CC BY
62
УДК 612.322+577.121:614.32
Н.Ф.Кушнерова1, Т.В.Кушнерова2
ПРОФИЛАКТИКА НАРУШЕНИЙ ФИЗИОЛОГО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ОКИСЛАМИ АЗОТА
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И.Ильичева ДВО РАН, Владивосток 2Институт биологии моря им. А.В.Жирмунского ДВО РАН, Владивосток
РЕЗЮМЕ
Эксперимент проводили на крысах самцах Вистар. Показана возможность восстановления мембран эритроцитов, поврежденных окислами азота, с помощью препарата «Калифен», выделенного из калины (Viburnum sargentii Koechne) и экстракта элеутерококка. Предварительное введение калифена до интоксикации окислами азота в большей степени обладало защитным эффектом на антиоксидантную функцию и фосфолипидную составляющую мембран эритроцитов, чем таковое при введении экстракта элеутерококка.
Ключевые слова: окислы азота, эритроциты, калифен, элеутерококк, фосфолипиды, антиоксидантная защита.
SUMMARY N.F.Kushnerova, T.V.Kushnerova
PROPHYLAXIS OF PHYSIOLOGIC AND METABOLIC CHARACTERISTICS OF ERYTHROCYTES AT INTOXICATION WITH NITRIC OXIDES
The experiment was conducted on male rats Vistar. The ability of erythrocyte membranes to restore after nitric oxides submission with the help of «Kalifen» secured from the guelder-rose (Viburnum sargentii Koechne) and eleuterococcus extract is shown. Preliminary introduction of Kalifen before intoxication with nitric oxides had a bigger protective effect on the status of antioxidants and phospholipids component in erythrocyte membranes than at the introduction of eleuterococcus extract.
Key words: nitric oxides, erythrocytes, kalifen, eleuterococcus, phospholipids, antioxidant protection.
При ингаляционном воздействии окислами азота развивается токсический отек легких, который характеризуется активацией липолитических процессов в легочной ткани, характерных для гипоксических состояний [4]. Окислы азота образуются при высокой
температуре (свыше 1300оС) и высоком давлении, характерным для процессов, происходящих в камере сгорания двигателя при сжигании моторного, авиационного или ракетного топлива (применяются в качестве окислителей). Больше всего окислов азота производят дизельные двигатели, поскольку давление и температура в их камерах сгорания выше, чем у бензиновых двигателей.
В организм человека окислы азота попадают ингаляционным путем, с водой и пищей. Установлено, что длительный контакт с нитрогазами приводит к снижению содержания эритроцитов, достоверному повышению гематокрита, среднего клеточного объема эритроцитов, анизоцитозу и ретикулоцитозу, а также к увеличению проницаемости их мембран [3]. Интерес к исследованию липидной составляющей мембран эритроцитов и показателей их антиокси-дантной защиты возник после того, как оказалось, что при химических интоксикациях нарушение липидного гомеостаза проявляется в изменениях на уровне сывороточных липидов, а также в состоянии процессов липопероксидации [6]. Вместе с тем, изучение эритроцитов как модели для исследования токсической нагрузки на биомембраны не получило должного развития.
В настоящее время остро стоит вопрос разработки медицинских технологий защиты организма человека от воздействия вредных химических веществ техно-и антропогенного происхождения. Применение препаратов, осуществляющих антиоксидантную защиту мембранных структур при различных видах токсического воздействия, является важным этапом системы профилактики. Одним из способов является использование растительных экстрактов, содержащих комплексы биологически активных полифенолов, обладающих способностью гасить свободно-радикальные реакции. Ранее нами были опубликованы данные, свидетельствующие о широком спектре биологической активности растительных биологически активных добавок, выделенных из отходов от переработки дикорастущих видов Дальневосточной тайги, благодаря проявлению ими антиоксидантных, антиради-
кальных, мембрано- и гепатопротекторных свойств [5, 7]. В связи с этим была создана и предлагается к употреблению биологически-активная добавка к пище «Калифен» с антирадикальными свойствами (патент RU №2199249, ТУ 9168-079-00480052-07, свидетельство на товарный знак RU №228327), которая была выделена из калины Саржента (Viburnum sargentii Koehne). Химический состав препарата был исследован с помощью жидкостного хроматографа «Controller LCC 500» (Pharmacia) [9]. Калифен - вод-но-спиртовый (40%) экстракт, который представляет собой композицию различных классов веществ: лей-коантоцианов, катехинов и их полимерных форм, олигомерных таннинов, лигнина, флавонолов, органических кислот (фумаровой, аскорбиновой, глицериновой, галактуроновой и др.), свободных аминокислот (гистидина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, треонина, серина, глицина, цистеи-на, метионина, изолейцина, тирозина и др.), сахаров (сахарозы, рафинозы) и других органических соединений. Полифенолы составляют свыше 60% сухого остатка экстракта. В качестве препарата сравнения использовали «Экстракт элеутерококка», защитное действие которого при гипоксии связывают с регулирующим влиянием на углеводный и пластический обмен [6].
В настоящем исследовании анализируется действие интоксикации окислами азота (наиболее распространенные загрязнители атмосферного воздуха, относящиеся к классу высоко опасных химических веществ) на систему показателей антиоксидантной и антирадикальной защиты, фосфолипидную составляющую мембран эритроцитов, а также демонстрируется возможность профилактики наблюдаемых отклонений с помощью экстракта из калины «Кали-фен» и экстракта элеутерококка.
Целью работы явилось изучение мембранопротекторных свойств экстрактов из калины и элеутерококка в условиях интоксикации крыс окислами азота.
Материал и методы исследования
Эксперимент проводили на крысах самцах Вис-тар массой 180-200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Ингаляционное воздействие окислами азота осуществляли в затравочной камере, сконструированной по типу камер Б.А.Курляндского. Животных помещали в условия относительной влажности воздуха (40-60%), заданных параметров температуры (20-220С), с автономной системой очистки и регенерации воздуха. Концентрация окислов азота в камере поддерживалась на уровне 4,0 мг/м3 (ПДК для паров окислов азота в воздухе рабочей зоны составляет 0,4 мг/м3 - ГН 2.2.5.1313-03). Ингаляцию осуществляли в течение 6 мин. Схема эксперимента заимствована из работы А.В.Кропотова [4]. То есть, в эксперименте была смоделирована интоксикация при техногенной катастрофе с массивным выбросом окислов азота. Животные были разделены на 4 группы:
1-я группа (контроль) - интактные животные (n=6);
2-я группа - интоксикация окислами азота (n=16); 3-я группа - профилактическое введение калифена в те-
чение 14 дней до интоксикации окислами азота, с последующей интоксикацией в течение 6 мин. (n=10); 4-я группа - профилактическое введение элеутерококка в течение 14 дней до интоксикации окислами азота, с последующей интоксикацией в течение 6 мин. (n=10).
Водные растворы сухого остатка из калифена и элеутерококка (предварительно освобожденные от спирта экстракты путем упаривания в вакууме) вводили внутрижелудочно в количестве 0,4 мл, что соответствовало дозе 100 мг общих полифенолов/кг массы тела. Доза в 100 мг/кг соответствует известной терапевтической дозе для полифенольных гепатопро-текторов [2]. Крыс выводили из эксперимента через 60 мин. после интоксикации окислами азота методом декапитации под легким эфирным наркозом с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 1986). Исследование одобрено Комиссией по вопросам этики Тихоокеанского океанологического института им.
В.И.Ильичева ДВО РАН.
Кровь для исследований собирали из шейной вены животных в пробирку с 1%-м раствором гепарина. Выделение эритроцитов и получение эритроци-тарных мембран осуществляли по общепринятым методам. Состояние антиоксидантной системы в эритроцитах оценивали по активности супероксид-дисмутазы (КФ 1.15.1.1) и уровню восстановленного глутатиона, перекисное окисление липидов по концентрации малонового диальдегида [8]. Антиради-кальную активность исследовали по методу [12]. Липидные экстракты из эритроцитарных мембран готовили по методу [10]. Хроматографическое распределение фосфолипидных фракций проводили на стеклянных пластинках (6*6 см) методом двумерной микротонкослойной хроматографии на отечественном силикагеле марки «КСК». Использовали системы растворителей, предложенные G.Rouser et al. [13]: в первом направлении - хлороформ : метанол : аммиак (28%-ный) (65:25:5 или 65:35:5 об./об.), во втором - хлороформ : ацетон : метанол : ледяная уксусная кислота : вода (30:40:10:10:5 или 50:20:10:10:5
об./об.). Для проявления всех фосфолипидных фракций и их количественного определения применяли молибдатный реактив [15]. Результаты выражали в процентах от общей суммы фракций фосфолипидов. Результаты обрабатывали по параметрическому критерию Стьюдента (t), используя статистическую программу Instat (Graph Pad Software Inc.USA, 2005).
Результаты исследования и их обсуждение
Выживаемость животных после интоксикации окислами азота составляла 40%, тогда как предварительное введение калифена или элеутерококка способствовало выживаемости 70% животных. Активность супероксиддисмутазы (СОД) в эритроцитах после интоксикации окислами азота снизилась на 48% (6,80±0,75 ед/мг белка против 13,00±0,42 ед/мг белка в контроле; р<0,001).
Таблица
Содержание фосфолипидных фракций в эритроцитах крыс при поражении окислами азота (в процентах от суммы всех фракций; М±м)
Показатели Г руппы животных
1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа
ФХ 37,49±0,54 32,69±0,60б 34,74±0,661 33,37±0,58
ЛФХ 7,23±0,21 12,40±0,31б 10,48±0,402 11,21±0,371
СМ 13,30±0,34 17,56±0,44б 15,96±0,392 16,49±0,41
ФЭ 23,16±0,45 19,69±0,47б 21,08±0,501 20,88±0,49
ЛФЭ 4,12±0,13 7,77±0,20б 5,36±0,163 5,77±0,203
ФС 4,72±0,11 4,34±0,10а 4,53±0,07 4,44±0,05
ФИ 5,59±0,10 3,35±0,08б 4,30±0,113 4,27±0,073
ФК 4,39±0,07 2,20±0,05б 3,55±0,063 3,57±0,073
Примечание: различия достоверны с контролем: а - р<0,05; б - р<0,001; со 2-й группой: 1 - р<0,05; 2 -р<0,01; 3 - р<0,001. Фракции липидов: ФХ - фосфатидилхолин, ЛФХ - лизофосфатидилхолин, СМ - сфин-гомиелин, ФЭ - фосфатидилэтаноламин, ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин, ФС - фосфатидилсерин, ФИ -фосфатидилинозит, ФК - фосфатидная кислота.
При этом, величина антирадикальной активности (АРА) была снижена на 42% (8,82±0,21 ед. тролок-са/мг белка против 15,20±0,30 ед. тролокса/мг белка; р<0,001), а восстановленного глутатиона (Г-SH) на 50% (0,90±0,02 нмоль/мг белка по сравнению с 1,81±0,03 нмоль/мг белка в контроле; р<0,001). Такое соотношение компонентов системы антиоксидантной и антирадикальной защиты предполагает ее истощение. Тот факт, что величина малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах крыс после интоксикации была на 50% выше, чем таковая в контроле (9,71±0,30 мкмоль/мл против 6,47±0,22 мкмоль/мл в контроле; р<0,001), свидетельствует об активации перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов и повышение их проницаемости.
Влияние калифена и элеутерококка на содержание фосфолипидных фракций в эритроцитах крыс при поражении окислами азота представлено в таблице. Изменения в фосфолипидном спектре мембран эритроцитов также подтверждают нарушения их проницаемости. Это проявлялось в увеличении содержания лизофосфатидилхолина (ЛФХ) на 72% (р<0,001) и лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) на 89% (р<0,001), что обусловлено активированием фосфолипазы А2 под действием токсиканта и радикальных продуктов его метаболизма. При этом наблюдалось достоверное снижение содержания основного структурного компонента мембран - фосфа-тидилхолина (ФХ) на 13% (р<0,001) и фосфатидилэ-таноламина (ФЭ) на 15% (р<0,001). Обращает на себя внимание снижение количества фосфатидилинозита (ФИ) на 40% (р<0,001) и фосфатидной кислоты (ФК) на 50% (р<0,001), которые необходимы для функционирования мембраносвязанного фермента №+-К+-АТФазы. Компенсаторной реакцией на повышение проницаемости мембран является увеличение количества сфингомиелина (СМ) на 72% (р<0,001).
Введение калифена или элеутерококка в течение 14 дней до интоксикации окислами азота (соответственно, 3-я и 4-я группы) способствовало тенденции к
восстановлению изученных биохимических характеристик эритроцитов по сравнению с таковыми показателями во 2-й группе (окислы азота). Активность СОД при введении калифена была выше таковой во
2-й группе на 47% (10,00+0,70 ед/мг белка; р<0,001), АРА на 32% (11,63±0,33 ед. тролокса/мг белка; р<0,001), Г^Н на 28% (1,15+0,02 нмоль/мг белка; р<0,001). При введении элеутерококка активность СОД увеличилась на 32% (9,00+0,53 ед/мг белка; р<0,05), АРА на 15% (10,12±0,26 ед. тролокса/мг белка; р<0,01), Г^Н на 14% (1,03+0,02 нмоль/мг белка; р<0,001). Количество МДА при введении калифена снизилось на 18%, что составляло 8,00+0,26 мкмоль/мл (р<0,001), а при введении элеутерококка на 11%, что составляло 8,60+0,28 мкмоль/мл.
При сравнении величин фосфолипидных фракций в эритроцитах крыс при профилактическом введении препаратов до интоксикации окислами азота также следует отметить достоверные отличия от таковых показателей во 2-й группе. Так, при профилактическом введении калифена количество ФХ достоверно увеличилось, в среднем, на 6% (р<0,05), а СМ и ЛФХ снизилось, на 9% и 15% (р<0,01), соответственно. При введении элеутерококка количество ФХ и СМ оставалось на уровне 2-й группы, а ЛФХ снизилось на 10% (р<0,05). Обращает на себя внимание равнозначное увеличение при введении обоих препаратов количества ФИ на 27-28% (р<0,001) и ФК на 61-62% (р<0,001).
Профилактическое введение калифена и элеутерококка до интоксикации окислами азота способствовало тенденции к сохранению системы антиокси-дантной защиты и фосфолипидной составляющей эритроцитарных мембран. Однако степень выраженности нормализующего эффекта различалась в зависимости от использованного растительного полифе-нольного комплекса: наиболее эффективно процесс восстановления отмечался при введении калифена, так как большинство исследуемых показателей были наиболее близкими к контрольным значениям. Био-
химическим механизмом восстановления антиокси-дантной и антирадикальной систем защиты эритроцитов является свойство полифенольных структур, входящих в калифен и элеутерококк, улавливать свободные и оксигенные радикалы [14]. Мембранопротекторный эффект объясняется тем, что молекулы полифенолов, взаимодействуя с поверхностью мембран, способны образовывать мономолекулярные слои, увеличивающие прочность поверхностного слоя клеток, и, соответственно, снижая возможность атаки радикалами [1]. Кроме того, полифенолы препаратов являются ингибиторами фосфолипаз [11], что подтверждается достоверным снижением уровня лизофракций фосфолипидов. Известно, что в состав элеутерококка входит активная группа изомерных флавоноидных содинений (элеутерозиды), не образующих олигомерных форм. В составе калифена присутствуют полимерные вещества (олигомерные и полимерные проантоцианидины), которые демонстрируют антиоксидантные свойства в большей степени, чем мономеры элеутерококка. Таким образом, ка-лифен и элеутерококк, обладая антиоксидантными, антирадикальными и мембраностабилизирующими свойствами, по-видимому, снимали опасность глубокого нарушения функционального состояния эритроцитов, что увеличивало выживаемость животных.
Выводы
1. Интоксикация окислами азота в концентрации 4,0 мг/м3 сопровождается истощением системы анти-оксидантной и антирадикальной защиты, рассогласованием фосфолипидной составляющей мембран эритроцитов, что обусловливает изменение их размерных характеристик и осмотической устойчивости к гемолизирующему агенту.
2. Растительные полифенольные препараты ка-лифен и элеутерококк повышают выживаемость животных при профилактическом введении до интоксикации окислами азота.
3. Предварительное введение калифена в большей степени обладало защитным эффектом на антиоксидантную, антирадикальную функцию, размерные характеристики и фосфолипидную составляющую мембран эритроцитов, чем таковое при введении элеутерококка.
ЛИТЕРАТУРА
1. О механизме взаимодействия некоторых фла-воноидов с фосфатидилхолином клеточных мембран / Афанасьева Ю.Г. [и др.] // Хим.-фарм. журнал. 2007. Т.41, №7. С.12-14.
2. Венгеровский А.К, Маркова И.В., Саратиков
А.С. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фарм. комитета. 1999. №2. С.9-
12.
3. Иванова А.С., Пахрова О.А., Назаров С.Б. Влияние длительной нитритной интоксикации на эритроцитарную систему беременных крыс и их потомство // Гиг. и сан. 2007. №2. С. 63-66.
4. Кропотов А.В. Экспериментальный отек легких и его фармакопрофилактика антигипоксантами: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. СПб., 1997. 45 с.
5. Биологически активные добавки как основа сохранения здоровья и продления профессионального долголетия / Кушнерова Н.Ф. [и др.] // Вестник ДВО РАН. 2007. №6. С.65-72.
6. Кушнерова Н.Ф., Рахманин Ю.А. Влияние интоксикации оксидами азота на метаболические реакции печени и профилактика поражений // Г иг. и сан. 2008. №1. С.70-73.
7. Кушнерова Н.Ф., Лесникова Л.Н., Кушнерова Т.В. Изменения физиологических и структурных характеристик эритроцитов у лоцманов-операторов // Бюл. физиол. и патол. дыхания. 2008. Вып.29. С.34-38.
8. Новгородцева Т.П., Эндакова Э.А., Янькова
B.И. Руководство по методам исследования параметров системы «перекисное окисление липидов-антиоксидантная защита» в биологических жидкостях. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2003. 78 с.
9. Спрыгин В.Г., Кушнерова Н.Ф. Калина - новый нетрадиционный источник олигомерных проан-тоцианидинов // Хим-фарм. журнал. 2004. Т.38, №2.
C.41-45.
10. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue // Biol. Chem. 1957. Vol.226. P.497-509.
11. Kropacova K., Misurova E., Hakova H. Protective and therapeutic effect of silymarin on the development of latent liver damage // Radiats. Biol. Radioecol. 1998. Vol.38, №3. P.411-415.
12. Antioxidant activity applying an improved ABTS+ radical cation decolorization assay / Re R. [et al.] // Free Radic. Biol. Med. 1999. Vol.26, № 9-10. P.1231-1237.
13. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. Column chromatographic and associated procedures for separation and determination of phosphatides and glicol-ipids // Lipid chromatogr. Anal. N.Y.: Dekker, 1967. Vol.1. P.99-162.
14. Influence of a series of natural flavonoids on free-radical generating systems and oxidative stress / Sanz M.J. [et al.] // Xenobiotica. 1994. Vol.24, №7. P.689-699.
15. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M.
A universal reagent for phospholid analysis // J. Chromatography. 1975. Vol.114, №1. P.129-141.
Поступила 28.07.2010 Наталья Федоровна Кушнерова, заведующая лабораторией биохимии,
690041, г. Владивосток, ул. Балтийская, 43;
Natalia F. Kushnerova, 43, Baltiyskaya Str., Vladivostok, 690041;
E-mail: [email protected]
