Оси соцветий лимонника китайского в профилактике стрессовых нарушений антиоксидантной защиты и липидного обмена у крыс Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.121+615.324

ОСИ СОЦВЕТИЙ ЛИМОННИКА КИТАЙСКОГО В ПРОФИЛАКТИКЕ СТРЕССОВЫХ НАРУШЕНИЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ И ЛИПИДНОГО ОБМЕНА У КРЫС

© 2015 Т.В. Момот1-2,Н.Ф. Кушнерова3

1 Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток 2 Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН 3 Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН

Поступила в редакцию 18.05.2015

Показано, что комплекс биологически активных веществ, входящий в состав водно-спиртового (40%) экстракта из осей соцветий лимонника китайского «Экликит®», восстанавливает показатели антиоксидантной защиты организма крыс в условиях экспериментальной модели стресса. При остром стрессе происходит увеличение активности супероксиддисмутазы, снижение антирадикальной активности, количества восстановленного глутатиона и увеличение малонового диальде-гида в крови крыс. Экликит обнаруживает более выраженные фармакологические свойства, чем коммерческий препарат «Легалон®».

Ключевые слова: лимонник китайский, стресс, сыворотка крови, антиоксидантная защита

Флора Дальнего Востока России отличается значительным видовым разнообразием. Здесь произрастает более 4 тысяч видов, в то время как в Европейской части около 3,5 тысяч видов, а в Сибири еще меньше. Юг Дальнего Востока для многих видов является северной границей ареала. Это лианы разных видов, растения семейства аралиевых и др. Многие виды содержат вещества в большей или меньшей степени, обладающие антиокси-дантными свойствами. К ним относятся, в основном, флавоноиды и лигнаны, способные гасить реакции свободно-радикального окисления за счет фенолосодержащих составляющих. Исходя из этого, необходимо подобрать такие сырьевые источники, экстракты из которых действовали бы достаточно активно, а также были бы доступны и дешевы. С нашей точки зрения наиболее доступными и важными являются отходы от переработки ягодного сырья после отделения сока. К ним относятся оси соцветий лимонника китайского (Schizandra chinensis Turkz. Baill). Экстракт из семян лимонника давно применяется в народной медицине на Дальнем Востоке в качестве укрепляющего и стимулирующего средства. То же касается и других частей растения: листьев, побегов лианы. Приамурье является северной границей ареала лимонника китайского. Внешне это деревянистая лиана с вьющимися ветвями длиной до 10 м и толщиной до 1,8 см, с морщинистой темно-коричневого цвета шелушащейся корой; на молодых лианах кора гладкая,

Момот Татьяна Викторовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры фундаментальной медицины, научный сотрудник лаборатории фармакологии. E-mail: kushnerova83@mail. ru

Кушнерова Наталья Федоровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией биохимии. Email: [email protected]

блестящая, желтого цвета. Листья простые, эллиптические или овальные с клиновидным основанием. Цветки бело-розовые, душистые, конические. Плод - ягодообразные красного цвета костянки, собраны в плодную кисть. Стебли, корни и плоды лимонника при растирании пахнут лимоном. Цветет в мае-июне, плодоносит в августе-сентябре. Для получения концентрата из свежесобранных плодов отжимают сок и концентрируют с помощью вакуум-выпарной сушки при температуре не выше 50оС. После отделения ягод остается значительное количество осей соцветий (кисть). Это большой возобновляемый сырьевой резерв, который в настоящее время не утилизируется и не используется должным образом. Ресурсы значительны: в урожайные годы возможен сбор до 50 т ягод [10]. Ранее нами было показано [3], что оси соцветий лимонника, хотя и не являются местом локализации лигнанов, но содержат полифенольный комплекс с высокой антиоксидантной активностью [9]. Известно, что при стрессовых воздействиях в результате инактивации адреналина в системе цитохрома Р-450 формируются супероксиданионы и активируется перекисное окисление липидов [6]. Следовательно, становится все более актуальным вопрос о фармакологической регуляции стресса, механизмы и воздействие которого на организм нельзя считать окончательно изученными. Однако из природных стресс-протекторов в аптечной сети известен только «Экстракт элеутерококка».

Цель работы: оценка эффективности полифенольного препарата, полученного из осевой части соцветия, освобожденного от ягод лимонника китайского (Schizandra chinensis). Экстракт запатентован как гепатопротектор (патент № 2179031) и зарегистрирован под торговой маркой «Экликит®» (Свидетельство на товарный знак № 217230).

Материалы и методы исследования. Экстракт из осей соцветий лимонника «Экликит®» готовили на 40%-м этиловом спирте методом репер-коляции. Выход экстракта составлял 1 л на 1 кг сырья. Готовый спиртовый экстракт упаривали на роторном испарителе без подогрева ^<20°С) до половины первоначального объема, затем доводили дистиллированной водой до исходного объема и центрифугировали в течение 5 мин при 3000 об/мин для удаления взвеси. Экстракт содержит в составе экстрактивных веществ, в среднем, 200 мг/л общих полифенолов, представленных кате-хинами, кверцетином, флавонолами, лигнином, органическими кислотами, каротиноидами и рядом других органических соединений. Препаратом сравнения являлся аптечный экстракт элеутерококка.

Эксперимент проводили на белых крысах-самцах линии Вистар с массой тела 180-200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе питания. В качестве экспериментальной модели острого стресса использовали вертикальную фиксацию животных за дор-зальную шейную складку на 22 часа. Препараты вводили животным внутрижелудочно через зонд 2 раза в течение эксперимента (до вертикальной фиксации и через 4 часа после). Водные растворы (предварительно освобожденные от спирта путем упаривания в вакууме) сухих остатков экстрактов осей соцветий лимонника и элеутерококка вводили в количестве 100 мг общих полифенолов/кг массы тела [2]. Животные были разделены на 4 группы по 10 крыс в каждой: 1-я - контрольная (интакт-ные животные), 2-я - стресс, 3-я - экстракт ли-монника+стресс+экстракт лимонника, 4-я - экстракт элеутерококка+стресс+экстракт элеутерококка. Крыс выводили из эксперимента декапита-цией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева ДВО РАН.

У животных определяли массу надпочечников и количество изъязвлений на слизистой желудка. Кровь для исследований собирали из шейной вены животных. Активность супероксиддис-мутазы (КФ 1.15.1.1), уровень малонового диальде-гида и восстановленного глутатиона оценивали по методам, описанным в руководстве Т.П. Новго-родцевой и др. [7]. Антирадикальную активность по методу Яе е1 а1. [13]. Липиды из сыворотки крови экстрагировали по методу J. Folch et а1. [12]. Разделение нейтральных липидов проводили методом одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей гексан - серный эфир - уксусная кислота (90:10:1 по объему) [11]. Обнаружение пятен нейтральных

липидов осуществляли с помощью паров йода, а их идентификацию - с применением очищенных стандартов. Фракционное разделение фосфолипи-дов осуществляли методом двумерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле [14], а их идентификацию и количественное определение по методу V.E. Vaskovsky et al. [15]. Количественное содержание отдельных фракций выражали в % от суммы нейтральных липидов и фосфолипидов. Обработку результатов проводили с использованием статистического пакета Instat 3.0 (GraphPad Software Inc. USA, 2005) с функцией проверки соответствия выборки закону нормального распределения. Для определения статистической значимости различий в зависимости от параметров распределения использовали параметрический t-критерий Стьюдента или непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Вертикальная фиксация крыс за дорзальную шейную складку вызывала формирование типичной картины стресса с характерными геморрагическими дест-рукциями желудка и гипертрофией надпочечников, масса которых повысилась на 43% (8,67±0,19 мг/100 г массы против 6,06±0,42 мг/100 г массы в контроле; р<0,001). Количество изъязвлений на слизистой желудка составило 3,0±0,07 ед/жив., в контроле 0.

Как видно из табл. 1, стресс (2 группа) сопровождался увеличением активности супероксид-дисмутазы (СОД) на 47%, снижением количества восстановленного глутатиона (Г-SH) на 39% и антирадикальной активности (АРА) на 55%. Это согласуется с известными в литературе данными о напряжении системы антиоксидантной защиты [4]. В сыворотке крови отмечалась выраженная ги-пертриглицеринемия и гиперхолестеринемия (табл. 2). Так, количество триацилглицеринов (ТАГ) было увеличено на 16%, свободных жирных кислот (СЖК) на 43%, холестерина (ХС) на 19%. Количество эфиров жирных кислот (ЭЖК) и эфиров холестерина (ЭХС) было снижено, в среднем, на 1215% по сравнению с контролем.

Известно, что в ответ на воздействие стрессовых факторов происходит выход в кровь катехо-ламинов, которые обусловливают активацию периферического липолиза в жировой ткани. При этом триацилглицерины распадаются на глицерин и жирные кислоты, которые с током крови поступают в печень, где происходит их ресинтез в триа-цилглицерины. Здесь же идет синтез липопротеи-нов, богатых этими соединениями, в частности, липопротеинов низкой плотности. Высокое значение холестерина в крови обусловлено активацией его синтеза из ацетил-КоА, который образуется при окислении жирных кислот. Избыток ацетил-КоА связан со снижением функции цикла Кребса, в котором он утилизируется [5]. Нарушение этери-фицирующей функции печени приводит к

уменьшению количества эфиров холестерина и эфиров жирных кислот. При анализе соотношения фосфолипидных фракций в сыворотке крови следует отметить равнозначное достоверное

снижение фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатиди-лэтаноламина (ФЭ) на 8%, при одновременном увеличении лизофосфатидилхолина (ЛФХ) на 28% и лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) на 56%.

Таблица 1. Влияние растительных препаратов на биохимические показатели

крови крыс при стрессе (М±т)

Биохимические показатели 1 -я группа контроль 2-я группа стресс 3-я группа экстракт ли-монни-ка+стресс +экстракт лимонника 4-я группа экстракт элеутерококка +стресс +экстракт элеутерококка

СОД (ед/мг белка) 13,15±0,58 19,35±0,593 13,85±0,60в 15,78±0,612'в

Г-БИ (нмоль/мг белка) 1,81±0,06 1,11±0,063 1,76±0,06в 1,58±0,052,в

АРА (ед. тролокса/ мг белка) 15,84±0,61 7,17±0,493 15,87±0,40в 11,00±0,613в

МДА (мкмоль/мл) 5,77±0,18 7,74±0,333 6,11±0,17в 6,55±0,162'0

Примечание: здесь и в табл. 2 различия статистически значимы при: 1 - р<0,05; 2- р<0,01; 3- р<0,001 по сравнению с контролем; а- р<0,05; б- р<0,01; в- р<0,001 - по сравнению со 2-й группой. СОД - супероксиддисмутаза, АРА - антирадикальная активность, Г-БИ - восстановленный глутатион, МДА - малоновый диальдегид

Таблица 2. Влияние растительных препаратов на содержание нейтральных липидов и фосфолипидов в сыворотке крови крыс при стрессе (% от суммы всех фракций; М±т)

Липид- 1 -я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа

ные фракции контроль стресс экстракт лимонни-ка+стресс +экстракт лимонника экстракт элеутерококка +стресс +экстракт элеутерококка

нейтральные липиды

ТАГ 20,65±0,60 23,95±0,702 19,79±0,62в 22,50±0,501

СЖК 5,94±0,18 8,48±0,373 5,58±0,14в 6,71±0,182в

ЭЖК 23,76±0,71 21,12±0,492 25,14±0,68 23,22±0,48б

ХС 15,12±0,46 18,06±0,523 14,67±0,39в 16,78±0,332,а

ЭХС 24,27±0,44 20,61±0,483 25,16±0,36в 21,84±0,602,а

остаточная фракция 10,26±0,58 7,78±0,17 9,66±0,58 8,95±0,25

фосфолипиды

ФХ 63,08±0,70 57,86±0,873 63,65±0,72в 62,00±0,69б

ЛФХ 8,00±0,20 10,20±0,333 7,88±0,37в 8,97±0,162,0

СМ 8,92±0,24 11,94±0,243 8,64±0,11в 9,38±0,25в

ФЭ 10,15±0,63 8,37±0,211 9,89±0,14в 9,66±0,22в

ЛФЭ 3,17±0,14 4,95±0,133 2,92±0,11в 3,71±0,113е

ФИ+ФС 3,68±0,13 4,45±0,162 3,98±0,13а 3,84±0,13а

ДФГ 3,00±0,05 2,23±0,033 2,94±0,07в 2,44±0,053,в

Примечание: ТАГ - триацилглицерины, СЖК - свободные жирные кислоты, ЭЖК - эфиры жирных кислот, ХС -холестерин, ЭХС - эфиры холестерина, ФХ - фосфатидилхолин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, СМ - сфинго-миелин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин, ФИ - фосфатидилинозит, ФС -фосфатидилсерин, ДФГ - дифосфатидилглицерин

Рост лизофракций обусловлен как активацией фосфолипаз, так и перекисного окисления липи-дов. Подтверждением этого факта является увеличение количества малонового диальдегида (МДА) на 34% (р<0,001) (табл. 1). Увеличение количества сфингомиелина (СМ) (на 34% выше контроля) является компенсаторной реакций на повышение

проницаемости мембран. Кроме того, следует отметить увеличение суммарной фракции фос-фатидилинозита и фосфатидил-серина (ФИ+ФС) на 21% и снижение дифосфат-идилглицерина (ДФГ) на 26%. Снижение значения ДФГ предполагает снижение синтеза энергии по углеводному пути, так как этот фосфолипид необходим

для функционирования ферментов дыхательной цепи митохондрий. Известно, что при стрессе роль липидов в энергетике организма значительно возрастает. Энергетический обмен переключается с «углеводного» типа на «липидный», что характерно для стадии резистентности стресса [8].

При сравнении весовых характеристик надпочечников в 3-й и 4-й группах с таковыми величинами во 2-й группе (стресс) следует отметить, что при введении экстракта из лимонника гипертрофия надпочечников снизилась на 27% по сравнению со 2-й группой, что составляло 6,30±0,31 мг/100 г (р<0,001). При введении элеутерококка -на 12% (7,63±0,20 мг/100 г; р<0,01). Тот факт, что отсутствовали изъязвления на слизистой желудка в обеих экспериментальных группах, объясняется тем, что молекулы полифенолов, взаимодействуя с поверхностью слизистой желудка, способны образовывать мономолекулярные слои, увеличивающие прочность поверхностного слоя клеток [1], соответственно, снижая возможность язвообразо-вания.

Введение экспериментальным животным экстракта из лимонника до и в период стресса (3-я группа) отмечалась нормализация всех изученных биохимических показателей крови (табл. 1 и 2). При введении экстракта элеутерококка (4-я группа) сохранялись достоверные отличия от контрольных значений как показателей антиок-сидантной системы, так и липидного обмена. Так, активность СОД была выше контроля на 20%, МДА на 14% при одновременно сниженной величине АРА (на 31%) и восстановленного глутатиона на 13%. Следовательно, экстракт элеутерококка полностью не снимал состояние оксидативного стресса. В составе нейтральных липидов сыворотки крови крыс этой группы следует отметить сохраняющийся повышенный уровень триацилглицеринов (на 9%), свободных жирных кислот (на 13%), холестерина (на 11%) и сниженный эфиров холестерина (на 10%). В спектре фосфолипидных фракций отмечались повышенные уровни лизофосфати-дилхолина на 12% (р<0,05), лизофосфатидилэтано-ламина на 17%, а также пониженный уровень ди-фосфа-тидилглицерина на 19% (р<0,05).

При сравнении изученных величин биохимических параметров в крови крыс 3-й и 4-й групп с таковыми во 2-й группе (стресс) было показано, что введение экстракта из лимонника сопровождалось снижением активности СОД на 28% и количества МДА на 6%, а также увеличением восстановленного глутатиона на 59% и антирадикальной активности в 2 раза. Ведение элеутерококка, по сравнению со 2-й группой, сопровождалось снижением актив-ности СОД и количества МДА, в среднем, на 15-17%, при одновременном увеличении количества восстановленного глутатиона на 42% и антирадикальной активности на 53%. При сравнении показателей липидного обмена в

сыворотке крови этих групп с таковыми во 2-й группе, следует отметить, что введение экстракта из лимонника сопровождалось снижением количества триацилглицеринов и холестерина на 17-19%, свободных жирных кислот на 34% и увеличением эфиров холестерина на 22%. При ведении элеутерококка достоверные отличия наблюдались в снижении свободных жирных кислот на 21%, холестерина на 7% и увеличении эфиров жирных кислот и холестерина на 8-10%.

Выводы: использование препаратов растительного происхождения, содержащих в своем составе преимущественно природные полифе-нольные комплексы, до и в период стресс-воздействия обеспечивает снятие напряжения ан-тиоксидантной и антирадикальной защиты, а также сохранение соотношения фракций нейтральных и фосфолипидов в сыворотке крови. Нормализуется перекисное окисление липидов. Биохимический механизм данного феномена обусловлен тем, что растительные полифенолы имеют способность улавливать свободные оксигенные и пе-роксильные радикалы, образуя при этом относительно стабильный феноксил-радикал [13]. Поглощение супероксидданионов феноксил-радикалами сдерживает процессы перекисного окисления ли-пидов и снимает состоние оксидативного стресса [6]. В результате снижения интенсивности липоли-за в жировой ткани уменьшается количество триа-цилглицеринов и свободных жирных кислот в сыворотке крови. Также под действием полифеноль-ных комплексов сохраняется этерифицирующая функция печени, которая обеспечивает рост эфи-ров холестерина (полифенолы активируют фермент лецитин: холестерин-ацилтрансферазу) и синтез фосфолипидов из триацилглицеринов (увеличение ФХ, ФЭ и других метаболически активных фракций) (при сравнении 3-й и 4-й групп со 2-й группой - стресс). Однако при введении экстракта из лимонника эфиры холестерина увеличиваются на 22%, а эфиры жирных кислот на 19%, тогда как при введении элеутерококка на 8 и 10%, соответственно. Тот факт, что в сыворотке крови достоверно снизились уровни лизофракций (ЛФХ и ЛФЭ) свидетельствует об ингибировании фосфолипаз полифенолами экстрактов [5]. Полученные результаты показали, что экстракт из осей советий лимонника в условиях стресса превосходил эффект действия экстракта элеутерококка. Известно, что в состав элеутерококка входит активная группа флавоно-идных содинений (элеутерозиды), не образующих олигомерных форм. Видимо экст-ракт из лимонника, будучи комплексом олиго-мерных и полимерных веществ, демонстрирует антиоксидантные свойства в большей степени, чем мономеры элеутерококка.

Работа поддержана Министерством образования и науки РФ, проект № 1326.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Афанасьева, Ю.Г. О механизме взаимодействия некоторых флавоноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран / Ю.Г. Афанасьева, Е.Р. Фахретди-нова, Л.В. Спирихин, Р.С. Насибуллин // Хим.-фарм. журнал. 2007. Т. 41, № 7. С 12-14.

2. Венгеровский, А.И. Доклиническое изучение гепато-защитных средств / А.И. Венгеровский, И.В. Маркова, А.С. Саратиков // Ведомости фарм. комитета. 1999. № 2. С. 9-12.

3. Кушнерова, Н.Ф. Влияние растительного поли-фенольного препарата Экликит на процессы восстановления функции печени после алкогольной интоксикации / Н.Ф. Кушнерова, В.Г. Спрыгин, Ю.А. Рахманин // Биомед. химия. 2004. Т. 50, Вып. 6. С. 605-611.

4. Кушнерова, Н.Ф. Влияние стресса на состояние ли-пидного и углеводного обмена печени, профилактика / Н.Ф. Кушнерова, В.Г. Спрыгин, С.Е. Фоменко, Ю.А. Рахманин // Гигиена и санитария. 2005. № 5. С. 17-21.

5. Кушнерова, Н.Ф. Профилактика нарушений физиологических и биохимических характеристик эритроцитов при интоксикации сероуглеродом / Н.Ф. Кушнерова, Ю.А. Рахманин, Т.В. Кушнерова, Е.С. Другова // Гигиена и санитария. 2010. № 4. С. 17-21.

6. Момот, Т.В. Использование отжима после отделения сока из плодов рябины для получения стресс-протекторных препаратов / Т.В. Момот, Н.Ф. Кушнерова // Известия Самарского научного центра РАН. 2014. Т. 16, № 1(3). С. 784-787.

7. Новгородцева, Т.П. Руководство по методам исследования параметров системы «Перекисное

окисление липидов - антиоксидантная защита» в биологических жидкостях / Т.П. Новгородцева, Э.А. Эндакова, В.И. Янькова. - Владивосток: Изд-во Дальневосточного университета, 2003. 80 с.

8. Панин, Л.Е. Биохимические механизмы стресса. -Новосибирск: Наука, 1983. 232 с.

9. Спрыгин, В.Г. Антирадикальная активность извлечений из дальневосточных растений, содержащих олигомерный проантоцианидиновый комплекс / В.Г. Спрыгин, Н.Ф. Кушнерова, С.Е. Фоменко и др. / Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2003. Вып. 11. С. 5053.

10. Фруентов, Н.К. Лекарственные растений Дальнего Востока. Хабаровское книжное издательство, 1974. 352 с.

11. Amenta, J. S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography // J. Lipid res. 1964. Vol. 5, N 2. P. 270-272.

12. Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues / J. Folch, M Less, G.H. Sloane-Stanley // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226, N 1. P. 497-509.

13. Re, R. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay / R. Re, N. Pellegrini, A Proteggente et al. // Free Radic. Biol. Med. 1999. Vol. 26. N 9-10. P. 1231-1237.

14. Svetachev, V.I. A simplified technique for thin layer microchromatography of lipids / V.I. Svetachev, V.E. Vaskovsky // J. Chromatography. 1972. Vol. 67, N 2. P. 376-78.

15. Vaskovsky, V.E. A universal reagent for phospholid analysis / V.E. Vaskovsky, E.Y. Kostetsky, I.M. Vasenden // J. Chromatography. 1975. Vol. 114, N 1. P. 129-41.

AXES OF INFLORESCENCES OF THE SCHIZANDRA CHINENSIS IN PREVENTION THE STRESSFUL VIOLATIONS OF ANTIOXIDANT PROTECTION AND LIPID

METABOLISM AT RATS

© 2015 T.V. Momot1'3, N.F. Kushnerova2

1 Far East Federal University, Vladivostok

2 Pacific Oceanological Institute named after V.I. Ilyichev FEB RAS

3 Institute of Marine Biology named after A.V. Zhirmunskiy FEBRAS

It is shown that the complex of biologically active agents which is a part aqueous-alcoholic (40%) of extract from axes of inflorescences of Schizandra chinensis "Eklikit®", restores indicators of antioxidant protection of an organism of rats in the conditions of experimental model of a stress. At acute stress there is an increase in activity of a superoksiddismutaza, decrease in anti-radical activity, amount of the restored glutathione and increase in a low-new dialdegid in blood of rats. Eklikit finds more expressed pharmacological properties, than the commercial preparation "Legal on®".

Keywords: Schizandra chinensis, stress, blood serum, antioxidant protection

Tatiana Momot, Candidate of Medicine, Associate Professor at the Fundamental Medicine Department, Research Fellow at the Pharmacology Laboratory. E-mail: [email protected]; Nataliya Kushnerova, Doctor of Biology, Professor, Chief of the Biochemistry Laboratory. E-mail: [email protected]