CC BY
60
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:616-097
ОБЩИЕ И НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ПАРАЗИТАРНЫХ
АНТИГЕНОВ
В. В. КЛИМЕНКО кандидат биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им.
К.И. Скрябина, e-mail: [email protected]
Дана краткая характеристика общих методологических подходов и приведен ряд конкретных примеров по очистке и анализу паразитарных антигенов. Поскольку очистка антигенов, повышающая эффективность диагностических тестов, не избавляет их от неспецифических реакций, для преодоления перекрестной реактивности при иммунодиагностике гельмин-тозов целесообразно создавать такие тест-системы, которые базируются на одновременной постановке реакций испытуемой сыворотки с парой, а, возможно, и большим числом гомологичных антигенов, полученных от разных видов гельминтов.
Другим перспективным направлением является использование для иммунодиагностики и иммунопрофилактики не целой молекулы антигена, а отдельных ее фрагментов, включающих или теряющих те или иные антигенные детерминанты.
Ключевые слова: паразитарные антигены, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica, иммуноблоттинг, гель-фильтрация, электрофорез.
Используемые в качестве исходных материалов для получения антигенов белковые экстракты гельминтов чрезвычайно гетерогенны. Входящие в их состав отдельные белковые компоненты неравнозначны по диагностической ценности и протективным свойствам.
Повышение диагностической специфичности неочищенных антигенных материалов путем их раститровок возможно лишь до определенного предела, после чего начинается снижение чувствительности диагностического теста. На примере фасциолеза [8], эхинококкоза [1, 9] и трихинеллеза [11] показано, что при оптимальных титрах очищенных антигенов их диагностическая специфичность выше по сравнению с неочищенными антигенами.
Поэтому нашей задачей является выделение из большого разнообразия антигенов изучаемого паразита таких антигенных белков, которые эволюционировали в большей степени и имеют у разных видов меньше структурной, а, следовательно, и антигенной общности. С другой стороны, эти белки должны стимулировать выработку антител на достаточном для обнаружения уровне и, по возможности, продолжительно, на всех стадиях инвазии.
Для этого паразитологический материал следует подвергать иммунохи-мическому анализу и, с учетом динамики соответствующих антител в процессе инвазии, определять перспективность того или иного антигенного компонента, а затем проводить его выделение и очистку.
В связи с огромным разнообразием белков в составе исходных паразито-логических материалов (с одной стороны) и сходством многих белков по
своим физико-химическим характеристикам (с другой стороны), выделение и очистка того или иного белка - дело весьма непростое.
Обычно для очистки нужного белка применяют комплекс методов, основанных на разных принципах. Если при использовании одного метода не удалось освободиться от сопутствующих белков, сходных с очищаемым антигеном по тому критерию, который положен в основу метода, то при последующем использовании другого метода, основанного на другом принципе, свойства антигена и оставшихся в препарате примесей могут различаться, что будет способствовать их разделению. Чем больше методов будет использовано (конечно, в разумных пределах), тем большей степени очистки антигена можно достигнуть.
Применяют различные, главным образом, хроматографические методы, реже - другие, принцип которых основан на использовании, например, гравитации (ультрацентрифугирование) или разделения в электрическом поле (электрофорез и электрофокусирование). Последние все же предпочтительнее использовать не в препаративных ,а в аналитических вариантах, не для очистки, а для анализа материалов, полученных в результате хроматографиче-ского фракционирования исходных белковых смесей.
Самыми распространенными хроматографическими методами являются гель-фильтрация (название - неудачное, поскольку здесь имеет место не фильтрация, а типичный хроматографический процесс), ионообменная хроматография, адсорбционная хроматография, гидрофобная хроматография, хроматофокусирование, аффинная хроматография.
Последняя выгодно отличается от перечисленных методов, принцип которых основан на использовании различий в физико-химических свойствах разделяемых веществ, а эти свойства у многих белков сходны. Принцип аффинной хроматографии основан на использовании специфической биологической активности очищаемых веществ, в частности, антигенной или ферментативной. Это резко увеличивает разрешающую способность метода. Если при гель-фильтрации достигается примерно 10-кратная степень очистки антигена, то при аффинной хроматографии она повышается в сотни раз. Тем не менее, очищенный этим методом белок не лишен примесей.
С помощью аффинной хроматографии нами проведена очистка диагностических антигенов фасциол, эхинококков и трихинелл. Для очистки двух последних были синтезированы аффинные сорбенты, в которых лигандами были моноклональные антитела, взаимодействующие только с одним антигенным компонентом исходной смеси. Связавшийся с сорбентом антиген можно затем десорбировать, изменив режим и, таким образом, получить его в очищенном виде. После этого сорбент может быть повторно использован [3].
Очистку антигена фасциол, оказавшегося протеолитическим ферментом, проводили на сорбенте, в котором лигандом служила аминокислота фенила-ланин, являющаяся ингибитором протеиназ [2].
Использование варианта аффинной хроматографии, основанного на использовании не иммунологических, а функциональных (в частности, ферментативных) свойств антигена всегда предпочтительнее, так как не требуются моноклональные антитела, получение которых - сложная и дорогостоящая процедура, не говоря уже о необходимости их обязательной очистки перед использованием в качестве лиганда. К сожалению, функциональные свойства антигенов, с которыми работают иммунологи, неизвестны и практически никто этим не занимается. В лучшем случае, определяют молекулярную массу антигена, да и то на субъединичном уровне. Так, по нашим данным, основной антигенный компонент эхинококковой жидкости, обладающий диагностической ценностью, имеет молекулярную массу не ниже 600 кД, если судить по его поведению при гель-фильтрации на сефадексе 0-200. Однако при электрофорезе в денатурирующей системе (в присутствии додецилсульфата натрия), а именно в этих условиях проводят анализ, он распадается на субъеди-
ницы, молекулярная масса одной из которых 38 кД [4]. В зарубежной литературе этот антиген известен под названием «arc 5» и является основным диаг-ностикумом при эхинококкозе, который, по мнению ВОЗ, не смогли превзойти диагностикумы, полученные методами биотехнологии.
Принципы известных хроматографических методов со ссылками на соответствующие методические руководства изложены в нашем прежнем обзоре [5]. Несмотря на то, что все они основаны на разных принципах, их объединяет одно общее свойство - разделение фракционируемых веществ происходит благодаря их распределению между подвижной и неподвижной фазами. Неподвижной фазой является гранулированный гель, которым заполнена колонка, подвижной фазой - растворитель (в нашей работе - буферный раствор), пропускаемый через колонку после внесения в нее исследуемого образца. Вытекающую из колонки жидкость собирают небольшими порциями равного объема (фракциями) и, таким образом, разделившиеся белки оказываются в разных пробирках. Присутствие нужного вещества во фракциях определяют с помощью аналитических методов. Фракции, содержащие нужное вещество, объединяют в общий пул, остальные отбрасывают.
Наиболее удобным для такого анализа методом является диффузионная преципитация в агаровом геле, позволяющая анализировать многочисленные фракции на всех этапах фракционирования.
Для проведения иммунодиффузионного анализа необходим набор высокоактивных иммунных сывороток, уровень антител в которых находится в пределах чувствительности метода. Концентрация антигенов во фракциях также должна соответствовать этому критерию. Так, например, эхинококковая жидкость в естественной концентрации (до 1 мг/мл по белку) в преципи-тиновых тестах обычно неактивна, поэтому мы ее предварительно концентрировали в 30-60 раз в целлофане против сухого полиэтиленгликоля.
Многие сыворотки зараженных животных и людей зачастую не дают реакции преципитации, поэтому для работы приходится подбирать из большого числа испытуемых сывороток лишь положительные, дающие максимальное количество полос преципитации.
На рисунке 1 приведены результаты реакции нескольких сывороток животных и людей с концентратами исходных антигенных материалов. Эти сыворотки реагировали с антигенами, образуя по несколько полос преципитации. Обращает на себя внимание, как возможный диагностикум, основной антигенный компонент, выявляемый всеми активными сыворотками во всех антигенных материалах.
Рис.1. Характеристика антигенного спектра эхинококковой жидкости (Echinococcus granulosus) и соответствующих антител в сыворотках реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле: D и C - концентраты эхинококковой жидкости разных серий; 1 - пул фракций, соответствующих пику 1 при гель-фильтрации концентрата на сефадексе G-200 (см. рис. 3); 5, 11, 14, 15, 17, 18 - рабочие номера сывороток больных людей с подтвержденным эхинококкозом; 1-40 - смесь 40 сывороток овец с подтвержденным эхинококко-зом (в преципитиновом тесте - неактивна)
Информативность и простота метода диффузионной преципитации особенно ценна при хроматографическом фракционировании, когда приходится анализировать сотни фракций.
Электрофорез и иммуноблоттинг, ввиду их громоздкости, лучше использовать для анализа не отдельных фракций, а объединенных пулов фракций на конечных и некоторых промежуточных этапах очистки антигенов. На рисунке 2 показаны результаты анализа посредством иммуноблоттинга антигена протеиназы фасциол на разных стадиях очистки.
1 2 3
Рис.2. Анализ антигенных материалов Еазс1о1а НвраИса методом иммуноблоттинга:
1 - антиген - протеиназа фасциол (молекулярная масса 28кБ), частично очищенный гель-фильтрацией на сефадексе О-100; 2 - антиген - протеиназа, полученный на сефадексе G-100 и дополнительно очищенный аффинной хроматографией; 3 - неочищенный белковый экстракт Е. НвраИса
Приведем несколько примеров, иллюстрирующих процессы получения и анализа иммунологически активных продуктов.
На рисунке 3 приведен график фракционирования концентрата эхинококковой жидкости методом гель-фильтрации на сефадексе 0-200.
10 20 30 40 50 60 70
Рис. 3. Гель-фильтрация концентрата эхинококковой жидкости овец на сефадексе О-200. По горизонтали - номера фракций, по вертикали (Т%) - процент светопропуска-ния при фотометрировании фракций при длине волны 280 нм; 1-5 - номера пиков
При иммунологическом анализе фракций основной диагностически ценный компонент в виде интенсивной полосы преципитации обнаружен во фракциях, соответствующих на графике первому пику, тогда как некоторые другие компоненты отделяются, попадая во фракции, относящиеся к последующим пикам (рис. 4А). Отделяются также и многие сывороточные белки хозяина, обычно присутствующие в жидкости эхинококковых цист, откуда был взят исходный материал (рис. 4В). Однако по результатам той же реакции преципитации некоторые другие белки паразита и хозяина остаются в составе фракций, относящихся к первому пику. То же показал и электрофорез (рис. 5).
Рис. 4. Распределение паразитарных антигенов и белков хозяина во фракциях, полученных при гель-фильтрации концентрата эхинококковой жидкости на сефадексе G-200 (реакция диффузионной преципитации в агаровом геле): 1-36 - номера фракций; А - в центральных лунках сыворотка человека с подтвержденным эхинококкозом; В - в центральных лунках сыворотка кролика, иммунизированного сывороткой овцы (коммерческий препарат)
Рис. 5. Электрофоретический анализ материалов, полученных в результате
фракционирования концентрата эхинококковой жидкости на сефадексе G-200. Градиент концентрации полиакриламидного геля 5-20 % с добавлением додецилсуль-
фата натрия: К - исходный нефракционированный материал (концентрат); 1-4 - пулы фракций, соответствующие пикам 1-4 на графике фракционирования (рис. 3); М - маркерные белки с известной молекулярной массой (кД): фосфорилаза
В (94), сывороточный альбумин (67), овальбумин (43), карбоангидраза (30), ингибитор трипсина (20), лактальбумин (14,4); 38 - субъединица антигенного компонента эхинококковой жидкости с молекулярной массой 38 кД
В диагностическом антигенном препарате не должно быть белков хозяина, в особенности иммуноглобулинов, поскольку они могут напрямую взаимодействовать с конъюгатом, применяемым в иммуноферментном методе, и, таким образом, обусловливать ложноположительные реакции в диагностических тестах.
Для дальнейшей очистки основного антигенного компонента пул фракций, соответствующих первому пику и диапазону коэффициента распределения Кау на сефадексе G-200, был подвергнут фракционированию методом ионообменной хроматографии на DЕАЕ-сефадексе А-50 (рис. 6).
20 40 Б0 ВО
Рис. 6. Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе А-50 с использованием
ступенчатого градиента концентрации соли: Исходный образец - пул фракций, соответствующих первому пику на сефадексе в-
200 (см. рис. 3); стартовый буфер - 0,02 М трис^О, pH 8,0; E 280 - оптическая плотность (экстинкция) на спектрофотометре при длине волны 280 нм. По горизонтали - номера фракций (20-80); 1-6 - номера пиков оптической плотности; пунктирная линия - ступени градиента концентрации №0; M - молярность раствора
Реакция преципитации (рис. 7) и электрофорез (рис. 8) показали, что основной антигенный компонент с молекулярной массой 38 кД попадает во фракции, относящиеся к пикам 4 и 5. Это соответствует ступеням градиента концентрации соли 0,2-0,3 М и 0,3-0,4 М (рис. 6). Причем, компонент с молекулярной массой 38 кД распределяется по пикам 4 и 5 примерно в одинаковых количествах, но с разным составом и количеством примесей (рис. 8).
Рис. 7. Иммунологический анализ антигенных материалов, полученных с помощью ионообменной хроматографии на DEAE-сефадексе A-50: 1 - пул фракций, соответствующих пику1 на сефадексе в-200 (см. рис. 3); 0,2; 0,3; 0,4 - концентрация солевого раствора в молях, при которой получен антигенный материал; 11, 14, 15, 18 - рабочие номера сывороток людей с подтвержденным эхинококкозом (в центральных лунках)
Рис. 8. Электрофоретический анализ исходных антигенных материалов эхинококка и полученных в результате фракционирования методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии:
Градиент концентрации полиакриламид-ного геля 5-20 % с добавлением додецил-сульфата натрия; К - концентрат эхинококковой жидкости; М - маркерные белки с известной молекулярной массой (94, 67, 43, 30, 20, 14,4 кД); 1 - пул фракций, соответствующих пику 1 при фракционировании концентрата на сефадексе G-200 (исходный материал для ионообменной хроматографии); 2-5 - антигенные препараты, полученные на ионообменнике из
исходного материала при различных концентрациях соли: 2-0,2 М; 3-0,25 М;
4-0,3 М; 5-0,4 М
Чтобы убрать часть примесей из пула фракций пика 4 и приблизить его по степени очистки к пику 5, мы ввели дополнительную ступень градиента концентрации соли - 0,25 М (рис. 9). Реакция преципитации показала, что белки хозяина попадают во фракции, соответствующие пикам 1-4а, а основной антигенный компонент остается во фракциях, относящихся к пикам 4б и 5 (рис. 10).
-280
м
D.S О.Б
0.4 0.2
1-3 ,-----
4а 1 г------1
1 | 1 г\ 4с
--1- 1 -1--•- • \ Б •
20
40
БО
D.4
0.2
so
Рис. 9. Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе A-50 с использованием ступенчатого градиента концентрации соли: Исходный образец - пул фракций, соответствующих пику 1 на сефадексе G-200 (см. рис. 3); стартовый буфер - 0,02 М трис-НС1/0,2 М NaCl, pH 8; E 280 - оптическая плотность (экстинкция) на спектрофотометре при длине волны 280 нм. По горизонтали - номера фракций; 1-3, 4а, 4б, 5 - номера пиков оптической плотности, соответствующих градиентам концентрации NaCl 0,2; 0,25; 0,3; 0,4 М
Введение дополнительной ступени градиента в первых опытах показало удаление части балластных белков из пула фракций пика 4 при сохранении
основного антигенного компонента. Однако последующие опыты со ступенью градиента 0,25 М показали, что основной антиген начинает уходить, хоть и в небольшой степени, вместе с удаляемыми балластными веществами (рис. 10).
оЛЬ№А 0,25)УД0'3
1
0,25 Ч^З 0.25^
0,25^
^,4 ^0,3
0,2
0,4
Ч0,4
*Ь,25
0,2
0,25,-^0,4
оД^'0,25
0,4
0,2
0,25,.- V0'4
0,3^X^0,25 0,4
0,2
0,25 - 0,4
0,3 - 0,25 0,4
Рис. 10. Иммунологический анализ антигенных материалов, полученных на ионообменнике DEAE-сефадексе А-50 (реакция диффузионной преципитации в
агаровом геле):
1 - пул фракций, соответствующих пику 1 на сефадексе в-200 (исходный материал для ионообменной хроматографии, см. рис. 3); 0,2; 0,25; 0,3; 0,4 - ступени градиента концентрации соли, при которых получен антигенный материал (см. рис. 9); 11, 15, 17 - рабочие номера сывороток людей с подтвержденным эхинококкозом; 19 - сыворотка кролика, иммунизированного эхинококковой жидкостью
После того, как в предварительных опытах были определены и уточнены параметры элюции основного антигенного компонента эхинококковой жидкости, стало возможным отменить многоступенчатый режим элюирова-ния и проводить ионообменную хроматографию всего в две ступени градиента. Для этого взяли концентрацию стартового буфера 0,25 М, что позволило избавиться от основного количества примесей. В этих условиях балластные белки, попадавшие прежде во фракции, соответствовавшие пикам 1-4а (см. рис. 6, 9), не сорбируются ионообменником и выходят в составе фракций первого пика. А сорбировавшийся, благодаря высокому заряду, основной антигенный компонент можно элюировать повышением концентрации соли с 0,25 до 0,4 М (второй пик). Результаты анализа продукта, полученного по этой схеме, приведены на рисунке 11 . Эти результаты были получены не только при использовании DЕАЕ-сефадекса А-50, но и DЕАЕ-сервацела и DЕАЕ-сефарозы ^-6В.
Таким образом, основной антигенный компонент практически весь оказывался во фракциях, соответствующих одному пику при упрощенном, а, следовательно, и более экономичном градиенте концентрации соли, при минимальном количестве примесей. В очищенном препарате вместе с основным антигенным компонентом остается еще один преципитирующий антиген, хорошо выявляемый сывороткой 15, для которой этот дополнительный компонент является основным. Он выявляется и сывороткой 11, в которой уровень антител к этому компоненту ниже, чем в сыворотке 15. Этот второй антиген в большой степени был удален при повышении градиента до 0,25 М, но значительное его количество остается в препарате и лишь дополнительные методологические приемы позволяли от него избавиться [4].
Рис.11. Электрофоретический анализ очищенного антигена, полученного из эхинококковой жидкости гель-фильтрацией и последующей ионообменной хроматографией:
1 - концентрат эхинококковой жидкости;
2 - антигенный препарат, полученный из концентрата на сефадексе G-200 (пул
фракций, собранных в диапазоне коэффициента распределения (Kav) 0-0,2,
пик 1) и дополнительно очищенный на DEAE-сефадексе А-50 при концентрации соли в диапазоне 0,25-0,4 М; 38 - молекулярная масса основного компонента (кД)
Сочетание гель-фильтрации и ионообменной хроматографии в той последовательности, которая описана выше, включает громоздкий процесс предварительного концентрирования эхинококковой жидкости. Если же сначала проводить ионообменную хроматографию, а не гель-фильтрацию, то одновременно с освобождением антигенного материала от балластных примесей происходит, благодаря его сорбции на ионообменнике, и концентрирование. В процессе элюции он выходит из колонки в многократно меньшем объеме, чем исходная эхинококковая жидкость, хотя потом его также приходится немного подконцентрировать перед проведением гель-фильтрации.
Следует отметить, что сефадексы и ионообменники на основе сефадекса, а также многочисленные их аналоги с другими матрицами являются гелями, применяемыми в так называемой стандартной хроматографии, имеющей многие недостатки. Более современной является хроматография высокого давления или, как ее еще называют, высокоэффективная хроматография, в которой применяются те же методы, что и в стандартной хроматографии.
Однако, благодаря созданию гелей более тонкого зернения и более однородных по размерам гранул, высокоэффективная хроматография характеризуется высокой разрешающей способностью при высокой скорости процесса. При этом исключается необходимость предварительной обработки гелей и заполнения ими колонок. Последние поставляются в заполненном виде и не требуют переупаковки.
На рисунке 12 приведены графики фракционирования эхинококовой жидкости методом гель-фильтрации на высокоэффективной колонке с супер-озой 6 в хроматографической системе FPLC шведской фирмы Pharmacia -LKB. Число пиков на графике превосходит число пиков на сефадексе G-200 почти в 2 раза, хотя многие из них в антигенном отношении не представляют интереса. Однако основной антигенный компонент, который на сефадексе оказался в составе фракций первого пика, на суперозе 6 обнаружен во фракциях 13-15 (максимум антигенной активности в 14-й фракции), т. е. в промежутке между двумя первыми пиками, которые на сефадексе вообще не могли разделиться. Это резко увеличило степень очистки основного антигенного компонента уже на первом этапе - при гель-фильтрации. Второй этап (ионообменная хроматография) также был выполнен в высокоэффективном вари-
анте на колонке Mono Q с использованием упомянутого двухступенчатого градиента концентрации соли [4].
Рис. 12. Высокоэффективная хроматография эхинококковой жидкости овец на су-перозе 6 в системе FPLC. Верхний график - запись фракционирования образца на рекордере (детектирование при 280 нм). Нижний график с нумерацией фракций и пиков вычерчен принтером/плоттером
Очистка антигенного белка, повышающая его диагностическую специфичность, все же не избавляет диагностические тесты от неспецифических (перекрестных) реакций, так как эти реакции обусловлены не только сопутствующими примесями, но и самой молекулой антигена, несущего на своей поверхности несколько антигенных детерминант, неравнозначных по своей специфичности.
Специфичность того или иного диагностического теста зависит от особенностей структуры антигена и соответственно антител, а не от примененного иммунологического метода, который всего лишь регистрирует факт взаимодействия антигена с антителом. Мы сочли нужным это отметить в связи с преувеличением роли иммуноблоттинга, как метода, якобы способного уточнить диагноз [6].
Одним из способов преодоления перекрестной реактивности при иммунодиагностике гельминтозов мы считаем создание таких тест-систем, которые базируются на одновременной постановке реакции испытуемой сыворотки с парой (а, возможно, и большим числом) гомологичных антигенов, полученных от разных видов гельминтов. Гомологичными являются родственные белки, выполняющие у разных биологических видов одинаковую функцию и
имеющие одинаковое название. При большом структурном сходстве они, в зависимости от вида могут различаться по аминокислотной последовательности, что обусловливает их неодинаковую антигенность.
В плане изучения зависимости иммунологической специфичности антигенных белков гельминтов от эволюционных изменений их структуры мы, используя масс-спектрометрический метод показали значительные различия в пептидных картах антигена - протеиназы двух видов фасциол [7]. Это свидетельствует о множественности аминокислотных замен, происшедших в процессе эволюции и обособления этих видов. Однако этих замен оказалось недостаточно для проявления иммунологической специфичности. Реакция диффузионной преципитации продемонстрировала иммунологическую идентичность сравниваемых белков, а различия проявились лишь в величине титров. Эти различия свидетельствуют о том, что при наличии общих антигенных детерминант у этих белков появились и детерминанты, характерные для каждого вида.
При одновременном использовании пары таких антигенов можно проводить дифференциальную диагностику близких гельминтозов, не только фасциолезов, но и, например, таких тяжелых заболеваний, вызванных разными видами эхинококков, где дифференциальная диагностика более актуальна. С каким из пары антигенов реакция испытуемой сыворотки будет сильнее, тем паразитом и обусловлена инвазия. Одновременная постановка реакции сразу с двумя антигенами позволяет сделать заключение, что разница в интенсивности реакции обусловлена в одних случаях разными инвазиями, а в других - различными титрами антител при одной и той же инвазии.
Другим перспективным направлением представляется использование для иммунодиагностики и иммунопрофилактики не интактных антигенных белков, как это обычно делается, а отдельных фрагментов белковой молекулы, включающих или теряющих те или иные антигенные детерминанты.
Расщепление молекулы антигенного белка на фрагменты (пептиды) приводит к нарушению его структуры и, как следствие, к разрушению антигенных детерминант. Вместе с тем, открываются детерминанты, которые ранее были экранированы, а также образуются новые детерминанты.
Это обычно имеет место в ходе естественного иммунологического процесса, когда захваченная В-лимфоцитом молекула антигена атакуется внутриклеточными протеиназами, после чего фрагменты молекулы антигена с новыми детерминантами выносятся на поверхность лимфоцита, прикрепляясь к белкам главного комплекса гистосовместимости, и распознаются Т-лимфоцитами [10].
Для получения антигенов на уровне отдельных детерминант могут быть использованы те или иные протеолитические ферменты, в частности, трипсин, широко используемый для анализа пептидных карт. Однако более естественным было бы использование для этой цели лейкоцитарных протеиназ.
Короткие пептиды, которые могут быть антигенными детерминантами, не будут иммуногенными при вакцинации, так как необходимым условием иммуногенности является высокая степень полимерности. Да и в диагностических тест-системах пептид с низкой степенью полимерности трудно будет посадить на поверхность титровального планшета. В связи с этими обстоятельствами, короткий пептид, являющийся антигенной детерминантой, можно ковалентно связать с полимерным носителем, не проявляющим антиген-ности, например, с сывороточным альбумином того вида животного, который предстоит иммунизировать. Такие работы известны.
Вышеизложенные методологические подходы могут быть применены к антигенам, получаемым как из естественных источников, так и с помощью биотехнологии.
Литература
1. Белозеров С.Н. Диагностика ларвального эхинококкоза свиней // Ветеринария. - 1985. - № 1. - C. 37-39.
2. Клименко В.В. Очистка главного антигенного компонента Fasciola hepatica и его функции в организме этого гельминта // Тр. Всерос. ин-та гель-минтол. - 1992. - Т. 31. - С. 59-73.
3. Клименко В.В. Опыт использования биоспецифической адсорбционной (аффинной) хроматографии для очистки диагностических антигенов гельминтов // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2000. - Т. 36. - С. 65-81.
4. Клименко В.В. Очистка диагностического эхинококкового антигена сочетанием методов гель-фильтрации и ионообменной хроматографии в их стандартных и высокоэффективных вариантах // Тр. Всерос. ин-та гельмин-тол. - 2000. - Т. 36. - С. 82-84.
5. Клименко В.В. иммунохимический анализ антигенов гельминтов, способы их получения и перспективы практического использования // Тр. Все-рос. ин-та гельминтол. - 2002. - Т. 38. - С. 78-130.
6. Клименко В.В., Лукеш Ш. Перспективы использования иммуноблот-тинга для дифференциальной диагностики гельминтозов // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2004. - Т. 40. - С. 125-138.
7. Клименко В.В. Сравнительное изучение структуры антигена - протеи-назы (гемоглобиназы) у Fasciola hepatica и Fasciola gigantica // Матер. докл. науч. конф. Всерос. о-ва гельминтол. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - М., 2006. - Вып. 7. - С. 173-175.
8. Хатыб-Заде О.Е., Баллад Н.Е., Клименко В.В. Разработка тест-системы ИФА для определения антител к антигенам Fasciola hepatica для серодиагностики фасциолеза человека // Матер. докл. науч. конф. «Гельминтозоонозы -меры борьбы и профилактики». - М., 1994. - С. 173-174.
9. Belozyorov S.N., Klimenko V.V. Life diagnosis of larval echinococcosis in pigs by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) // Proceedings: The Second International Symposium Taeniasis/Cysticercosis end Hydatidosis/Ehinococcosis (2-7 December 1985. Ceske Budejovice). - Ceske Budejovice, 1986. - P. 16-24.
10. Lanzavecchia A. Antigen-specific interaction between T and B cells // Nature. - 1985. - V. 314, № 6011. - P. 537-539.
11. Reiterova K., Dubinsky P., Klimenko V.V. et al. Comparison of Trichinella spiralis larva antigens for the detection of specific antibodies in pigs // Vet. Med. -Czech, 1999. - V. 44, № 1. - P. 1-5.
The general and new approaches to reception of parasitic antigens
V.V. Klimenko
The characteristic of the general methodological approaches is given and concrete examples on clearing and the analysis of parasitic antigens is given. As the clearing of antigens raising efficiency of trouble-shooting tests, does not relieve them of nonspecific reactions, for overcoming cross reactance at immunodiagnosis of helminthosis is expedient to create such test-systems which are based on simultaneous statement of reactions of tested whey with pair and probably and the big number homologous antigens received from different species of helminths.
Other perspective direction is use for immunodiagnosis and immunoprophy-laxis not the whole molecule of antigene and its separate fragments including either losing those or other antigenic determinants.
Keywords: parasitic antigens, Echinococcus granulosus, Fasciola hepatica, immunobloting, gel-filtration, electroforesis.
