Применение очищенных ферментных препаратов Амилоризин П10х и мэк-пп1 в пивоварении Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

64

— ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 2—3, 1990

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ИЙ

При сорбции эфиров уже нет строгой зависимости между удельной поверхностью и количеством адсорбируемого вещества. Очевидно, решающую роль в данном случае играет структура пор и природа адсорбируемого вещества [3], в частности его полярность. Так, для всех исследованных групп ароматических компонентов их сорбция минералами возрастает в ряду от полярных к неполярным жидкостям.

На основании проведенных экспериментов мы пришли к выводу о существовании определенной связи между химической структурой ароматического вещества и его способностью сорбироваться минералами.

ВЫВОДЫ

1. Дисперсные минералы различной природы сорбируют часть ароматических компонентов, обедняя аромат сусел и соков. С увеличением дозы минералов количество ароматических соединений в продукте уменьшается.

2. Наибольшему воздействию дисперсных минера-

лов, особенно бентонита, подвергаются терпеновые соединения муската. Поэтому для осветления ароматичных соков и напитков рекомендуется применять суспензии гидрослюды.

ЛИТЕРАТУРА

1. Киш ко вс кий 3. И., С кур их ин И. М. Хи-

мия вина.— М.: Агропромиздат, 1988.—245 с.

2. X р и с т ю к В. Т. Разработка и научное обоснование технологии осветления и стабилизации вино-материалов природными слоистыми силикатами//Авто-реф. дисс .. канд. хим. наук.— Краснодар, 1982.—28 с.

3. Кельцев Н. В. Основы адсорбционной техники,— М.: Химия, 1976,—512 с.

4. К р у г л и ц к и й Н. Н., Т р е т и н н и к В. Ю., Киселева И. Д. Реологические исследования монтмориллонитов в органических средах // Укр. хим. журн,— № 7, —1971,—С. 665—668.

5. Овчаренко Ф. Д. Гидрофильность глин и глинистых минералов.— Киев: Изд-во АН УССР, 1961.— 290 с.

Кафедра технологии

виноделия Поступила 26.02.90

663.443.+577.15.07.

ПРИМЕНЕНИЕ ОЧИЩЕННЫХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ АМИЛОРИЗИН ПЮх И МЭК-ПП1 В ПИВОВАРЕНИИ

И. И. ТРОФИМОВА, В. Г. ЮКАЛО Могилевский технологический институт

В настоящее время в производстве пива на стадии затирания при замене части солода несоложеным материалом применяются ферментные препараты, в том числе Амилоризин ПЮх и МЭК-ПП1. Степень очистки указанных ферментных препаратов предполагает их гетерогенность. Помимо ферментов они могут содержать другие белки, пептиды, различные вещества, выделяемые микроорганизмом в культуральную среду. Это может отрицательно сказываться на активности.

В связи с этим исследовали состав ферментных препаратов Амилоризин ПЮх и МЭК-ПП1 и влияние различных примесей на активность основного технологически важного фермента а-амилазы.

В работе использовался диск-электрофорез в трубочках на приборе фирмы «Неапа1» или пластинах в полиакриламидном геле ПААГ (система № 1 по Мауреру) [1] и гель-фильтрация. Применение гель-фильтрации позволяет также получить фракции ферментов в препаративных количествах.

Электрофорез проводили в течение 2 ч при /= = 40 мА, (7=400 В. После окончания электрофореза гели окрашивали красителем амидочерным ЮБ. Отмывание несвязавшегося красителя проводили раствором 7%-ной уксусной кислоты. Пробу вносили в количестве 25 мг препарата.

Для проведения гель-фильтрации использовали сефадексы 0=25 и 0=100 (средний) фирмы «РИагтааа». Сефадексы суспендировали в ацетатном буфере (0,01 М, рН=5,6) » декантировали согласно методическим указаниям фирмы. Набухший сефадекс 0=25 вносили в колонку фирмы «Иеапа!» размерами 2X35 см, а 0=100 в хроматографическую колонку 1,6X70 см. Гель-фильтрацию проводили при комнатной температуре и скорости элюции 30 мл/ч для 0=25, 18 мл/ч— 0=100.

Навеску ферментного препарата — 200 мг растворяли в 10 мл ацетатного буфера 0,01 М, рН=5,6

и 3 мл фильтрата наносили на колонку для разделения. Концентрацию белка при гель-фильтрации определяли на спектрофотометре СФ-26 по све-топоглощению при длине волны 280 нм.

Для определения молекулярной массы фракций ферментных препаратов пользовались графическим методом, для чего хроматографическую колонку калибровали с использованием индивидуальных белков с различной молекулярной массой: сывороточный альбумин М= 69000, овальбумин М= 40000 и трипсин М= 12000 и строили калибровочную прямую. Свободный объем колонки определяли по объему элюции декстрана синего.

В ферментных препаратах определяли активность а-амилазы по ГОСТ 20264.4-74, белок — по Лоури [2]. Для сравнения действия исходных ферментных препаратов и их хроматографических фракций при затирании готовили пивное сусло

£

а

ж

Рис. 1. а — ферментный препарат Амилоризин ПЮх;

б — Амилоризин ПЮх, пик I после сефадекса 0-25; в — Амилоризин ПЮх, пик I после сефадекса 0-100; е — ферментный препарат МЭК-П111; д — МЭК-ПП1, пик I после сефадекса й-25; е — МЭК-ПП1, пик I после сефадекса 0-100; ж — МЭК-ПП1, пик II после сефадекса О-ЮО

стандартным мето; ным показателям, изводстве [3].

По данным эло зин ПЮх разделж электрофоретичесю генной, и низкой электрофоретическс ветствует а-амила: авторов [4]. Преп разделяется на де Перед каждой фр; полосы из белков I ческой подвижное! ствует по подвижн|

Для определений компонентов в сос| паратов Амилориз! зовалась гель-фил Результаты предста

Лги

¥■

То 1

Рис. 2. Ферментные 2 — МЭК-ПП!

где в обоих случа формы. Объем его объемом колонки. Исходя из выбра заключить, что в продукты распада ной массой до 500( комолекулярные б< первых пиков анг электрофореза по < ным препаратом, фореграммы б в сс входит фракция I, довых количествах, молекулярные бел’ объемом выхода на Все хроматограф на активность а-ам! ная а -амилаза вх ского пика I и соот фореграмме.

Согласно электро д в состав пика фракции I и 11. I отсутствуют. Акт* только в хроматогр С целью раздел парата с учетом м щих его ферменто] на сефадексе 0-100 На хроматограм] ПЮх получено дв-

могил Мі 4.1990

іІКТСЯ ч-рсиновьіг і о:в2і.і«і;и<і £ ці КїНСЕДуйІЧ'Ч прх

у-?. Л. М Хн-

и

н іуЧч)« "ЇІУН. Гг!Іі-ін:ідин,: .ичп-

*• • ІЧЛ^ХЙ VII/ / ^ І и

Ч-І'Г :9К2. !;сі ... |1Ни~ІІПіТ ЛгЧПЩИ

н К М II к в. |Г> 1І.'М-..0ЛІЛ чігя киї >т

'. ! < .••■ Ухр 41,».

Иагъ глн.і х -.п.і-ЇСС.Р .рЬІ _

НЗ 577.15.07.

ІА РА Ю В

ним

ОЛЗИ Иу Д.1Я [Ій і К Г^.іі . ф'НІІЬІ р.; і

[і-.- СФ :-!ґі по ЙІІЯ* ч.«.

.чїі;:ь фрак і.и іі ІСЬ грм ||| -ічс-с КП V ЧСС!^ н.' колонку

Н.-ІЗ/ІЬ ПДЇ-иЛЬКГ-.І*; ЛіІССОї": "ИВОрО

нрн Аї і((ГОйО і

ро Б 0111 іу Ку лря І'ЛССЯ-ІЧ п« объ

гл'.ія-м актив-} -і- 71. Опіок П£НЯ іі:'М.і/ІК,ЬЇ:;

’.іітсгряфччсскну;

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 2 -3. 1990 —

65

ТЛГ

[шин ГК0\,

і .^іі.мікі'.і О-ІЛі; ^гйалгкі:;. 0-іг»і-! м.

Ьргей 0-^5.

Гфьу-ТІГіір О-11)1);

й-Ши.

пстандартным методом и анализировали по основным показателям, принятым в пивоваренном производстве [3].

По данным электрофореза, на рис. 1 Амилори-зин П10х разделяется на две фракции с высокой электрофоретической подвижностью I, более гомогенной, и низкой II, включающей ряд белков. По электрофоретической подвижности фракция I соответствует а-амилазе, согласно результатам других авторов [4]. Препарат МЭК-ПП1 электрофорезом разделяется на две гомогенные фракции I и II. Перед каждой фракцией располагаются размытые полосы из белков с более высокой электрофоретической подвижностью. Фракция I также соответствует по подвижности а-амилазе.

Для определения содержания низкомолекулярных компонентов в составе исходных ферментных препаратов Амилоризин П10х и МЭК-ПП 1 использовалась гель-фильтрация на сефадексе 0=25. Результаты представлены на хроматограммах рис. 2,

Лги1 і

Рис. 2. Ферментные препараты: /— Амилоризин П10х;

2 — МЭК-ППI

где в обоих случаях виден один пик правильной формы. Объем его выхода совпадает со свободным объемом колонки. Затем выходят размытые пики. Исходя из выбранного вида сефадекса можно заключить, что в состав размытых пиков входят продукты распада белков, пептиды с молекулярной массой до 5000. В состав пика I входят высокомолекулярные белки и ферменты. Содержимое первых пиков анализировали с помощью диск-электрофореза по сравнению с исходным ферментным препаратом, рис. 1 б, д. Согласно электро-фореграммы б в состав пика I Амилоризина П10х входит фракция I, фракция II присутствует в следовых количествах. Очевидно, она включает низкомолекулярные белковые компоненты с большим объемом выхода на сефадексе 0=25.

Все хроматографические фракции анализировали на активность а-амилазы. Было показано, что активная а -амилаза входит в состав хроматографического пика I и соответствует фракции I на электро-фореграмме.

Согласно электрофореграмме фракции МЭК-ПП 1 д в состав пика I входят электрофоретические фракции I и II. Размытые фракции практически отсутствуют. Активная а-амилаза обнаружена только в хроматографическом пике I.

С целью разделения белков ферментного препарата с учетом молекулярной массы составляющих его ферментов проводилась гель-фильтрация на сефадексе 0-100.

На хроматограмме (рис. 3) для Амилоризина П10х получено два хроматографических пика с раз-

Рис. 3. Ферментные препараты: 1 МЭК-ПП1; 2— Амилоризин П10х

личным объемом выхода, для МЭК-ПГП — три пика. В каждом пике определяли содержание белка по Лоури, активность а-амилазы и анализировали белковый состав с помощью диск-электрофореза в ПААГ.

Электрофоретический анализ хроматографических фракций ферментного препарата Амилоризин ШОх (рис. 1 в) показывает, что хроматографическая фракция I соответствует первому компоненту с низкой электрофоретической подвижностью на электрофореграмме. Фракция II включает низкомолекулярные белковые продукты, которые не проявляются на электрофореграмме. Судя по электрофоретической подвижности а-амилаза находится во фракции I.

Электрофоретический анализ хроматографических фракций ферментного препарата МЭК-ПП 1 (рис. 1 е, ж) показывает, что хроматографическая фракция I соответствует второму компоненту с низкой электрофоретической подвижностью на электрофореграмме. Хроматографическая фракция II представлена первым компонентом на электрофореграмме. Фракция III включает низкомолекулярные белковые продукты, которые не проявляются на электрофореграмме. Судя по электрофоретической подвижности а-амилаза находится во фракции II.

Таблица 1

Показатели Исходный ферментный препарат Хроматографические фракции

I II III

Амилоризин П10х

Молекулярная

масса — 6700 10000 —

Белок, мг — 4,579 5,245 —

Уд. активность

белка, ед/мг 6,77 40,8 МЭК-ПП1

Молекулярная

масса — 112200 67000 14000

Белок, мг — 0,749 1,227 2,151

Уд. активность

белка, ед/мг 26,8 — 221,6 —

Характеристика хроматографических фракций ферментных препаратов по молекулярной массе, содержанию белка и активности а-амилазы представлена в табл. 1. Из таблицы видно, что активность а-амилазы для ферментного препарата Амилоризин П10х не определилась во фракции II,

ob

для МЭК-ПП1 не определилась во фракциях I и III. Это указывает на отсутствие фермента и подтверждается данными по определению молекулярной массы.

Фракции ферментных препаратов, содержащие а-амилазу, использовали для приготовления пивного сусла с заменой 30% солода несоложеным ячменем. Контролем служило сусло с исходными ферментными препаратами в количестве, рекомендуемом нормами при замене 30% солода несоложеным ячменем. Для получения сравнимых результатов

Таблица 2

Наименование продукта рн Кислотность, мл 1 н NaOH /100 мл сусла Со- дер- жа- ние саха- ра, г/ 100 мл сусла Отношение сахара к несаха-РУ Амин- ный азот, мг/ 100 мл сусла Общий азот, мг/ 100 мл сусла

Амилоризин ПЮх

Сусло: с ферментным препаратом 5,6 1,5 7,7 1:0,43 25,0 92,0

с очищенным ферментным препаратом 5,6 1,5 8,2 1:0,34 25,2 92,4

МЭК-ПП1

Сусло: с исходным ферментным препаратом 5,8 1,6 7,8 1:0,41 24,0 94,1

с очищенным ферментным препаратом 5,6 1,5 9,7 1:0,33 25,4 94,5

ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 2—3, 1990

фермент во фракциях задавался по активности в пересчете на 1 г белка. В результате отделения балласта в препарате Амилоризин П10х получили чистый белок фермента, активность которого превышала активность исходного ферментного препарата в 6 раз, в препарате МЭК-ПП1 — в 12 раз. Соответственно расход ферментов во фракциях сокращался в 6 и 12 раз.

Основные показатели сусла представлены в табл. 2. Как показывают данные таблицы, сусло, приготовленное с очищенным ферментом во фракциях, по кислотности, содержанию общего и аминного азота практически не отличалось от сусла с исходными ферментными препаратами. Содержание сахаров в сусле с очищенными фракциями ферментов увеличилось и соответственно изменилось соотношение сахара к несахару.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы хроматографически чистые фракции ферментов, содержащие а-амилазу, активность которой выше, чем в исходных ферментных препаратах.

2. Применение очищенных ферментов позволяет сократить их расход без ухудшения качества пивного сусла.

ЛИТЕРАТУРА

1. Mavpep Г. Диск-электрофорез.— М.: Мир, 1971.— 250 с.

2. Lowry О. Н. 1951. Protein measurent with the t'olin phenol reagent // J. Biol. Chem.—- P. 193, 265—275.

3. Мальцев П. М. Химико-технологический контроль производства солода и пива.— М.: Пищ. пром-сть, 1976,— 448 с.

4. П а в л о в а Е. С. Выделение амилолитических ферментов и изучение их роли в спиртовом производстве// Дис. ... канд. хим. наук.— 168 с.

Кафедра технологии

пищевых производств

Поступила 30.06.89

Ж

А.ІШ .

Jcf.li:'. f ici

ЛЧІ-НО- M'I'h:/' О І 'ГІОКлІг; . |||

мдрэ |>я< р:

ПУНМЄііР ІУЧ1 ■£

рю:: К: Oi у сушо.

И35Р::п::;. ' ік'тит'ур*

:;i'pc h з і і iv ;

ус:оздіі* і

ЛимрККСЯ. -I TO ГІ.ЇН i.;i f. С.'ІЇГК, I.: (Ml L-* ПЛО.'ІЙ -,h x l'-;-JHC!fCi.i4l -:u

,1 L'HUCto .......

ДИСН" К.I 1 "'.л l‘ v.4li

mis. Ря..р.-й

Ц-ЛНЯНИй ПЛ r. IJ.II pil ГН II :IЛ ТІ- '^СНГІЯ Ji E J КОгЛеЙу' П]М Г'-.' .ІЬКО I'll LI .l|K .i."-ii:i \i.pt::-TE|'i .:'T ДОЛІЯП'Л z p:i'4 ' .Ujni'.i (іГ'Г.мЗ

■i'.'p'ia I..'

IV. .1 ЛТіС 'іі u і-, ki і tv p: и л 'і

і 114 ZJL'LiH.'H I

. fcr.l'ivpiliynoii I :?i и: зерна . у

ік'к-т 11.їй ириї MTU Зїн :і' .1 і и ЛіО nt ■ h

ч.:и:"іГКОК ПІ

111 !•: I J ЕОДЧЫ.-: Д.'М ЧО 'А-.ир ІІ>- ІГЇ.ПГ Яг '-.І lift і им 1 Lie 11, и

■ІИІ'.'М .1(1 гі І"ІІ і::'н:г;-и.ЧЯЗОТИ V(. Ки ■ у LKH Г 11 іі л: ;.і н j , , =

дятея ІІІ^НІІСМ

А .пі 1 го с ні ви-l:

'71,, - 4-Ti'J

Г. її- K =

!' ІІЛ'Ї''»

J -КҐЯ

'['ся.-.о.трачс:

п.ЧГ.ГК. *Г|Ц-ГїЛЯЄІ