Применение ЯМР-спектроскопии 13С для анализа состава углеводов меда Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Химия растительного сырья. 1999. №4. С. 17-23.

УДК 541.63+547.917+543.42

ПРИМЕНЕНИЕ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ 13С ДЛЯ АНАЛИЗА СОСТАВА УГЛЕВОДОВ МЕДА

© А.Е. Ангервакс, Е.Г. Апушкинский* Санкт-Петербургский государственный технический университет, Санкт-Петербург (Россия) e-mail: evgueny@DA2768.spb.edu, apouch@tuexph.stu.neva.ru

Проведен ЯМР-анализ нескольких сортов меда, отличающихся как своим ботаническим происхождением, так и перенесенными температурными воздействиями. Показано, что глюкоза и фруктоза присутствуют в меде только в пиранозной форме, нагрев меда снижает содержание сахарозы и фруктозы, причем для последней меняется отношение а/р-форм, а длительное хранение увеличивает в меде содержание глюкозы (хотя отношение а/р-форм меняется несущественно) и одновременно снижает содержание фруктозы с изменением для нее отношения о/р-форм. Обнаружено непостоянство свободных конформационных энергий аномерных форм фруктопиранозы, что указывает на зависимость реакционной способности фруктозы от свойств меда. ЯМР-анализ показал, что отличия исследуемых медов по основным сахарам определяются, в основном, фруктозой.

Авторы глубоко признательны А. С. Хачатурову за помощь в проведении эксперимента и внимание к работе, а также Д.А. Пономареву за полезные замечания.

Введение

Химический состав такого натурального продукта, как мед, очень сложен и зависит от многих факторов: места и времени сбора, срока хранения и т.д. Однако основу любого натурального меда составляют глюкоза, фруктоза и сахароза. Именно они определяют такие потребительские качества меда, как вкус, питательная ценность, лечебные свойства. В небольших количествах в меде содержатся органические кислоты и минеральные соли. Об объемах потребляемого меда можно судить по данным, приведенным в журнале “Маркетинг” [1], где говорится, что в зимнее время только в Москве продается до 3 т меда в будний день и до 8 т в выходной; в конце лета и осенью цифра доходит до 15 т в день. На потребительском рынке представлены самые разные сорта меда, различающиеся по своему происхождению и условиям хранения и, как результат, по своему химическому составу (попутно заметим, что они отличаются и своей ценой). Хорошо известно, что такие моносахариды, как глюкоза и фруктоза, проявляют кольчатоцепную изомерию, существуя в виде лактольных циклов различных размеров, и могут быть устойчивы в виде фуранозных и пиранозных форм, каждая из которых в свою очередь может быть как а-, так и 0-аномером. В растворах между неодинаковыми изомерными формами достигается состояние равновесия, которое зависит от свойств растворителя, растворяемых веществ и температуры раствора [2]. Существенное влияние на состав равновесной смеси оказывает кислотность среды, поэтому можно ожидать, что растворы различных сортов меда, отличаясь содержанием органических кислот, будут иметь разное процентное содержание изомерных форм глюкозы и фруктозы. Подобные отличия могут сказываться при применении водных растворов меда в медицинских целях, ибо скорость биохимических реакций зависит

* Автор, с которым следует вести переписку

от стереохимических факторов, а как лечебное средство мед лучше всего применять в растворенном виде [3].

Экспериментальная часть

Для определения состава изомерной смеси углеводов меда был проведен ЯМР-анализ нескольких сортов меда, отличающихся как своим ботаническим происхождением, так и перенесенными температурными воздействиями. Углеродные спектры были получены на ЯМР-спектрометре фирмы “Bruker”, имеющем рабочую частоту по углероду 125 МГц, от следующих сортов меда растворенных в тяжелой воде (99.B% - D2O):

1. “Цветочный мед” фирмы “Golden nectar” (Венгрия);

2. “Акациевый мед” фирмы “Golden nectar” (Венгрия);

3. Мед п. 1, доведенный до кипения;

4. Мед урожая 1997 г. из Воронежской области;

5. Мед урожая 1993 г. из Воронежской области (полностью кристаллизовавшийся);

6. Мед п. 5, доведенный до кипения.

Отметим, что мед в образцах 4 и 5 соответствовал ГОСТ 19792-B7.

Для всех образцов углеродный спектр ЯМР состоял из 29 линий (рис. 1), отличающихся от образца к образцу только их интенсивностью. Полученные результаты сведены в таблицу 1, где каждому образцу и линии соответствует интегральная интенсивность, нормированная на суммарную интенсивность линий спектра. Кроме того, присутствует столбец, указывающий на принадлежность линии.

Для расшифровки спектров использовалась информационная база данных (RIOBD) японского Агентства науки, промышленности и технологий (AIST), доступная в сети Internet по адресу: http://www.aist.go.jp/. Задача расшифровки в данном случае облегчалась тем, что химический состав меда к настоящему времени достаточно хорошо изучен (см., например, [3, 4]) и поэтому, сравнивая снятые спектры со спектрами таких моносахаридов, как D-glucopyranose (C6H12O6) и D-fructopyranose (C6H12O6) базы RIOBD, оказалось весьма просто идентифицировать практически все линии. В тех случаях, когда линии в снятых нами спектрах оказывались неразрешенными, их суммарная интенсивность распределялась между линиями в пропорции, определяемой по спектрам, взятым из базы RIOBD, и соответствующие результаты заносились в таблицу 1.

Рис. 1. Спектр ЯМР 13С образца №2

Таблица 1. Химические сдвиги ЯМР 13С и нормированные интегральные интенсивости спектральных линий образцов меда

Химический сдвиг линии, м.д. Образец №1 Образец №2 Образец №3 Образец №4 Образец №5 Образец №6 Принадлежность линии

107.08 0.0064 0.0039 0.0037 0.0045 0.0061

104.13 0.0184 0.0105 0.0118 0.0146 0.0101 0.009 а-фруктоза

100.72 0.0407 0.0379 0.0323 0.0480 0.0329 0.0289 Р-фруктоза

98.53 0.0468 0.0470 0.0483 0.0310 0.0524 0.0560 Р-глюкоза

94.72 0.0302 0.0299 0.0288 0.0177 0.0345 0.0356 а-глюкоза

84.58 0.0092 0.0060 0.0055 0.0069 0.0075 0.0061

83.91 0.0113 0.0098 0.0095 0.0086 0.0100 0.0073 сахароза

83.29 0.0233 0.0210 0.0240 0.0263 0.0195 0.0196 а-фруктоза

78.56 0.0450 0.0465 0.0473 0.0304 0.0516 0.0546 Р-глюкоза

78.38 0.0456 0.0472 0.0480 0.0308 0.0516 0.0546 Р-глюкоза

77.96 0.0222 0.0209 0.0221 0.0297 0.0219 0.0177 а-фруктоза

77.05 0.0237 0.0237 0.0224 0.0598 0.0222 0.0216 а-фруктоза

76.76 0.0466 0.0477 0.0515 0.0318 0.0544 0.0563 Р-глюкоза

75.40 0.0390 0.0398 0.0392 0.0237 0.0454 0.0429 а-глюкоза

74.10 0.0302 0.0298 0.0290 0.0179 0.0338 0.0336 а-глюкоза

74.05 0.0370 0.0365 0.0355 0.0219 0.0414 0.0411 а-глюкоза

72.31 0.0605 0.0616 0.0584 0.0823 0.0534 0.0511 Р-фруктоза

72.27 0.0107 0.0106 0.0103 0.0063 0.0120 0.0119 а-глюкоза

72.22 0.0587 0.0607 0.0617 0.0396 0.0673 0.0712 Р-глюкоза

71.84 0.0117 0.0102 0.0099 0.0089 0.0103 0.0075 сахароза

71.84 0.0562 0.0572 0.0543 0.0765 0.0496 0.0475 Р-фруктоза

70.16 0.0636 0.0663 0.0646 0.0902 0.0562 0.0575 Р-фруктоза

66.50 0.0594 0.0630 0.0624 0.0848 0.0555 0.0536 Р-фруктоза

65.99 0.0606 0.0636 0.0641 0.0882 0.0554 0.0542 Р-фруктоза

65.54 0.0039 0.0015 0.0028 0.0052 0.0013 0.0042

65.26 0.0187 0.0073 0.0133 0.0248 0.0060 0.0199 а-фруктоза

65.03 0.0246 0.0214 0.0207 0.0186 0.0217 0.0158 а-фруктоза

63.71 0.0135 0.0118 0.0113 0.0144 0.0108 0.0100 сахароза

63.38 0.0476 0.0492 0.0501 0.0321 0.0546 0.0577 Р-глюкоза

63.22 0.0257 0.0254 0.0247 0.0152 0.0288 0.0286 а-глюкоза

Для определения линий сахарозы были сняты спектры последней (рис. 2), а также смеси меда (образец №1) и сахарозы в пропорции 1:1 (по объему) (рис. 3). Как видно из представленных рисунков, линии сахарозы значительно возросли, что позволило их быстро соотнести с линиями спектра ^исгоБе (С12Н22О11) из базы КЮББ. Непосредственная идентификация сахарозы во всех исследуемых нами образцах меда была затруднена из-за малого содержания последней в них.

Рис. 2. Спектр ЯМР 13С сахарозы

--

—/Ul___

Jl.

'—"—'----'—'-----'—I------------1---'—'-------'—'-------------------------------1--------------'—'------1—'—'------'—г

lOff I» 45 Ч) Ї5 Ї& W 7Ї bS W

l3 4 Рис. 3. Спектр ЯМР С образца №3 и сахарозы

Заметим, что в базе RIOBD не был обнаружен спектр a-D-fructopyranose и поэтому принадлежность соответствующих линий определялась исходя из знания ее структурной формулы, сравнения спектров медов со спектром (рис. 4), снятым нами от фруктозы, выпускаемой АО “Диетпродукт” (ТУ 911Q-QQ7-35937677-97), и анализа спектров, полученных с помощью методики DEPT. На DEPT-9Q исчезли линии, имеющие химические сдвиги (в м. д.) 1Q7.QB, 1Q4.13, 1QQ.72, 66.5Q, 65.99, 65.54, 65.26, 65.Q3, 63.71, 63.3B, 63.22, а на DEPT-135 первые три из перечисленных линий не появились вообще, а последние восемь поменяли знак. В спектре фруктозы АО “Диетпродукт” содержатся 1B линий, которые есть во всех спектрах медов, 12 из них принадлежат d-фруктопиранозе, остальные 6, имеющие очень незначительную интенсивность, относятся к D-сахарозе (2 линии), к D-глюкопиранозе (1 линия), а принадлежность оставшихся трех линий авторы определить не могут.

JL,

1

И.

JJu

J

ww-

-|—I-1—I—1—|—I—I—I-1—| I I—I—1—|—I—I-1—I—|—I—I—I—I—|—I—I I—I—|—I—I I—I |—I—|—1—I—|—I I—I—1—|—I—Г

110 105 100 95 90 85 80 75 70 65

ppm

Рис. 4. Спектр ЯМР 13С фруктозы

Обсуждение результатов

Таким образом, идентифицированы все линии спектров основных сахаров меда за исключением лишь трех линий, входящих в снятые спектры. Видимо, данные линии принадлежат каким-то декстринам, содержащимся в меде, и могут быть расшифрованы при более детальном анализе, например, с проведением предварительной хроматографии. В связи с тем, что неопознанные линии не принадлежат к изучаемым в настоящей работе моносахаридам, они исключены из дальнейшего рассмотрения. В результате получается, что осмыслены почти все снятые спектры, и, сравнивая интенсивности тех или иных линий для различных образцов, можно судить об изменении процентного содержания сахаров в образцах. Отметим сразу, что глюкоза и фруктоза присутствуют только в пиранозной форме. Далее, производя суммирование интенсивностей линий по всем атомам углерода, входящим в молекулу, и относя результат к общей интенсивности, получаем содержание сахаров в каждом из образцов. Полученные таким образом результаты отражены в таблице 2.

Таблица 2. Состав исследуемых сахаров в образцах меда

Образец Сахароза, % Глюкоза, % а-/в-глюкоза, % / % Ga-Gp глюкозы, ккал/моль Фруктоза, % а-/в-фруктоза, % / % Ga-Gp фруктозы, ккал/моль

№1 4 46 17/29 0.31 47 13/34 0,55

№2 3 47 17/30 0.33 40 5/35 1,12

№3 3 47 16/31 0.38 42 9/33 0,75

№4 3 30 10/20 0.40 63 17/46 0,57

№5 3 52 19/33 0.32 34 4/30 1,16

№6 2 54 19/35 0.35 33 4/29 1,14

Общие тенденции

Как видно из таблицы 2, отличие меда №2 от №1 по основным моносахарам состоит в меньшем содержании в нем сахарозы и фруктозы, причем последней за счет а-фруктозы. Нагрев меда (образец №3) снижает содержание сахарозы и фруктозы, причем для последней особенно сильно меняется отношение

а/р-форм. Сравнивая образцы №4 и №5, можно заметить, что при длительном хранении в меде увеличивается содержание глюкозы (хотя отношение а/р-форм меняется несущественно), очень заметно падает содержание фруктозы при одновременном изменении отношения а/р-форм. После нагрева (образец №6) это соотношение практически не меняется, но содержание фруктозы продолжает падать.

Содержание глюкозы

Заметим, что, согласно [2], равновесный состав водного раствора глюкозы при нормальных условиях содержит 36% а-глюкопиранозы и 64% Р-глюкопиранозы. В наших экспериментах такое соотношение оказалось в образце №2 (36% и 64% для а-глюкопиранозы и Р-глюкопиранозы соответственно). Во всех остальных образцах, не подвергшихся воздействию температуры (образцы №№ 4, 5), наблюдается весьма незначительное смещение от равновесного состояния. В медах, доведенных до кипения (образцы № 3, 6), равновесие смещено - в сторону увеличения содержания Р-глюкопиранозы.

Содержание фруктозы

Совсем другая зависимость наблюдается в случае фруктозы, для которой в нормальном водном растворе равновесное состояние достигается при 28% а-фруктопиранозы и 72% Р-фруктопиранозы [2], что очень близко к соотношению, наблюдаемому в образцах № 1 и 4. Следует отметить также очень высокое содержание фруктозы в образце №4, превышающее ее содержание в других образцах в среднем на 20%. В остальных образцах наблюдается заметный разброс в отношениях а/р-форм фруктопиранозы, что говорит об изменении разности свободных конформационных энергий аномерных форм фруктопиранозы от образца к образцу, которая, как известно [2], связана с концентрациями по формуле:

а Ор=- ЯТ1п(Ка /к в ),

где N и N - мольные доли аномеров (Ка + N = 1), Я - универсальная газовая постоянная, Т - температура (в эксперименте составляла 290 К), ва и вр - соответственно свободные конформационные энергии а- и р-аномеров. Результаты расчетов по этой формуле для глюкозы и фруктозы приведены в таблице 2. Можно заметить, что для фруктозы наблюдается существенный разброс разности энергий от образца к образцу, т.е. сильное влияние сорта и качества меда на положение равновесия процесса таутомерных превращений.

Выводы

Известно [5], что наиболее устойчивы те сахара, для которых конформационные энергии имеют наименьшие значения, а если наблюдается непостоянство этой энергии от образца к образцу, то следует ждать зависимости реакционной способности фруктозы от свойств меда. Поэтому от сорта меда будет зависеть время, за которое фруктоза включается в цепь биохимических реакций организма, что особенно важно при применении меда в медицинских целях и для быстрого восстановления или улучшения умственной и физической работоспособности. Роль фруктозы из-за своей гигроскопичности, также может быть заметной и при оценки бактерицидных свойств различных сортов меда, которые оказываются связанными с содержанием в меде воды [6, 7]. Фруктоза, как более сладкая втрое по сравнению с глюкозой и вдвое - по сравнению с сахарозой, естественно, существенно влияет и на степень сладости меда.

В заключение отметим, что проведенный нами ЯМР анализ нескольких сортов меда показал, что их отличия по основным сахарам определяются в основном фруктозой. Следует подчеркнуть, что высокая информативность ЯМР анализа (особенно при дополнении его хроматографическим анализом) в сочетании с его быстротой и легкостью используемого способа обработки полученных данных позволит досконально изучить многие особенности меда, существенные при его применении, и связать их с условиями сбора и последующего хранения.

Список литературы

1. Игнатова Е., Коноков Д., Смирнов А. Рынок продовольственных товаров // Маркетинг. 1997. №4. С. 34-42.

2. Стоддарт Дж. Стереохимия углеводов. М., 1981.

3. Чернигов В.Д. Мед. Минск, 1979.

4. Чепурной И.П. Заготовка и переработка меда. М., 1987.

5. Ногради М. Стереохимия. Основные понятия и приложения. М., 1984.

6. Molan P.C. The antibacterial activity of honey. 1.The nature of the antibacterial activity // Bee World. 1992. Vol. 73.

№1. P. 5-28.

7. Molan P.C. The antibacterial activity of honey. 2. Variation in the potency of the antibacterial activity // Bee World. 1992. Vol. 73. №2. P. 59-76.

Поступило в редакцию 11 сентября 1999 года