепи.
Таблица. Влияние растительных препаратов (калифена и элеутерококка) на содержание нейтральных и фосфолипидов в печени крыс при стрессе (% от суммы всех фракций; М±т)
Липидные фракции Группы животных
контроль стресс стресс +калифен стресс+элеуте рококк
нейтральные липиды
ТАГ 18,61±0,55 20,36±0,44* ** 18,46±0,26 ** 18,83±0,19
СЖК 17,96±0,61 19,66±0,27* 17,85±0,37 18,19±0,48
ЭЖК 17,04±0,14 12,00±0,25* *** 17,76±0,44 *** 16,26±0,75
ХС 18,61±0,55 22,36±0,44*** * 18,46±0,26 * 18,83±0,19
ЭХС 16,83±0,13 13,40±0,39*** ** 18,11±0,44* * 15,32±0,75
Остаточная фракция 10,95±0,42 12,22±0,14 9,36±0,70 12,57±0,53
фосфолипиды
ФХ 38,80±1,29 33,01±0,94** ***39,69±0,74 ***40,34±1,03
ЛФХ 5,30±0,19 8,72±0,14*** ***4,56±0,47 ***4,23±0,62
СМ 10,53±0,76 12,06±0,20* 11,69±0,57 11,24±0,32
ФЭ 22,86±0,55 19,44±0,38*** ***22,18±0,43 ***21,67±0,26
ЛФЭ 4,99±0,23 7,90±0,35*** ***4,17±0,31 ***4,86±0,36
ФС 3,10±0,46 4,64±0,16** ***2,91±0,22 ***3,09±0,11
ФИ 6,29±0,39 8,14±0,40** **6,38±0,40 6,77±0,68
ФК 2,70±0,15 2,16±0,24 2,55±0,33 **2,49±0,27
ДФГ 5,43±0,52 3,93±0,25* *5,87±0,27 *5,31±0,41
Примечание: различия статистически достоверны при: *- р<0,05; **- р<0,01; ***- р<0,001. Звездочки справа - сравнение с 1-й группой, звездочки слева - со 2-й группой. ТАГ - триацилглицерины, СЖК -свободные жирные кислоты, ЭЖК - эфиры жирных кислот, ХС - холестерин, ЭХС - эфиры холестерина, ФХ - фосфатидилхолин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, СМ - сфингомиелин, ФЭ - фосфатидилэта-ноламин, ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин, ФС - фосфатидилсерин, ФИ - фосфатидилинозит, ФК -фосфатидная кислота, ДФГ - дифосфатидилглицерин
При введении экспериментальным животным в период стресса калифена (3-я группа) и экстракта элеутерококка (4-я группа) наблюдалась коррекция нарушений, им обусловленных. Так, в печени крыс обеих групп количество ТАГ и СЖК было на уровне контроля, а содержание ЭЖК и ЭХС было достоверно вы-ше, чем таковое при «чистом» стрессе. Обра-щает на себя внимание достоверно высокое содержание ЭХС в печени животных при вве-дении калифена (на 8%; р<0,05). В содержании фосфолипидных фракций в печени обеих групп животных отмечалось восстановление их соотношения до контрольных значений. Биохимический механизм данного феномена обусловлен тем, что растительные полифенолы, входящие в состав экстрактов стимулируют этерифицирующую функцию печени, подавлен-ную стрессом (полифенолы активируют фермент
лецитинхолестеринацилтрансферазу) [3]. Факт достоверного снижения уровня лизофракций (ЛФХ и ЛФЭ) свидетельствует об ингиби-ровании фосфолипаз полифенолами препа-ратов [8]. Кроме того, растительные полифе-нолы, входящие в их состав, имеют способ-ность улавливать свободные оксигенные и пероксильные радикалы, образуя при этом
относительно стабильный феноксил-радикал, который сдерживает процессы перекисного окисления липидов и снимает состояние оксидативного стресса [9]. Также молекулы полифенолов, взаимодействуя с поверхностью мембран, способны образовывать мономолекулярные слои, увеличивающие прочность поверхностного слоя клеток, и, соответственно, снижать возможность атаки радикалами [1]. При сравнении выраженности эффектов Дей-ствия экстракта из отжима калины «Калифен» и элеутерококка, проявляются определенные преимущества первого, так как большинство исследуемых показателей были наиболее близкими к контрольным значениям.
Выводы. Отжим при переработке калины может быть использован для получения комплекса БАВ, обладающего стресс-протекторными свойствами. Введение экстракта из калины «Калифен» на фоне острого стресса способствует снижению интенсивности липоли-за. Комплекс полифенолов, входящих в состав экстракта из отжима калины «Калифен» и экстракт элеутерококка, оказывают регуляторный эффект на метаболические реакции в печени крыс, измененные в условиях острого стресса. «Калифен» обнаруживает более выраженные
стресс-протекторные свойства, чем элеутерококк, по способности восстанавливать метаболические реакции липидного обмена печени экспериментальных животных.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. Афанасьева, Ю.Г. О механизме взаимодействия некоторых флавоноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран / Ю.Г. Афанасьева, Е.Р. Фахретди-нова, Л.В. Спирихин, Р.С. Насибуллин // Хим.-фарм. журнал. 2007. Т. 41, № 7. С. 12-14.
2. Венгеровский, А.И. Доклиническое изучение гепато-защитных средств / А.И. Венгеровский, И.В. Маркова, А.С. Саратиков // Ведомости фарм. комитета. 1999. № 2. С. 9-12.
3. Гаскина, Т.К. Изменение скорости лецитинхолесте-ролацилтрансферазной реакции и липидных показателей сыворотки крови под влиянием катергена в условиях острого экспериментального перерождения печени / Т.К. Гаскина, С.А. Курилович, В.Н. Горчаков // Вопр. мед. хим. 1989. Т. 35, № 4. С. 24-28.
4. Кушнерова, Н.Ф. Биологически активные добавки как основа сохранения здоровья и продления профессионального долголетия / Н.Ф. Кушнерова, В.Г. Спрыгин, С.Е. Фоменко, Т.В. Кушнерова // Вестник ДВО РАН. 2007. № 6. С. 65-72.
5. Спрыгин, В.Г. Отходы от переработки Дальневосточных дикоросов - перспективные источники пищевых антиоксидантов / В.Г. Спрыгин, Н. Ф. Кушне-
рова, С.Е. Фоменко // Известия Самарского научного центра РАН. 2010. Т. 12, № 1 (3). С. 812-815.
6. Amenta, J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography // J. Lipid. Res. 1964. Vol. 5, N 2. P.270-272.
7. Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue / J. Folch, M. Less, G.H. Sloane-Stanley // Biol. Chem. 1957. Vol. 226. P. 497-509.
8. Kropacova, K. Protective and therapeutic effect of sily-marin on the development of latent liver damage / K. Kropacova, E. Misurova, H. Hakova // Radiats. Biol. Radioecol. 1998. Vol. 38, N 3. P. 411-415.
9. Sanz, M.J. Influence of a series of natural flavonoids on free-radical generating systems and oxidative stress / M.J. Sanz, M.L. Ferrandiz, M. Cejudo et al. // Xenobi-otica. 1994. Vol. 24, N. 7. P. 689-699.
10. Singleton, V.L. Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent / V.L. Singleton, R. Orthofer et al. // Oxidants and Antioxidants, Pt A. L. Packer. San Diego, Academic Press Inc., 1999. Vol. 299. P. 152-178.
11. Svetachev, V.I. A simplified technique for thin layer microchromatography of lipids / V.I. Svetachev, V.E. Vaskovsky // J. Chromatogr. 1972. Vol. 67, N 2. P. 376378.
12. Vaskovsky, V.E. A universal reagent for phospholid analysis / V.E. Vaskovsky, E.Y. Kostetsky, I.M. Vasenden // J. Chromatography. 1975. Vol. 114, N 1. P.129-141.
GUELDER-ROSE - THE PERSPECTIVE REMEDY SOURCE OF STRESS PREVENTION
© 2011 V.G. Sprygin1, N.F. Kushnerova1, S.E. Fomenko1, V.Yu. Merzlyakov1, T.V. Momot2, E.S. Drugova1, L.N. Lesnikova1
1 Pacific Oceanological Institute named after V.I. Ilyichev FEB RAS, Vladivostok 2 Institute of Marine Biology named after A.V. Zhirmunsky FEB RAS, Vladivostok
It is shown that complex of biologically active substances which is a part of waste extract from processing the guelder-rose (Viburnum Sargentii) - "Kalifen", normalizes a parity of fractions neutral and phospholipids in liver of animals after rats vertical fixing at dorsal cervical fold. «^lifem» finds out more expressed stress-protective properties than eleutherococcus, on ability to restore metabolic reactions of liver lipid metabolism.
Key words: phytogenesis substances, stress, lipids metabolism
Vladimir Sprygin, Candidate of Biology, Leading Research Fellow at the Biochemistry Laboratory. E-mail: [email protected] Nataliya Kushnerova, Doctor of Biology, Professor, Chief of the Biochemistry Laboratory. E-mail: [email protected] Svetlana Fomenko, Candidate of Biology, Leading Research Fellow at the Biochemistry Laboratory. E-mail: [email protected] Valeriy Merzlyakov, Minor Research Fellow at the Biochemistry Laboratory. E-mail: [email protected]
Tatiana Momot, Candidate of Medicine, Research Fellow at the Pharmacology Laboratory. E-mail: [email protected] Elena Drugova, Minor Research Fellow at the Biochemistry Laboratory. E-mail: [email protected]
Larisa Lesnikova, Candidate of Bioliogy, Research Fellow at the Biochemistry Laboratory. E-mail: [email protected]
