CC BY
22
ПРЕПАРАТЫ
ПРОБЛЕМА КОНТРОЛЯ И СТАНДАРТИЗАЦИИ АЛЛЕРГОВАКЦИН
Федосеева В. Н.,1 Камышева В. АКравченко С. А,2 Некрасов А. В./ Пучкова Н. Г./ Медведев С. А./ Радунская С. Ф.,2 Невская Л. В.,2 Лавренчик Е. И.2
1 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА РФ
2 Г ИСК им. Л. А. Тарасевича, Москва
1
Проблема стандартизации сложных препаратов, созданных на основе аллергенов (аллерго-вакцины, аллерготропины и др.) является чрезвычайно актуальной. «Аллерготропины» созданы в ГНЦ — Институте иммунологии ФМБА РФ на основе комплекса аллергоидов пыльцы тимофеевки, березы и иммуномодулятора полиоксидония (патент РФ №2073031). Препараты являются чрезвычайно эффективными при лечении поллинозов. Определение подлинности аллерготропинов — один из основных тестов в оценке качества препаратов. Разработана система контроля подлинности пыльцевых аллерготропинов. По нашим данным надежным критерием подлинности пыльцевого компонента в составе аллерготропинов является их специфическая lgG-связывающая активность. Второй составляющий компонент аллерготро-пина — полиоксидоний определяется на основе эффекта взаимодействия полиоксидония с ионами меди.
Ключевые слова: аллерготропины, полиоксидоний, аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ), тест-системы ИФА.
В настоящее время при производстве сложных по составу аллерговакцин обязательным является проведение стандартизации и контроля по следующим показателям: подлинность, присутствие главных аллергенов в препарате, биологической, специфической активности. Проблема стандартизации аллергенов является чрезвычайно важной в аллергологии, так как любые нарушения стандартных норм при производстве сложных форм аллерготропинов, аллерговакцин в клиническом выражении может иметь самые тяжелые и непредсказуемые реакции у больных с аллергией. Тем не менее, существующая система стандартизации аллергенов и их сложных модифицированных форм чрезвычайно далека от совершенства и требует самого пристального внимания специалистов-аллергологов. В качестве примера разработки методологии контроля подлинности сложных препаратов, созданных на основе модифицированных аллергенов и иммуномодулятора, могут быть рассмотрены аллерготропины.
Разработка системы контроля подлинности аллерготропинов
Примером сложных препаратов являются аллерготропины (АТ), в состав которых входит аллергоид (специфический компонент) и полиоксидоний (имму-номодулятор) (ПО). Это обстоятельство диктует необходимость разработки оригинальных технологий и критериев оценки специфического 1дЕ- и 1д0-связывания для АТ, которые являются препаратами, аналогов которым не существует в мировой практике (разработаны
в ГНЦ — Институте иммунологии ФМБА РФ, патент РФ №2073031).
Как показали предыдущие исследования, комплексные препараты АТ являются чрезвычайно эффективными при лечении поллинозов. АТ из пыльцы тимофеевки, березы и ПО обладают сниженной аллергенной активностью в сравнении с нативными аллергенами соответствующей пыльцы. Отсутствие риска стимуляции реакций анафилактического типа при введении АТ в сенсибилизированный организм свидетельствовало о безопасности АТ. Показано, что АТ на основе аллергоидов пыльцы тимофеевки и березы отвечают главным критериям качества лечебных форм аллергенов: специфически активны, безопасны и клинически эффективны.
Наличие в составе АТ полиоксидония позволило повысить иммуногенные свойства препарата, в частности, их способность стимулировать синтез специфических 1дв (блокирующих) — антител (5, 6,7, 10, 11). Выявленные позитивные свойства АТ свидетельствовали о перспективности их применения в аллергологии как препаратов нового поколения. Однако, в связи с тем, что АТ являются комплексными препаратами, специального решения требовал вопрос разработки методологии контроля их подлинности с учетом активности каждого из входящих в АТ компонентов.
АТ не имеют аналогов среди терапевтических форм аллергенов. В связи с этим, существующие методические подходы к оценке качества аллергенов не соответствуют общепринятым критериям анализа специфичности и подлинности для АТ. АТ требуют разработки
€
^'Март
2010 г.
специальных методических подходов, учитывающих обе составляющие препаратов: пыльцевой аллергоид и иммуномодулятор — ПО. В соответствии с требованиями ГИСК им. Л. А. Тарасевича, Фармакопейного Комитета, Министерства здравоохранения Российской Федерации, Этического Комитета при МЗ РФ, все препараты должны быть проконтролированы и охарактеризованы по определенным критериям, отражающим их специфические характеристики [2, 11]. Помимо изучения подлинности, специфичности и безопасности АТ требуют разработки специальной тест-системы для определения их 1дЕ- и 1д0-связывающих свойств.
Цель настоящего исследования — разработка системы контроля подлинности пыльцевых АТ. В качестве одного из критериев подлинности в данном проекте был использован эффект специфического 1д0-связы-вания блокирующих антител с АТ.
Указанный эффект является наиболее надежным критерием подлинности пыльцевого компонента в составе АТ, так как основан на специфических свойствах аллергоида в составе АТ, позволяющих в процессе иммунотерапии вызвать стимуляцию синтеза специфических 1дО-антител к пыльцевому аллергену. Второй составляющий компонент аллерготропина — ПО, подлинность которого определяется на основе эффекта взаимодействия ПО с ионами меди.
Материалы и методы __
Аллергоиды из пыльцы тимофеевки и березы, представляющие собой модифицированные формальдегидом аллергены, получали по методам, разработанным в Институте иммунологии ФМБА РФ [6, 7, 9, 19]. Получение аллергоидов из пыльцы тимофеевки (Phleum pratense) и березы (Betula vulgaris) осуществлялось на основе очищенных нативных аллергенов пыльцы тимофеевки и березы с использованием модифицированного метода Marsh и Райкиса [11,2, 14].
Изучение подлинности аллергоида в составе аллер-говакцин «ТИМПОЛ» (тимофеевка) и «БЕРПОЛ» (береза) проводили методом ИФА (в авторской интерпретации). Подлинность ПО в составе аллерговакцины определялась на основе эффекта взаимодействия ПО с ионами меди. Контроль проводили в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.
Результаты и обсуждение
Установлено, что белок-полимерные комплексы АТ стимулируют повышенную продукцию 1дО-антител. Это происходит, с одной стороны, за счет белковой (антигенной) части комплекса, каковой является аллергоид, а с другой стороны — активатора клеток иммунной системы — ПО (сополимер Ы-окиси 1,4-этиленпиперазина и Ы-карбоксиэтил — 1,4-этиленпиперазиний бромида), регистрационный номер 96/302/9, патент РФ №2073031 [3,4].
Снижение аллергенных свойств позволяет вводить большие дозы препарата, что значительно сокращает курс аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) [1, 5, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 20]. Пыльцевые АТ реко-
мендуется применять лицам с гиперчувствительностью к пыльце растений, особенно в случаях, когда лечение больных стандартными нативными аллергенами практически невозможно [12, 13]. Присоединение ПО к аллергоиду усиливает иммунный ответ и снижает риск возникновения осложнений при введении конъю-гированных с ПО препаратов в сенсибилизированный организм. Один из этапов исследования заключался в разработке теста на подлинность присутствия в АТ специфического пыльцевого компонента.
Определение подлинности пыльцевого компонента в аллергоидах (из пыльцы тимофеевки^ березы)
Были сформированы две группы образцов сывороток крови больных поллинозом: с высокими уровнями специфических 1дО-антител [14] и, параллельно, — группа образцов из сывороток, которые не содержали специфических 1дО-антител к указанным видам пыльцевых аллергенов. Эти образцы были использованы в качестве отрицательных контролей.
В связи с отсутствием в мировой практике «ИФА тест-систем» с фиксированными на твердой фазе АТ, возникла необходимость разработки собственной тест-системы, создание которой требовало изучения свойств сорбции АТ на планшетах различных торговых фирм.
Способность фиксации АТ на планшетах была изучена в экспериментах с использованием полимеров разного качества, в том числе зарубежных и отечественных фирм («Грайнер», «Костар», «Лабсистемс» и др). Оптимальная степень фиксации АТ была достигнута на планшетах высокой сорбции фирмы «Медбиополи-мер» (Россия). Именно эти планшеты были использованы для создания тест-системы ИФА при работе с аллерготропинами «ТИМПОЛ» и «БЕРПОЛ».
Разработка позитивных и негативных контролей для^остановки ИФА
В процессе эксперимента, при изучении специфического 1д0-связывания позитивных образцов сывороток крови соответствующей специфичности с АТ, параллельно отмечали отсутствие специфического 1д0-связывания этих препаратов с контрольными отрицательными сыворотками крови. Контрольная — позитивная сыворотка должна содержать специфические 1дО-антитела к аллергенам одного вида пыльцы: тимофеевки или березы (по интенсивности в ИФА не менее 3 класса связывания). В исследовательской лаборатории был создан банк сывороток крови больных с классом реакции на аллерген тимофеевки и березы 3-4 класса, прошедших курс АСИТ аллергеном тимофеевки и аллергеном березы.
В таблицах 1 и 2 проводятся данные статистической обработки результатов по определению подлинности АТ «БЕРПОЛ» и «ТИМПОЛ» (число сывороток в каждой серии — 8). Показатели оптической плотности (ОП) для контрольной — позитивной (положительной) сыворотки различных АТ варьировали в пределах 1,5-3,2. Пока-
2
ПРЕПАРАТЫ
затели оптической плотности (ОП) для контрольной — негативной (отрицательной) сыворотки варьировали в пределах 0,07-0,11. Показатели оптической плотности (ОП) для контроля конъюгата были: ОП контр.< ОП отрицат. = 0,05-0,099.
Определение подлинности АТ на присутствие в аллерготропинах полиоксидония
Подлинность ПО измерялась по количественному содержанию ПО в АТ. Количественное определение содержания ПО основано на эффекте образования окрашенных в голубой цвет металлполимерных комплексов, которые образуются при взаимодействии ПО с ионами меди. Наличие других компонентов (аллергоида) оказывает незначительное влияние на результат определения.
Препарат (АТ) растворяют при перемешивании в растворе натрия хлорида. Затем полученный раствор переносят в пробирку, прибавляют 0,005 М раствор меди, перемешивают и выдерживают 15 мин. Измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 663 нм, в кювете толщиной слоя 1 см. В качестве контрольной пробы используют раствор, полученный при смешивании раствора натрия хлорида и 0,005 М раствора меди сульфата. Содержание ПО (X) в г на 1 флакон препарата вычисляют по формуле:
(^оп.проба ^контр.) * * V2
(е1%1см*100ГП
где Ооп Ппоба — оптическая плотность опытной пробы при ¡663 нм,
С*контр — оптическая плотность контрольной пробы без ПО. равная 0,05,
Е 1°/0-|СМ — удельный показатель поглощения, равный 4,1,
п — количество флаконов, равное 5, VI и У2 - объемы разведения, равные соответственно 6,2 и 6 мл.
Примечание. Содержание ПО в 1 флаконе должно быть не менее 0,056 г и не более 0,069 г. Показатели контролей подлинности АТ-препаратов «ТИМПОЛ» и «БЕРПОЛ», полученные в лабораторных условиях, были подтверждены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а разработанный способ контроля признан соответствующим требованиям нормативной документации (НД).
Таким образом, обоснована целесообразность разработки оригинальных тест-систем и критериев оценки специфического 1дО-связывания при определении подлинности пыльцевых компонентов, входящих в состав АТ, а также разработки теста на подлинность присутствия в АТ одного из компонентов — ПО.
Эксперименты показали, что созданные препараты аллергоидов из пыльцы тимофеевки и березы, входящие в состав АТ, а также ПО, соответствуют требованиям ГИСКа по подлинности вышеназванных компонентов. Созданная система определения подлинности АТ, использованная при разработке пыльцевых АТ «ТИМПОЛ» и «БЕРПОЛ», была представлена в ГИСК им Л. А. Тарасевича. Результаты экспертизы — положительные.
:(D-Dnnr 0,0180
X
Литература
1. Адо А. Д. // «Общая аллергология» — М. — 1978 — 464 с.
2. Государственная Фармакопея СССР — М. — 1998 —XI — 1,2 т.
3. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Некрасов А. В.//В сб.: Вакцины третьего поколения, ВНИИ ММТИ МЗ СССР — М. — 1987 —с. 1-37.
4. Петров Р. В., Хаитов Р. М., Гущин И. С. и др.// Докл. АМН — 1989 —т. 283 —N6 —с. 1513-1516.
5. Федосеева В. Н., Некрасов А. В., Ильина Н. И., Хаитов Р. М., Петров Р. В. //5-й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммуно-фармакологии» — М — Сб. тр. — 2002 — т. 1 — с. 91-112.
6. Федосеева В. Н.//5-Й Конгресс «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофар-макологии» — Сб. тр. — 2002 — М. — т. 2 — с. 486.
7. Федосеева В. Н., Камышева В. А., Читаева В. Г. и др.//»Материалы V съезда иммунологов и аллергологов» СНГ - С - П. — 2003 — с.83.
8. Фрадкин В. А., Рошаль Н. И.//Методические рекомендации. «Проведение диагностики аллергии тестом укола (прик-тест)». — М. — 1985.
9. Фрадкин В. А.// «Диагностические и лечебные аллергены» — М. — «Медицина» — 1990 — с. 356.
10. Хаитов Р. М., Федосеева В. Н., Некрасов А. В. и др.//Иммунология — 1996 — №6 — с.40-42.
11. Хаитов Р. М., Федосеева В. Н., Некрасов А. В., Камышева В. А. и др.// «Аллергия, астма и клиническая иммунология» — М. — 2003 — т. 7 — №9 — с. 9-14.
12. Хутуева С. X.// «Бронхиальная астма» — Нальчик — 1988 — с. 127.
13. Хутуева С. X., Федосеева В. И.// «Аллергия и экология» — Нальчик — 1990 — с. 70.
14. Walsh D.J , Matthews J. A, Demmeade, R;//lnt. Arch. Allergy Immunology — 1990 — p. 419-425.
15. Grammer L. G., Shaughnessy M. A., Bernhard M. I. et al.//J. Allergy Clin Immunol. — 1987 — v. 80 — p. 177-183.
16. Guerra S, Allegra L, Blasi F, Cottini M.// Allergy — 1998 — Sep;53(9) - 863-869.
17. Lowenstein H, Wihl JA, Bache Billesbolle K, Bowadt H. //Allergy. — 1984 —Aug -39(6) — p. 421-32.
18. Medrala W., Wolanczyk-Medrala A., Wrzyszcz M. et al.// Int.Rev. Allergol. Clin. Immunol. — 1999 — vol. 5 — No 1.
19. Petrov R.,Khaitov R.,Fedoseeva V. et al.//XVII World Asthma Congress — St.-P. — Russia — 5-8 july, 2003 — v. 4 — №47 — p. 95.
20. Verini M, Rossi N, Verrotti A, Pelaccia G, Nicodemo A, Chiarelli F.//Sci Total Environ — 2001 — Apr 10 — 270(1) — p. 63-9.
€
£Март 2010 г.
Результаты специфического «БЕРПОЛ»
Аллерготропин
БЕРПОЛ
Мат. ожидание М Доверит, интервал т Сравнение результатов
Разность М2 — М | Уровень значимости р
Мат. ожидание М Доверит, интервал т Сравнение результатов
Разность М2 — М^ Уровень значимости р
Мат. ожидание М Доверит, интервал ш Сравнение результатов
Разность М2 — М | Уровень значимости р
Таблица 1
1дС-связывания при определении подлинности белок-полимерного комплекса АТ
сер. 7 АТ
0,094 0,0238
0,0175 >0,05
1,534 0,096
1,984 <0,001
0,1045 0,017
0,067 <0,005
По показателям оптической плотности (ОП) сер. 8 АТ сер. 9 АТ Коммер. аллерген Примечание
контроль конъюгата
0,079 0,0219
0,032 >0,05
«+» сыворотка 1,514 0,109
2,0046 <0,001
«-» сыворотка
0,099
0,0097
0,0723 <0,001
0,099 0,0171
0,012 >0,05
1,529 0,073
1,989 <0,001
0,099 0,0121
0,0723 <0,002
0,1115 0,022
3,519 0,171
0,172 0,0337
показатели ОП соответствуют требованиям НД
показатели ОП соответствуют требованиям НД
показатели ОП соответствуют требованиям НД
Таблица 2
Результаты специфического 1д0-связывания при определении подлинности белок-полимерного комплекса АТ «ТИМ ПОЛ».
Аллерготропин ТИМПОЛ
Мат. ожидание М Доверит, интервал ш Сравнение результатов Разность М2 — М[
Уровень значимости р
Мат. ожидание М Доверит, интервал т Сравнение результатов
Разность М2 — М у Уровень значимости р
Мат. ожидание М Доверит, интервал ш Сравнение результатов
Разность М2 — М| Уровень значимости р
сер. 5 АТ
0,0896 0,0236
-0,021 0,0175
>0,05
3,169 0,0506
0,014 >0,05
0,069 0,063
0,030 <0,01
По показателям оптической плотности (ОП) сер. 6 АТ сер. 7 АТ Коммер. аллерген
контроль конъюгата 0,0536 0,0527 0,0686
0,0026 0,00218 0,039
0,015
0,0158
<0,01 <0,001 «+» сыворотка
3,0602 3,098
0,0652 0,057
0,123 >0,05
«-» сыворотка 0,075 0,0126
0,024 <0,01
0,085 >0,05
0,0755 0,0076
0,0237 <0,001
3,183 0,122
0,0993 0,074
Примечание
показатели ОП соответствуют требованиям НД
показатели ОП соответствуют требованиям НД
показатели ОП соответствуют требованиям НД
