CC BY
11
Сельскохозяйственный журнал. 2022. №1 (15). С. 85-94 Agricultural journal. 2022. 15 (1). P.85-94
Зоотехния и ветеринария
Научная статья УДК 636.592:619
DOI 10.25930/2687-1254/011.1.15.2022
Применение ПЦР-генотипирования бактериальных изолятов в индейководстве
Алексей Витальевич Шепляков1, Лидия Александровна Шинкаренко1, Юрий Васильевич Титов1, Валерий Павлович Терлецкий2, Валентина Ивановна Тыщенко2, Оксана Борисовна Новикова3
1 СГЦ «СКЗОСП» - филиал ФНЦ «ВНИТИП» РАН. Россия, Обильное, E-mail: skzosp@yandex.ru
2 Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных. Россия, Санкт-Петербург, E-mail: valeriter@mail.ru
3 Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институтптицеводства - филиал ФНЦ «ВНИТИП» РАН. Россия, Санкт-Петербург, E-mail: ksuvet@mail.ru
Аннотация. Научными исследованиями по выявлению генетических детерминант устойчивости микрофлоры индеек с использованием праймеров в 2020-2021 гг. СГЦ «СКЗОСП» Ставропольского края совместно с отделом микробиологии ВНИВИП и лабораторией молекулярной генетики ВНИИГРЖ проводил работу, направленную на создание надежной защиты поголовья индеек от бактериальных инфекций в промышленных масштабах. Работа основана на генотипировании и ПЦР-методах для выявления генов, обеспечивающих антибиотикорезистентность бактериальных изолятов индеек. В результате выявлена геномная ДНК бактерий E. coli, установлен факт широкого распространения антибиотикорезистентности в этой группе бактерий, определены генетические детерминанты устойчивости микрофлоры индеек, создан вариант схемы ветеринарной профилактики. Метод ПЦР-генотипирования для бактериальных изолятов рекомендован к использованию в птицехозяйствах.
Ключевые слова: индейки, бактериальные изоляты, ПЦР-генотипирование, праймеры, детерминанты устойчивости
Для цитирования: Шепляков А.В., Шинкаренко Л.А., Титов Ю.В., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б. Применение ПЦР-генотипирования бактериальных изолятов в индейководстве // Сельскохозяйственный журнал. 2022. № 1 (15). С.85-94 DOI 10.25930/2687-1254/011.1.15.2022
Zootechny and veterinary science
Original article
Application of PCR genotyping of bacterial isolates in turkey breeding
1 11 2 Aleksey V. Sheplyakov , Lidia A. Shinkarenko , Yuri V. Titov , Valery P. Terletsky ,
Valentina I. Tyshchenko2, Oksana B. Novikova3
1 SGC "North Caucasus Zonal Experimental Station of Poultry"- branch of the Federal Scien-
tific Center "VNITIP" RAS. Russia, Obilnoye, E-mail: skzosp@yandex.ru
2 All-Russian Research Institute of Genetics and Farm Animal Breeding. Russia, St. Petersburg, E-mail: valeriter@mail.ru
3 All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry Farming - branch of the Federal Scientific Center "VNITIP" RAS. Russia, St. Petersburg, E-mail: ksuvet@mail.ru
Abstract. Scientific research on the identification of genetic resistance determinants of the microflora of turkeys using primers in 2020 - 2021, the SGC "North Caucasus Zonal Experimental Station of Poultry" of the Stavropol Territory, together with the Department of Microbiology of All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry Farming and the Laboratory of Molecular Genetics of All-Russian Research Institute of Genetics and Farm Animal Breeding, carried out a work, which was aimed at creating a reliable protection of the turkey livestock from bacterial infections on an industrial scale. The work is based on genotyping and PCR methods to identify genes that provide antibiotic resistance in bacterial isolates of turkeys. As a result, the genomic DNA of E. coli bacteria was revealed. The fact of widespread antibiotic resistance in this group of bacteria was established. The genetic resistance determinants in the turkey microflora were identified. A variant of the veterinary prevention measures scheme was created. The PCR genotyping method for bacterial isolates is recommended for use in poultry farms.
Key words: turkeys, bacterial isolates, PCR genotyping, primers, resistance determinants
For citation: Sheplyakov A.V., Shinkarenko L.A., TitovYu.V., Terletsky V.P., Tyshchenko V.I., Novikova O.B. Application of PCR genotyping of bacterial isolates in turkey breeding // Agricultural journal. 2022; 15(1). Р.85-94 DOI 10.25930/2687-1254/011.1.15.2022
Введение. Федеральной научной технической программой развития сельского хозяйства на 2017-2025 гг. [1] предусмотрено проведение работ, направленных на вет-профилактику и биозащиту сельскохозяйственных птиц, основанных на применении современных молекулярно-генетических методов, включающих генотипирование и ПЦР-тесты по выявлению антибиотикорезистентности патогенных бактериальных микроорганизмов [2]. В настоящее время вопрос о бактериальных инфекциях, вызывающих колибактериозы [3], изучается в индейководстве при создании профилактических схем ветпрофилактики и биозащиты. Для отрасли птицеводства проблема антибиотикорезистентности является актуальной. Снижение проблемы достигается контролируемым применением ветпрепаратов и использованием генотипирования в профилактических целях [4].
Для прогнозирования тенденции появления и распространения устойчивых штаммов необходим систематический мониторинг за антимикробной резистентностью. Одним из путей решения данной проблемы считается разработка системы контроля бактериальных болезней птиц в условиях сельскохозяйственного производства с использованием быстрой диагностической процедуры на основе ПЦР [5].
В настоящее время определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам занимает 5-6 суток, начиная от первичного посева биоматериала, заканчивая получением результатов исследований - информации о том, к каким антибактериальным препаратам чувствителен данный микроорганизм/ассоциация микроорганизмов. При возникновении эпизоотической вспышки очень важно, как можно быст-
рее определить, какие препараты будут терапевтически и экономически эффективны в каждом конкретном случае, поэтому разработка экспресс-метода определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам - одна из первоочередных задач не только в индейководстве, но и в других отраслях сельского хозяйства. По результатам предыдущих исследований для индейководов опубликован ряд материалов [6, 7].
Цель исследования. Целью научно-исследовательской работы являлось определение антибиотикорезистентности патогенной и условно-патогенной микрофлоры, выделяемой у индеек стада СГЦ «СКЗОСП» - филиала ФНЦ «ВНИТИП» РАН с помощью полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами с выявлением генетических детерминант устойчивости. В рамках достижения цели решались следующие задачи: выделение геномной ДНК микроорганизмов из биоматериала, полученного от индеек; валидация метода на группах бактериальных изолятов; молекулярно-генетическая идентификация детерминант резистентности и ее сравнение с традиционными способами определения резистентности при использовании индикаторных дисков; расчет встречаемости антибиотикорезистентности по отдельным группам антибиотиков и составление схемы ветеринарной профилактики.
Методика исследований. Исследования проводились в производственных условиях СГЦ «СКЗОСП» Ставропольского края, в отделе микробиологии ВНИВИП -филиала ФНЦ «ВНИТИП» РАН, лаборатории молекулярной генетики ВНИИГРЖ в 2020-2021 гг. Пробы внутренних органов павших индюков-самцов из племенного стада, сформированного на 2021 г., были отобраны в транспортные среды Кери-Блейра и Эймса для последующего анализа бактериальной микрофлоры и выращивания изолятов бактерий. После выращивания патогенов вида E. coli выделяли геномную ДНК. Выращенные культуры микроорганизмов изучались на предмет наличия генетических детерминант устойчивости к антибиотикам группы тетрациклинов и фторхинолонов с использованием следующих праймеров:
FloR:
AACCCGCCCTCTGGATCAAGTCAA
CAAATCACGGGCCACGCTGTATC
Cat1:
CCTATAACCAGACCGTTCAG TGAAACTCACCCAGGGATTG TetA:
GCTACATCCTGCTTGCCT
CATAGATCGCCGTGAAGA
TetB:
CCTCAGCTTCTCAACGCGTG GCACCTTGCTGATGACTCTT qnrA:
GGGTATGGATATTATTGATAAAG CTAATCCGGCAGCACTATTTA
Условия проведения ПЦР подбирались, исходя из общепринятых критериев: длины праймера, GC-содержания, продолжительности циклов, объема реакционной смеси, температуры отжига праймеров и т. д. После теоретического подбора условий
провели экспериментальную проверку эффективности ПЦР со всеми пятью комбинациями пар праймеров.
ПЦР для выявления генов антибиотикорезистентности проводили в объеме реакционной смеси согласно таблицы 1.
Таблица 1
Состав реакционной ПЦР смеси_
Количество Вода, Буфер, dNTP, Taq-полимераза, мкл Прайер 1, Прамер
проб мкл мкл мкл мкл 2, мкл
1 5,8 2 1,2 0,2 0,2 0,2
10 58 20 12 2 2 2
15 87 30 18 3 3 3
49 284,2 98 58,8 9,8 9,8 9,8
Условия проведения амплификации представлены в таблице 2.
Таблица 2
Условия проведения амплификации
Этап амплификации Температура Время Количество циклов
«Горячий старт» 94 X 3 мин. 1
Денатурация ДНК 94 X 0,5 мин.
Отжиг праймера 52 X 0,5 мин. 30
Синтез фрагмента 72 X 0,5 мин.
Завершение синтеза 72 X 5 мин. 1
После окончания ПЦП пробы отбирались из нижней фазы и вносились в лунки 1,5%-ного агарозного геля, содержащего флуоресцентный краситель бромистый эти-дий. Работа с амплифицированной ДНК проводилась в отдельном помещении и состояла из двух этапов: приготовление рабочих растворов и агарозного геля и, собственно, сам электорофорез.
Кроме этого, изоляты были охарактеризованы индикаторными дисками с серийным разведением образцов на предмет чувствительности (резистентности) к антибиотикам групп тетрациклинов, фторхинолонов и др., в настоящее время использующихся в России.
Исследования основывались на сравнительном анализе эффективности использования традиционных дисков и метода ПЦР со специфическими праймерами. Данные можно непосредственно применять при планировании ветеринарных лечебных мероприятий. Мониторинг появления и распространения антибиотикорезистентности у микроорганизмов дает возможность оценить актуальность угрозы и планировать мероприятия с использованием антибиотиков, к которым отсутствует устойчивость.
Все предлагаемые процедуры, включая отбор проб биологического материала от птиц, являются общепринятыми в лабораторной практике и полностью соответствуют
Сельскохозяйственный
журнал №1(15), 2022
законодательству России. В процессе выполнения исследования учитывались следующие показатели: число выращенных бактериальных культур (изолятов); число выявленных видов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; выявление генетических детерминант устойчивости микрофлоры индеек с использованием праймеров, количественная оценка распространенности антибиотикорезистентных штаммов.
Результаты исследований и их обсуждение. В отделе микробиологии ВНИВИП - филиала ФНЦ «ВНИТИП» РАН в процессе бактериологического исследования первичные посевы были сделаны в пробирки с мясопептонным бульоном и тио-гликолевой средой (пробы кишечника). После 24-часовой инкубации в термостате при температуре +37 оС взяли пересевы на плотные селективные и дифференциально-диагностические среды: Эндо (фото 1) и XLD-агар (фото 2) для выделения кишечной микрофлоры, мясопептонный агар (фото 3), колумбийский кровяной агар (фото 4) для выявления гемолиза. Затем проводили учет и идентификацию выросших колоний при помощи биохимических, микроскопических исследований. Пересев осуществляли на трехсахарный агар Олькеницкого, среды Клиглера и Ресселя, среду Симмонса, окраску мазков - по Граму. Чувствительность доминирующих видов микроорганизмов к антибактериальным препаратам изучали методом дисков на среде Мюллер-Хинтона (фото
5, 6).
Рост культур Escherichia coli на среде Эндо из сердца, печени и асцитической жидкости индюка № 4
Рост культур Escherichia coli на XLD-агаре из сердца индюка № 1, легких, печени и фибрина индюка № 2
Фото 1. Использование Среды Эндо Фото 2. Использование среды XLD-агара
Рост культур Escherichia coli на мясо-пептонном агаре в чашке Петрииз сердца индюка № 3, сердца, печени и асцитической жидкости индюка № 4, сердца индюка № 5
Рост культур Escherichia coli на колумбийском кровяном агаре из сердца индюка № 1, легких, печени
и фибрина индюка № 2, сердца и желчи индюка № 3
Фото 3. Использование среды мясопептонного агара
Фото 4. Использование среды колумбийского кровяного агара
Определение чувствительности культуры Escherichia coli из сердца индюка № 3 к антибактериальным препаратам методом дисков
Определение чувствительности культуры E. coli из двенадцатиперстной кишки индюка № 2 к антибактериальным препаратам методом дисков
>> Чч-
/ IP 1 ® Щ, ■Ль
ф а
и \ • $ Ф
Фото 5, 6. Применение метода дисков
Из внутренних органов самцов индеек выделены культуры кишечной палочки Escherichia col.
До выращивания микроорганизмов и определения их видовой принадлежности (традиционным методом в дифференциально-диагностических средах и методом ПЦР со специфическими праймерами к генам 16РНК) проводили диагностическую ПЦР с видоспецифическими праймерами к E. coli. Например, на рисунке 1 представлены результаты амплификации на предмет выявления геномной ДНК бактерий в биоматериале от павших индюков.
С помощью молекулярно-генетических методов выявлены гены, имеющие устойчивость к антибиотикам. Для постановки анализа подобрали специфические праймеры, с помощью которых определили антибиотикорезистентность микроорганизмов в изолятах.
Рисунок 1. Детекция бактерий в биоматериале индеек
Бактерия выявлена в образцах дорожки 5 и 6 слева (нумерация дорожек слева направо). Положительный контроль - 11-я дорожка слева, 12-я - отрицательный контроль. Результаты исследования изолятов E. coli на антибиотикорезистентность свидетельствуют о том, что все изоляты имеют ген tet(В), определяющий устойчивость к тетрациклину (таблица 3). Среди изолятов кишечной палочки только в одной пробе (9) отсутствует ген устойчивости tet(А). Среди всех изолятов ген устойчивости Catl отсутствует только в пробе 12 с кишечной палочкой. К фторхинолону не устойчивы пробы 6, 12, 15.
По итогам выполнения НИР предлагается для практического использования мо-лекулярно-генетический метод выявления генов девяти генетических детерминант, определяющих антибиотикорезистентность к антибиотикам.
Таблица 3
Идентификация антибиотикорезистентных генов в изолятах Escherichia coli (изоляты 1-16) группы тетрациклинов и фторхинолонов, _основанная на использовании специфических праймеров в ПЦР_
Проба № Праймер
Tet(ß) Tet(А) Cat1 qnrA
1 + + + +
2 + + + +
3 + + + +
4 + + + +
5 + + + +
6 + + + —
7 + + + +
8 + + + +
9 + - + +
10 + + + +
11 + + + +
12 + + — —
13 + + + +
14 + + + +
15 + + + —
16 + + + +
Заключение. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о высокой частоте встречаемости генов антибиотикорезистентности у патогенов бактериальной природы. Изучению подлежали только 16 изолятов E. Coli . При бактериологическом исследовании из внутренних органов всех индюков выделены культуры условно-патогенной микрофлоры: Escherichia coli, энтерококки, стафилококки. Культуры патогенной микрофлоры - сальмонелл, синегнойной палочки и др. - не выделены ни в одной пробе.
При необходимости ввести в схему ветеринарно-профилактических мероприятий антимикробные препараты в соответствии с выявленной чувствительностью необходима регулярная ротация препаратов в связи с высокой резистентностью микрофлоры. На основе проведенных исследований создан вариант схемы профилактических и противоэпизоотических мероприятий биозащиты для отечественного индейководства. По итогам выполнения научных исследований рекомендован метод ПЦР-генотипирования бактериальных изолятов для практического использования. Данный молекулярно-генетический метод выявления генов девяти генетических детерминант позволяет быстро определить антибиотикорезистентность к антибиотикам группы тет-рациклинов и фторфинолонов, основываясь на использовании специфических прайме-ров в ПЦР.
Благодарности: работа поддержана бюджетным финансированием по теме под номером госрегистрации 121021600202-7.
Список источников
1. Постановление Правительства Российской Федерации от 25 августа 2017 г. № 996 «Об утверждении Федеральной научно-технической программы развития сельского хозяйства на 2017-2025 годы». Текст постановления опубликован на «Официальном интернет-портале правовой информации» (www.pravo.gov.ru) 30 августа 2017 г., в Собрании законодательства Российской Федерации от 4 сентября 2017 г. N 36 ст. 5421.
2. Eltai N.O., Abdfarag E.A., Al-Romaihi H., Wehedy E., Mahmoud M.H., Alawad O.K., Al-Hajri M.M., Al Thani A.A., Yassine H.M. Antibiotic Resistance Profile of Commensal Escherichia coli Isolated from Broiler Chickens in Qatar. J Food Prot. 2018 V.81(2):302-307. doi: 10.4315/0362-028X.JFP-17-191.
3. Фисинин В.И. Стратегические тренды развития мирового и отечественного птицеводства. Ветеринария и биобезопасность в птицеводстве // Zootecnica international, том 15, № 92, июль/август 2021г., с. 34.
4. Бондарева О.С., Савченко С.С., Ткаченко Г.А., Абуева А.И., Муратова Ю.О., Антонов В.А. Современные подходы к генотипированию возбудителей особо опасных инфекций // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014. № 1. С. 34-44.
5. Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б., Шинкаренко Л.А. Генотипирование патогенных бактерий - инструмент контроля эпизоотической ситуации. // Аграрная Россия. 2020. № 8. С. 3-7.
6. Шепляков А.В., Шинкаренко Л.А., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б., Бу-равцова И.Н., Титов Ю.В. Выявление генетической структуры популяций возбудителей болезней индеек // Ставрополь, 2021, Сельскохозяйственный журнал, № 1 (14), с. 79-89.
7. Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О.Б., Шинкаренко Л.А. Генотипирование изолятов E.coli, выращенных из биоматериала индеек // Сергиев Посад, 2021, Птицеводство, № 12, с. 73-76.
References
1. Decree of the Government of the Russian Federation of August 25, 2017 No. 996 "On Approval of the Federal Scientific and Technical Program for the Development of Agriculture for 2017-2025". The text of the resolution was published on the "Official Internet Portal of Legal Information" (www.pravo.gov.ru) on August 30, 2017, in the Collection of Legislation of the Russian Federation dated September 4, 2017 N 36 section 5421
2. Eltai NO., Abdfarag E.A., Al-Romaihi H., Wehedy E., Mahmoud M.H., Alawad O.K., Al-Hajri M.M., Al Thani A.A., Yassine H.M. Antibiotic Resistance Profile of Commensal Escherichia coli Isolated from Broiler Chickens in Qatar. J Food Prot. 2018 V.81(2):302-307. doi: 10.4315/0362-028X.JFP-17-191.
3. Fisinin V.I. Strategic trends in the development of global and Russian poultry farming. Veterinary medicine and biosafety in poultry farming. Zootecnica international, vol. 15, no. 92, July/August 2021, p. 34.
4. Bondareva O.S. Modern approaches to genotyping of pathogens of especially dangerous infections / O.S. Bondareva, S.S. Savchenko, G.A. Tkachenko, A.I. Abueva, Yu.O. Muratova, V.A. Antonov // Epidemiology and infectious diseases. 2014. No. 1. P.34-44.
5. V.P. Terletsky, V.I. Tyshchenko, O.B. Novikova, L.A. Shinkarenko. Genotyping of pathogenic bacteria is a tool for controlling the epizootic situation. Agrarian Russia, 2020, No.8, p. 3-7.
6. A.V. Sheplyakov, L.A. Shinkarenko, V.P. Terletsky, V.I. Tyshchenko, O.B. Novikova, I.N. Buravtsova, Yu.V. Titov. Identification of the population genetic structure of pathogenic organisms of turkey diseases. Stavropol, 2021, Agricultural Journal, No. 1 (14), p. 79-89.
7. Terletsky V.P., Tyshchenko V.I., Novikova O.B., Shinkarenko L.A. Genotyping of E. coli isolates, which were grown from turkey biomaterial. Sergiev Posad, 2021, Poultry, No. 12, p. 73-76.
Информация об авторах
A.В. Шепляков - директор. Тел.: 8-918-792-01-97, E-mail: skzosp@yandex.ru
Л.А. Шинкаренко - кандидат сельскохозяйственных наук, заместитель директора по
научной работе. Тел.: 8-928-343-97-71, E-mail: skzospzooteh@yandex.ru
Ю.В. Титов - научный сотрудник отдела ветеринарии. Тел.: 8-928-343-97-71, E-mail:
skzosplab@yandex.ru
B.П. Терлецкий - доктор биологических наук, профессор. Тел.: 8-921-558-79-57, Email: valeriter@mail.ru
В.И. Тыщенко - кандидат биологических наук. Тел.: 8-921-558-79-57, E-mail: tinat-vi@mail.ru
О.Б. Новикова - кандидат ветеринарных наук. Тел.: 8-952-399-42-65, E-mail: ksuvet@mail.ru
Author information
A.V. Sheplyakov - director. Tel.: 8-918-792-01-97, E-mail: skzosp@yandex.ru L.A. Shinkarenko - Candidate of Agricultural Sciences, Deputy Director for Science. Tel.: 8928-343-97-71, E-mail: skzospzooteh@yandex.ru
Yu.V. Titov - Researcher at the Veterinary Department. Tel.: 8-928-343-97-71, E-mail: skzo-splab@yandex.ru
V.P. Terletsky - Doctor of Biological Sciences, Professor. Tel.: 8-921-558-79-57, E-mail: valeriter@mail.ru
V.I. Tyshchenko - Candidate of Biological Sciences. Tel.: 8-921-558-79-57, E-mail: tinat-vi@mail.ru
O.B. Novikova - Candidate of Veterinary Sciences. Tel.: 8-952-399-42-65, E-mail: ksuvet@mail.ru
Статья поступила в редакцию 17.02.2022; одобрена после рецензирования 01.03.2022; принята к публикации 20.03.2022.
The article was submitted 17.02.2022; approved after reviewing 01.03.2022; accepted for publication 20.03.2022.
© Шепляков А.В., Шинкаренко Л.А., Титов Ю.В., Терлецкий В.П., Тыщенко В.И., Новикова О Б., 2022
