CC BY
71
Химия растительного сырья. 2011. №4. С. 153-156.
УДК 541.62/.636+543.42
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА 13С ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ
ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРМИЧЕСКОЙ ПРЕОБРАЗОВАННОСТИ МЕДА
© И.К. Иванова1, В.В. Корякина1, Е.Ю. Шиц1, А.И. Федорова2
1 Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения РАН, ул. Октябрьская, 1, Якутск, 677891 (Россия), e-mail: [email protected] 2ГЯкутский государственный инженерно-технический институт, ул. Строителей, 8, Якутск, 677000 (Россия)
Проведен ЯМР-анализ нескольких сортов меда, подвергнутых температурным воздействиям, В исследуемых пробах определены отношения а-/р-аномеров глюкозы и фруктозы до и после нагрева, Установлено, что термически преобразованный мед можно идентифицировать по распределению аномеров глюкозы,
Ключевые слова: кольчато-цепная таутомерия, а- и Р-аномеры, сахароза, глюкоза, фруктоза,
Введение
Мед представляет собой сложную композицию сахаров и биологически активных веществ различной природы. Причем около 90% всех сахаров созревшего меда [1] приходится на глюкозу и фруктозу. Эти моносахариды образуются из содержащейся в нектаре сахарозы под воздействием выделяемых пчелами ферментов или частично переходят из исходных веществ, поэтому в меде эти сахара содержатся в различных соотношениях [2]. В настоящее время как в России, так и за рубежом для придания меду товарного вида - жидкого и прозрачного - его подвергают термической обработке, в результате чего мед утрачивает свои полезные свойства. Поэтому важной является проблема доказательства аутентичности этого основного продукта пчеловодства. Так, одним из основных качеств настоящего меда является его кристаллизация (садка), поскольку искусственный мед, а также термически обработанный мед, не кристаллизуются и имеют жидкую консистенцию. Известно [3, 4], что кристаллизация меда обусловлена выпадением кристаллов моногидрата а-глюкозы, поэтому, чем больше а-аномеров глюкозы содержится в данном виде меда, тем выше степень его кристаллизации. Но в работах [5-7] анализ водных растворов меда методом 13С ЯМР-спектроскопии показал, что в любом меде, независимо от степени его кристалличности и термической преобразованное™, в составе аномеров глюкозы преобладает ее P-форма. В частности, авторами работы [5] исследовался полностью кристаллизовавшийся мед, а также продукты его нагревания, в результате обнаружено, что принципиальных отличий в составе проб до и после нагревания нет, и на а- и p-формы глюкозы приходится примерно 37 и 63% соответственно, т.е. в том и другом случае преобладает р-глюкоза, что противоречит работам [3, 4]. Известно, что цветочный нектар представляет собой водный раствор тростникового сахара (а- _0-глюкопиранозил-(1, 2)-р-0-фруктофуранозы) и инвертированных сахаров: по данным М. Оржевского 11,42% тростникового и 7,57% инвертированного сахара в 78,57% воды [8]. В процессе созревания нектара происходит ферментативное расщепление сахарозы с образованием a-D-глюко-пиранозы и p-D-фруктофуранозы. Одновременно эта смесь обезвоживается, затем запечатывается в таком виде в соты. Поэтому в натуральном меде должны преобладать a-аномер глюкозы и p-форма фруктозы. В то же время известно [3], что термодинамически наиболее устойчивым аномером глюкопиранозы является p-D-глюкопираноза, следовательно, нагревание меда должно сопровождаться инвертированием а-ано-мера в p-форму. На основании вышеизложенного можно предположить, что соотношение а-/р-форм глюкозы будет нести информацию о термической обработке меда, что позволит косвенно оценить качество этого основного продукта пчеловодства.
* Автор, с которым следуте вести переписку,
Цель исследования - влияние термической обработки меда на состав аномеров глюкозы и фруктозы с использованием количественной спектроскопии ЯМР.
Экспериментальная часть
В качестве объектов исследования являлись образцы меда, отличающиеся своим геоботаническим происхождением и годом сбора: №1. Мед «Разнотравие», урожай 2010 г. (Алтайский край); №2. Мед «Липовый», урожай 2010 г. (Приморский край); №3. Мед «Гречишный», урожай 2009 г. (Амурский край); №4. Мед «Разнотравие», урожай 2008 г. (Башкирия).
Эти же марки меда были подвергнуты термическому воздействию на водяной бане до перехода меда в вязко-текучее состояние с полным расплавлением его кристаллов.
Так как глюкоза и фруктоза проявляют кольчато-цепную таутомерию, в водном растворе через определенный промежуток времени они существуют в виде 5 таутомеров: а- и p-аномеров пиранозных и фура-нозных циклических форм и оксо-форме, поэтому для чистоты эксперимента нами анализировались свежеприготовленные водные пробы меда. Известно [3], что в смеси таутомеров доминируют пиранозные формы с преобладанием термодинамически более устойчивого аномера. Так, равновесный состав индивидуальных водных растворов при нормальных условиях: глюкозы - 36% a-D-глюкопиранозы и 64% P-D-глюко-пиранозы, а фруктозы - 28% a-D-фруктопиранозы и 72% p-D-фруктопиранозы.
13С-спектры (рис. 1) были получены на ЯМР-спектрометре высокого разрешения Avance III («Bruker»), имеющим рабочую частоту по углероду 100 МГц. Исследуемые образцы готовили путем растворения 200 мг меда в смеси тяжелой и дистиллированной воды (1 : 9) объемом 0,5 мл. 13С-спектры регистрировали в режиме широкополосной развязки от протонов с применением составной импульсной последовательности WALTZ-16. Параметры регистрации: количество сканов - 140, длина 30°-импульса - 21,6 мкс, время релаксации между сканами - 10 с. Фазовая коррекция и коррекция базовой линии осуществлялась с помощью пакетов, входящих в программу TopSpin. Температура проведения экспериментов - 27 °С, длительность анализов - 30 мин. Запись спектров проводилась без вращения образца. Во всех случаях были получены спектры высокого качества с шириной линий на полувысоте меньше 0,5 Гц. Все спектры калибровались относительно TSP. Отнесение химических сдвигов производили при помощи электронной базы http://www.hmdb.ca/ [9, 10], по опубликованным данным [5, 6], а также по спектрам индивидуальных веществ, снятых нами отдельно: глюкозы, фруктозы и сахарозы. Для каждой линии была рассчитана интегральная интенсивность, нормированная на суммарную интенсивность линий спектра (табл. 1). Далее, путем суммирования интенсивностей линий по всем атомам углерода, входящим в молекулу аномера, и отнесением его к общей интенсивности, было рассчитано содержание сахаров (табл. 2).
Так как полученные углеродные спектры всех водных проб меда имеют идентичный характер и отличаются только по интенсивностям отдельных линий, то рассмотрим результаты на примере образца №2. На рисунке 1 представлена область 52-108 м.д. спектров образца меда до и после термической обработки. Видно, что интенсивность пиков а-глюкозы в меде до термической обработки выше, чем p-аномера, а после термического воздействия распределение аномеров глюкозы обратное.
Во всех пробах сахароза присутствует в следовых количествах, что говорит о зрелости исследуемых проб меда, глюкоза и фруктоза содержатся в приблизительно равных пропорциях. В меде до нагревания преобладают а-глюкоза и Р-фруктоза. Причем температурное воздействие на распределение аномеров фруктозы не влияет. Вероятно, этот факт можно объяснить тем, что изначально в натуральном меде аномеры фруктозы находятся в концентрациях, близких к равновесным. В противовес этому глюкоза находится в состоянии, далеком от равновесного, а среди таутомеров доминирует неустойчивый изомер - а-глюкопираноза.
Нагрев проб привел к аномеризации а-глюкозы с образованием более термодинамически выгодного диастереомера - Р-глюкопиранозы. Это подтверждается приближением концентраций аномеров глюкозы к равновесным.
Таким образом, температурное воздействие на мед приводит к перераспределению состава глюкозы в сторону образования более термодинамически выгодного Р-аномера. Следовательно, в качестве показателя термической преобразованности меда может служить соотношение аномеров глюкозы как наиболее чувствительного к температурному воздействию.
Рис. 1. Спектры ЯМР 13С образца М3 до (А) и после (Б) его термической обработки
Таблица 1. Отнесение химических сдвигов атомов углерода углеводных аномеров различных сортов меда и их относительные интегральные интенсивности
Марка меда (место и дата сбора)
Химиче- Принад- липовый разнотравие гречишный разнотравие
ский лежность (Приморский край, (Башкирия, (Амурский край, (Алтайский край,
сдвиг, м.д. аномеру 2010 г.) 2009 г.) 2008 г.) 2010 г)
До После До После До После До После
101,48 а-фру 0,0191 0,0188 0,0205 0,0204 0,0202 0,0197 0,0202 0,0201
98,02 Р-Фру 0,0592 0,0568 0,0631 0,0634 0,0632 0,0633 0,0628 0,0597
95,86 р-ГЛЮ 0,0338 0,0533 0,0368 0,0465 0,0304 0,0477 0,0311 0,0505
92,04 а-глю 0,0546 0,0377 0,0463 0,0363 0,0528 0,0359 0,0524 0,0364
81,28 а-фру 0,0191 0,0189 0,0206 0,0204 0,0202 0,0198 0,0202 0,0201
75,83 р-глю 0,0338 0,0533 0,0367 0,0466 0,0305 0,0477 0,0311 0,0504
75,73 р-глю 0,0338 0,0533 0,0368 0,0465 0,0304 0,0477 0,0311 0,0504
75,46 а-фру 0,0191 0,0189 0,0205 0,0204 0,0202 0,0197 0,0202 0,0202
74,48 а-фру 0,0191 0,0189 0,0205 0,0205 0,0202 0,0198 0,0202 0,0202
74,11 р-глю 0,0338 0,0533 0,0367 0,0466 0,0305 0,0477 0,0311 0,0504
72,78 а-глю 0,0545 0,0377 0,0463 0,0362 0,0528 0,0358 0,0525 0,0364
71,45 а-глю 0,0546 0,0376 0,0464 0,0362 0,0529 0,0358 0,0525 0,0364
71,37 а-глю 0,0546 0,0377 0,0464 0,0362 0,0528 0,0358 0,0525 0,0364
69,69 Р-Фру 0,0591 0,0568 0,0630 0,0635 0,0632 0,0634 0,0629 0,0598
69,65 а-глю 0,0546 0,0376 0,0464 0,0362 0,0528 0,0358 0,0525 0,0363
69,59 р-глю 0,0338 0,0534 0,0368 0,0465 0,0304 0,0477 0,0311 0,0505
69,18 Р-Фру 0,0592 0,0568 0,0631 0,0635 0,0632 0,0634 0,0629 0,0597
67,60 Р-Фру 0,0592 0,0568 0,0630 0,0635 0,0632 0,0634 0,0629 0,0597
63,94 Р-Фру 0,0592 0,0568 0,0630 0,0635 0,0633 0,0634 0,0629 0,0597
63,34 Р-Фру 0,0592 0,0568 0,0630 0,0635 0,0632 0,0634 0,0629 0,0598
62,79 а-фру 0,0191 0,0189 0,0205 0,0204 0,0202 0,0198 0,0202 0,0201
62,40 а-фру 0,0191 0,0188 0,0205 0,0204 0,0202 0,0198 0,0202 0,0201
60,80 р-глю 0,0338 0,0534 0,0368 0,0466 0,0304 0,0477 0,0311 0,0504
60,67 а-глю 0,0546 0,0377 0,0463 0,0362 0,0528 0,0358 0,0525 0,0363
Таблица 2. Содержание и соотношение аномеров глюкозы и фруктозы в различных марках меда до и после их температурной обработки
Марка меда (место и дата сбора) Содержание аномера* (%) Соотношение аномеров
а-глюкоза Р-глюкоза а-фруктоза Р-фруктоза а-глюкоза / Р-глюкоза а-фруктоза/ Р-фруктоза
До термической обработки
«Разнотравие» (Башкирия, 2008 г.) 27,81±0,05 22,06±0,06 13,31±0,07 37,82±0,04 55,76/44,23 24,56/75,44
«Липовый » (Приморский край, 2010 г.) 32,75±0,06 20,28±0,07 11,46±0,07 35,51±0,05 61,76/38,24 24,40/75,60
«Гречишный » (Амурский край, 2008 г.) 31,69±0,05 18,26±0,08 12,12±0,08 37,93±0,04 63,44/36,56 24,21/75,79
«Разнотравие» (Алтайский край, 2010 г.) 31,49±0,06 18,66±0,05 12,12±0,07 37,73±0,06 62,79/37,21 24,31/75,69
После термической обработки
«Разнотравие» (Башкирия, 2008 г.) «Липовый » 21,73±0,04 27,93±0,08 12,25±0,05 38,09±0,06 43,76/56,24 24,33/75,67
(Приморский край, 2010 г.) 22,60±0,06 32,0±0,05 11,32±0,07 34,08±0,04 41,39/58,61 24,93/75,07
«Гречишный » (Амурский край, 2008 г.) 21,49±0,06 28,62±0,06 11,86±0,07 38,03±0,05 42,88/57,12 23,77/76,23
«Разнотравие» (Алтайский край, 2010 г.) 21,82±0,06 30,26±0,05 12,08±0,06 35,84±0,04 41,90/58,10 25,21/74,79
* Расчет проведен, считая за 100% содержание аномеров глюкозы и фруктозы
Как было упомянуто выше, нагретый мед не кристаллизуется, а на основании проведенного исследования становится понятно, почему мед после термической обработки имеет жидкую консистенцию и не подвергается садке, это происходит за счет аномеризации глюкозы с образованием ее P-формы, которая не кристаллизуется из воды [3].
Заключение
Проведенный ЯМР-анализ позволил установить влияние температурной обработки меда на аномерный состав глюкозы и фруктозы. Показано, что изначально в меде преобладают а-глюкоза и Р-фруктоза. Установлено, что в меде диастереомеры фруктозы содержатся в концентрациях, близких к равновесным, поэтому при нагревании их распределение не изменяется. Установлено перераспределение аномерного состава глюкозы меда после термического воздействия с образованием устойчивой p-формы. Следовательно, отношение аномеров глюкозы в меде может выступать как показатель его термической преобразованное™.
Список литературы
1, Лавренова Г.В, Медовая аптека, М.; СПб, 2005, 160 с,
2, Хорн X,, Люлльманн К, Все о меде: производство, получение, экологическая чистота и сбыт, М., 2007, 320 с.
3, Ким А.М. Органическая химия : учеб. пособие, 2-е изд. испр. и доп. Новосибирск, 2001, 814 с.
4, Чепурной И.П. Заготовка и переработка меда, М., 1987, 80 с.
5, Ангервакс А.Е., Апушкинский Е.Г. Применение ЯМР-спектроскопии 13С для анализа состава углеводов меда // Химия растительного сырья, 1999, №4, С. 17-23,
6, Consonni R., Cagliani L.R. Geographical Characterization of Polyfloral and Acacia Honeys by Nuclear Magnetic Resonance and Chemometrics // J, Agric. Food Chem, 2008, V, 56, P. 6873-6880,
7, Mazzoni V,, Bradesi P., Tomi F., Casanova J, Direct Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Mixtures Using 13C NMR Spectroscopy: Application to Honey // Magnetic resonance in chemistry, 1997, V, 35, S81-S90,
8, Младенов С. Мед и медолечение, София, 1974, 228 с.
9, Wishart DS, Knox C, Guo AC, et al., HMDB: a knowledgebase for the human metabolome, Nucleic Acids Res, 2009 37 (Database issue): D603-610,
10, Wishart DS, Tzur D, Knox C, et al., HMDB: the Human Metabolome Database, Nucleic Acids Res, 2007 Jan;35 (Database issue): D521-6.
Поступило в редакцию 27 января 2011 г.
После переработки 21 октября 2011 г.
