CC BY
57
© МОМОТ Т.В., КУШНЕРОВА Н.Ф., ФОМЕНКО С.Е. — 2012 УДК 615.322+577.121
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА ИЗ КАЛИНЫ НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ПЕЧЕНИ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ СЕРОУГЛЕРОДОМ
Татьяна Викторовна Момот1, Наталья Федоровна Кушнерова2, Светлана Евгеньевна Фоменко2 ('Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН, директор — акад. РАН А.В. Адрианов, лаборатория фармакологии, зав. — д.б.н., проф. Ю.С. Хотимченко; 2Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева Дальневосточного отделения РАН, директор — акад. РАН В.А. Акуличев, лаборатория биохимии, зав. — д.б.н., проф. Н.Ф. Кушнерова)
Резюме. Приведены данные но изучению генатонротекторного действия экстракта из калины Саржента (Viburnum sargentii Koehne) и коммерческого нренарата легалон. Показано, что интоксикация сероглеродом сонро-вождалась истощением системы антиоксидантной защиты, активацией нерекисного окисления линидов, нарушением в соотношении фракций нейтральных линидов. Действие экстракта из калины в восстановлении метаболических реакций нечени и снятии токсического стресса оказалось более эффективным, чем у легалона.
Ключевые слова: генатонротекторы, нечень, сероуглерод, антиоксидантная защита, линиды, экстракт калины, легалон.
INFLUENCE OF THE EXTRACT FROM THE GUELDER-ROSE ON METABOLIC REACTIONS OF THE LIVER
IN INTOXICATION WITH CARBON DISULFIDE
T.V. Momot1,N.F. Kushnerova2, S.E. Fomenko2 ('A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences;
2V.I. Il'ichev Pacific Oceanological Institute, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences)
Summary. tte hepatoprotective properties of an extract from a guelder-rose of Sarzhenta (Viburnum sargentii Koehne) and a commercial preparation of “Legalon” ™ have been studied. It has been shown that the intoxication with carbon disulfide was accompanied by depletion of a system of antioxidant protection, activation of lipids peroxidation, infringement in the fractions ratio of neutral lipids. Action of an extract from a guelder-rose in restoration of metabolic reactions of a liver and removal of toxic stress has appeared to be more effective, than legalon.
Key words: hepatoprotectors, liver, carbon disulfide, antioxidant protection, lipids, guelder-rose extract, legalon.
Разнообразные природные ресурсы Уссурийской тайги Дальнего Востока РФ дают возможность богатой сырьевой базы для выделения биологически активных веществ (БАВ) и создания новых отечественных лекарственных препаратов и биологически активных добавок на их основе. Перспективными являются отходы от переработки (отжим после получения сока) дикорастущих ягодных кустарников, плодов лиан, листьев и других частей растений. Ранее проведенные исследования [5, 9, 11] показали, что экстракты, выделенные из отжима винограда Амурского (Vitis amurensis), лимонника Китайского (Schizandra chinensis), калины Саржента (Viburnum sargentii Koehne), зеленого и черного чая содержат полифенольные соединения, в частности флавоноиды, схизандрины, катехины в высоких концентрациях (до 60%). В литературе опубликованы многочисленные данные, свидетельствующие о широком спектре биологической активности растительных полифенолов благодаря проявлению ими антиокисли-тельных свойств и способности выступать ловушками свободных радикалов различного типа [20], защищать организм от проявлений оксидативного стресса [14], образовывать комплексы с ионами переходных металлов [21] влияя на активность металлозависимых ферментов, блокировать процессы перекисного окисления липидов [22]. Высокие антиоксидантные и антиради-кальные свойства исследованных нами растительных экстрактов позволили предсказать наличие высокой ге-патозащитной активности. К ним следует отнести экстракт из калины (Viburnum sargentii Koehne) «Калифен»™ (свидетельство на товарный знак №228327), запатентованный как средство, обладающее гепатопротектор-ными свойствами (патент №2177330), исследованное на модели поражения печени четыреххлористым углеродом. Однако спектр химических веществ, оказывающих гепатотоксическое действие на организм человека при профессиональной деятельности, очень широк, что обусловливает исследование гепатопротекторных свойств калифена и при других видах интоксикаций. В данной работе мы изучали влияние интоксикации сероуглеродом (CS2), как наиболее широко распространенном токсиканте на производствах по переработке природного газа [8]. Хотя и существует высокий уро-
вень автоматизации и механизации технологических процессов на таких производствах, однако имеются отдельные операции, выполнение которых связано с интенсивным загрязнением рабочей зоны вредными веществами, превышающими предельно допустимые концентрации (ПДК) в 2 и более раз [12]. При этом поражающим агентом является как сам токсикант, так и продукты его метаболизма — сульфаты, окисленные и эфиросвязанные фракции серы, которые оказывают выраженное гепатотоксическое действие. Накопление окисленных форм серы с их дальнейшей диссоциацией, в свою очередь, способствуют усилению как радикального повреждения, так и перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах [6]. В качестве сравнения использовали растительный полифеноль-ный гепатопротекторный препарат «Легалон»™ (Madaus AG, Германия), являющийся комплексом флавоноидов из плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum).
Целью работы явилось изучение влияния экстракта из калины для коррекции нарушений метаболических реакций печени после интоксикации сероуглеродом.
Материалы и методы
Экстракт из калины «Калифен»™ готовили из высушенного отжима после отделения сока калины (кожица, косточки, оси соцветий) с использованием в качестве экстрагента 40% этиловый спирт. В процессе многократной перколяции из 1 кг сырья выход экстракта составлял 1 л. Химический состав экстракта был исследован с помощью жидкостного хроматографа «Controller LCC 500» (Pharmacia) [10]. Калифен — водно-спиртовый (40%) экстракт, который представляет собой композицию различных классов веществ: лейкоантоцианов, катехинов и их полимерных форм, олигомерных таннинов, лигнина, флавонолов, органических кислот (фумаровой, аскорбиновой, глицериновой, галактуроновой и др.), свободных аминокислот (гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, треонина, серина, глицина, ци-стеина, метионина, изолейцина, тирозина и др.), сахаров (сахарозы, рафинозы) и других органических соединений. Полифенолы составляют свыше 60% сухого остатка экстракта. Полученный водно-спиртовый экстракт отно-
Таблица 1
Влияние экстракта из калины и препарата «Легалон» на биохимические показатели печени и крови крыс после поражения сероуглеродом (М±т)
Показа- тели Группы животных
1-я Контроль 2-я CS2 3-я Депри- вация 4-я Депривация+ калифен 5-я Депривация+ легалон
СОД 344,9 108,5 156,4 327,6 294,4
(ед/мг белка) ±13,0 ±11,0*** ±10,8*** ±11,8 ±12,3*
МДА 0,72 4,89 4,70 0,90 1,19
(нмоль/г) ±0,07 ±0,60*** ±0,07*** ±0,03 ±0,04***
АлАТ 0,72 3,77 3,42 0,86 1,14
(мкмоль/мл/час) ±0,07 ±0,09*** ±0,10*** ±0,04 ±0,05***
Нейтральные липиды (в % от суммы всех фракций)
20,74 25,30 25,00 22,19 23,84
±1,10 ±1,17* ±1,12* ±0,39 ±0,70*
17,10 20,25 19,00 16,93 18,19
±0,19 ±0,80** ±0,63** ±0,44 ±0,61
17,11 13,78 13,60 16,54 15,00
±0,59 ±0,69** ±0,31*** ±0,48 ±0,38**
16,18 20,00 18,50 15,77 16,66
±0,46 ±0,42*** ±0,57** ±0,64 ±0,71
18,37 13,67 15,10 18,10 17,36
±0,19 ±0,70*** ±0,73*** ±0,55 ±0,61
Остаточ. 10,50 7,18 7,00 10,69 8,95
фракция ±0,50 ±0,23 ±0,18 ±0,53 ±0,70
Примечание: изменения статистически значимы по сравнению с контролем при: * — р<0,05; ** — р<0,01; — р<0,001. Сокращения приведены в тексте статьи.
сится к малотоксичным (DL50 = 48,6 мл/кг) для организма животных (крысы линии Вистар).
Эксперимент проводили на крысах самцах линии Вистар массой 180-200 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Для интоксикации сероуглеродом животных помещали в специальную затравочную камеру, сконструированную по типу камер Б.А. Курляндского [7], в условиях относительной влажности воздуха (40-60%), заданных параметров температуры (20-22°С), с автономной системой очистки и регенерации воздуха. Концентрация сероуглерода в камере поддерживалась на уровне 2,0 мг/м3 (ПДК для сероуглерода в воздухе рабочей зоны составляет 1 мг/м3 ГОСТ 12.1.005-88; ГН 2.2.5.1313-03).
Расход пропускаемого через камеру воздуха и сероуглерода составлял не менее 10 л/мин.
Время воздействия составляло 6 часов в сутки на протяжении 3 недель в монотонном режиме, кроме выходных дней, и определялось исходя из конкретных параметров моделирования условий труда на производстве.
После интоксикации сероуглеродом животных разделили на 3 группы. Одну группу животных после интоксикации поместили в обычные клетки и в течение 7 дней они находились в стандартных условиях вивария (период депривации). Другой группе животных в течение 7 дней внутрижелудочно через зонд вводили водный раствор сухого остатка кали-фена (предварительно освобожденный от спирта путем упаривания в вакууме) в эффективной терапевтической дозе (100 мг общих полифенолов/1 кг массы), разработанной для проведения доклинических испытаний по-лифенольных гепатопротекторов [2]. Третьей группе вводили препарат сравнения легалон в виде суспензии на крахмальной слизи в той же дозе. Контролем служили интактные животные, содержащиеся в стандартных условиях вивария, которым по аналогичной схеме в соответствующем объеме вводили очищенную воду. Использована схема эксперимента, разработанная A. Gajdos [16]. Таким образом, в ходе эксперимента были выделены следующие группы животных по 10 крыс в каждой: 1-я — контроль (интактные), 2-я — интоксикация сероуглеродом, 3-я — интоксикация сероуглеродом с последующей отменой (депривация) в течение 7 дней, 4-я — введение калифена в течение 7 дней в период депривации после интоксикации сероуглеродом, 5-я группа — введение легалона в течение 7 дней в период депривации после интоксикации сероуглеродом. Крыс выводили из эксперимента декапитацией под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Исследование одобрено этической комиссией Учреждения Российской академии наук Тихоокеанского океанологического института им. В.И. Ильичева Дальневосточного отделения РАН.
Экстракты общих липидов из ткани печени готовили по методу J. Folch [15]. Хроматографическое распределение нейтральных липидов и их количественное определение проводили методом одномерной микро-тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей, предложенных G.S. Amenta [13]. Обнаружение пятен нейтральных липидов осуществляли с помощью паров йода. Количественное содержание отдельных фракций выражали в процентах от общей суммы нейтральных липидов. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) — малоновый диальдегид (МДА), определяли по методу О.Е. Колесовой и соавт. [4]. Антиоксидантную систему печени оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД; КФ 1.15.1.1)
[17]. В сыворотке крови определяли активность органоспецифического фермента печени аланинаминотранс-
феразы (АлАТ) с помощью наборов Bio-la-test фирмы Pliva-Lachema Diagnostika S.R.O. (Чехия).
Результаты обрабатывали по параметрическому критерию Стьюдента (t), используя статистическую программу Instat (GraphPad. Software Inc. USA, 2005). Критический уровень значимости при проверке гипотез р=0,05.
Результаты и обсуждение
При интоксикации CS2 в печени крыс отмечалась выраженная картина сформированного токсического гепатита. Как видно из таблицы, активность АлАТ возросла в 5 раз (р<0,001) относительно контроля, а количество МДА в 7 раз (р<0,001). Это свидетельствует об активации пере-кисного окисления липидов и увеличении проницаемости мембран гепатоцитов, в связи с чем происходит выход ферментов-маркеров цитолиза в кровь Активность СОД в печени после интоксикации снизилась в 5 раз (р<0,001), что определяет истощение системы антиоксидантной защиты и развитие оксидативного стресса. В спектре нейтральных липидов (таблица) отмечалось статистически значимое увеличение содержания триацилглицерина (ТАГ) и свободных жирных кислот (СЖК), что связано с усилением периферического липолиза (стрессовая реакция на ксенобиотик), в результате которого происходит поступление жирных кислот и глицерина в печень из жировых депо с последующим их ресинтезом в ТАГ. Увеличение количества холестерина (ХС) обусловлено угнетением митохондриального окисления Ац-КоА в цикле Кребса. Одновременно происходило снижение эфиров холестерина (ЭХС) и эфиров жирных кислот (ЭЖК). Такое соотношение липидных фракций свидетельствует о жировом перерождении печени в связи с нарушением ее этерифицирующей функции.
Через 7 дней после отмены CS2 (3 группа, период депривации) в печени отмечалось еще большее отклонение от нормы ряда биохимических показателей, что свидетельствует о недостаточности собственных защитных сил организма противостоять развитию токсической патологии. Активность СОД и АлАТ, а также величина МДА были на уровне таковых во 2-й группе. В спектре нейтральных липидов сохранялось повышенное содержание ТАГ, СЖК и Хс и низкое ЭХС и ЭЖК, то есть эте-рифицирующая функция печени была подавлена.
При введении животным калифена в период отмены
С82 (4-я группа) отмечалась нормализация всех исследуемых биохимических показателей относительно таковых в контроле. Восстановилась активность СОД и снизилось содержание МДА, что предполагает благоприятные условия для реконструкции мембранных структур гепатоцитов. В пользу этого указывает снижение активности АлАТ в плазме крови до уровня интактного контроля. Соотношение фракций нейтральных липидов в печени соответствует таковому у контрольных животных, что указывает на восстановлении её этерифициру-ющей функции. То есть, калифен способствовал снятию токсического стресса.
При введении препарата сравнения «Легалон» (5-я группа) также отмечалась нормализация большинства биохимических показателей, причем направленность изменений была аналогична таковой у калифена, но степень выраженности отклонений от контроля различалась. В первую очередь, она характеризовалась по сравнению с 3-й группой ростом активности СОД, снижением содержания МДА и активности АлАТ. Однако эти величины статистически значимо отличались от таковых в контроле (при р<0,05-0,001). В спектре фракций нейтральных липидов следует отметить восстановление до контрольных величин СЖК, ХС и ЭХС, тогда как количество ТАГ было статистически значимо выше, а ЭЖК — ниже. То есть, действие легалона оказалось менее эффектиным, чем у калифена в восстановлении метаболических реакций печени после интоксикации С82.
Таким образом, интоксикация С82 в течение 3-х недель сопровождалась выраженной картиной токсического гепатита у крыс. Применение калифена и легалона
после интоксикации способствовало восстановлению антиоксидантной защиты, снижению перекисного окисления липидов, восстановлению липидной составляющей мембран гепатоцитов, что подтверждено нормализацией активности АлАТ. Биохимический механизм восстановления функции печени с помощью калифена и легалона после поражения С82, по нашему мнению, обусловлен тем, что растительные полифенолы, входящие в их состав имеют способность как улавливать свободные оксигенные и пероксильные радикалы, образуя при этом относительно стабильный феноксил-радикал [19], так и локализоваться в пределах липидного бислоя плазматической мембраны [1], что в значительной степени сдерживает процессы перекисного окисления липидов и снимает состояние оксидативного стресса
[18]. Известно, что растительные полифенолы восстанавливают этерифицирующую функцию печени [3], что сопровождается снижением количества ТАГ и СЖК. Феномен снижения холестерина и рост ЭХС объясняется тем, что молекулы полифенолов активируют фермент 7а-холестерингидроксилазу, участвующую в окислении холестерина в желчные кислоты [23]. Однако, при сравнении выраженности восстановительного эффекта действия легалона и калифена, проявляются определенные преимущества последнего. Известно, что в состав лега-лона входит активная группа изомерных флавоноидных содинений (силибинин, силикристин, силидианин), не образующих олигомерных форм. Видимо калифен, будучи комплексом олигомерных и полимерных веществ, демонстрирует антиоксидантные свойства в большей степени, чем мономеры легалона.
ЛИТЕРАТУРА
1. Афанасьева Ю.Г., Фахретдинова Е.Р., Спирихин Л.В., Насибуллин Р.С. О механизме взаимодействия некоторых фла-воноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран // Хим.-фарм. журнал. — 2007. — Т. 41, №7. — С. 12-14.
2. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фарм. комитета. — 1999. — №2. — С. 9-12.
3. Гаскина Т.К., Курилович С.А., Горчаков В.Н. Изменение скорости лецитинхолестеролацилтрансферазной реакции и липидных показателей сыворотки крови под влиянием катер-гена в условиях острого экспериментального перерождения печени // Вопр. мед. хим. — 1989. — Т. 35. №4. — С. 24-28.
4. Колесова О.Е., Маркин А.А., Федорова Т.Н. Перекисное окисление липидов методом определения продуктов липопе-роксидации в биологических средах // Лаб. дело. — 1984. — № 9. — С. 16-19.
5. Кушнерова Н.Ф., Спрыгин В.Г., Рахманин Ю.А. Влияние растительного полифенольного препарата экликит на процессы восстановления функции печени после алкогольной интоксикации // Биомед. хим. — 2004. — Т. 50, Вып. 6. — С. 605-611.
6. Кушнерова Н.Ф., Рахманин Ю.А., Кушнерова Т.В., Другова Е.С. Профилактика нарушений физиологических и биохимических характеристик эритроцитов при интоксикации сероуглеродом // Гигиена и санитария. — 2010. — №4. — С. 17-21.
7. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия). — М.: Медицина, 1970. — 347 с.
8. Сетко Н.П., Бейлин С.М. Гигиеническая оценка организации питания и алиментарного статуса рабочих основных профессий, занятых в газоперерабатывающей промышленности // Мед. труда и пром. экол. — 2008. — №7. — С. 19-24.
9. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф., Гордейчук Т.Н., Фоменко С.Е. Стресс-протективное действие диприма // Эксперим. и клин. фармакол. — 2002. — Т. 65, №4. — С. 56-58.
10. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф. Калина — новый нетрадиционный источник олигомерных проантоцианидинов // Хим-фарм. журнал. — 2004. — Т. 38. — № 2. — С. 41-45.
11. Фоменко С.Е., Кушнерова Н.Ф. Использование экстрактов зеленого и черного чая для профилактики токсического
воздействия ацетона // Мед. труда и пром. экология. — 2010. — № 12. — С. 38-44.
12. Тимашева Г.В., Валеева О.В. Диагностическая значимость биохимических и гематологических изменений у работников нефтехимической промышленности // Мед. труда и пром. экология. — 2009. — №11. — С. 20-23.
13. Amenta J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography // J. Lipid. Res. — 1964. — Vol. 5, №2. — P. 270-272.
14. de Groot H.,Rauen U. Tissue injury by reactive oxygen species and the protective effects of flavonoids // Fundam. Clin. Pharmacol. — 1998. — Vol. 12, № 3. — P. 249-255.
15. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue // Biol. Chem. — 1957. — Vol. 226. — P. 497-509.
16. Gajdos A., Gaidos-Torok M., Horn R. Therapeutic effect of the (+)-catechin on biochemical disorders of the liver in the ethanol intoxicated rat // C.R. Seances Soc. Biol. Fil. — 1972. — Vol. 166. — № 2. — P. 277-279.
17. Paoletti F., Aldinucci D., Mocali A., Caparrini A. A sensitive spectrophotometric method for the determination of superoxide dismutase activity in tissue extracts // Analitical biochemistry. — 1986. — Vol. 154. — P. 536-541.
18. Pignatelli, P., Ghiselli A., Buchetti B., et al. Polyphenols syn-ergistically inhibit oxidative stress in subjects given red and white wine // Atherosclerosis. — 2006. — Vol. 188. — № 1. — P. 77-83.
19. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. // Free Radic. Biol. Med. — 1999. — Vol. 26. №9-10. — P. 1231-1237.
20. Rice-Evans C.A., Miller N.J. Antioxidant activities of flavonoids as bioactive components of food // Biochem. Soc. Trans. — 1996. — Vol. 24, №3. — P. 829-835.
21. van Acker S.A., van Balen G.P., van den Berg D.J., et.al. Influence of iron chelation on the antioxidant activity of flavonoids // Biochem. Pharmacol. — 1998. — Vol. 56, N. 8. — P. 935-943.
22. Vasiljeva O.V., Lyubitsky O.B., Klebanov G.I., et.al. Effect of antioxidants on the kinetics of chain lipid peroxidation in liposomes // Membr. Cell. Biol. — 1998. — Vol. 12, N. 2. — P. 223-231.
23. Yang T.T., Koo M.W. Chinse green tea lowers cholesterol level through an increase in fecal excretion // Life Sci. — 2000. — Vol. 66, N 5. — P. 411-423.
Информация об авторах: 690041, Владивосток, ул. Пальчевского, 17, OTM ДВО PAH, тел. (4232) 313061; e-mail:
kushnerova83@mail.ru Mомот Татьяна Викторовна — к.м.н., научный сотрудник.
Кушнерова Наталья Федоровна — д.б.н., профессор, заведующий лабораторией, e-mail: natasha50@mail.ru Фоменко Светлана Евгеньевна — к.б.н., ведущий научный сотрудник, e-mail: fomenko29@mail.ru
