CC BY
239
270 Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2007. №9/1(59).
УДК 519.999
ВЫДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ ИЗ ГЕМОЛИМФЫ ЛИЧИНОК GALLERIA MELLONELLA
© 2007 П.П.Пурыгин, О.С. Срибная,1 Н.А. Кленова, Д.Н. Худякова;2
Е.Г. Литвинова, М.Н. Кондрашова, А.А. Овсепян3
В работе исследована антибактериальная активность гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella. С помощью ионообменной хроматографии и гель-электрофореза из гемолимфы выделены белковые фракции с антибактериальной активностью. Масс-спектрометрический анализ фракций показал присутствие пептида с массой 5627 Да. По-видимому, данный пептид и определяет антибактериальную активность гемолимфы.
Введение
В настоящее время насекомые привлекают к себе пристальное внимание исследователей как источники биологически активных веществ. В последние годы из насекомых выделено большое число антимикробных пептидов, которые по силе действия сопоставимы с антибиотиками и могут быть использованы для лечения бактериальных и грибковых инфекций [1-3].
Уникальным представителем мира насекомых является большая восковая моль Galleria mellonella L из семейства огневок (Pyralidae, Lepidoptera). Большая восковая моль уже несколько веков используется в народной медицине как средство для лечения туберкулеза и мужского бесплодия. Она получила свое название за чрезвычайно редкую для животных способность переваривать и усваивать пчелиный воск, благодаря наличию фермента церазы. Наличие этого фермента позволяет личинкам переваривать и воскоподобные оболочки туберкулезных бактерий.
В народной медицине и гомеопатии широко используется биологически активный препарат из личинок большой восковой моли Galleria Mellonella для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, а также в качестве антитуберкулезного и гери-артрического средства [4]. Особенности физиологии и питания личинок большой восковой моли, развивающихся в пчелином улье и поглощающих значительные количества биологически активных продуктов пчелиной семьи, их способность расщеплять и усваивать пчелиный воск представляют научно-практический интерес.
1 Пурыгин Петр Петрович (purygin2002amail.ru), Срибная Олеся Сергеевна, кафедра органической химии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г.Самара, ул.Акад. Павлова, 1.
2 Кленова Наталья Анатольевна, Худякова Дарья Николаевна, кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г.Самара, ул.Акад. Павлова, 1.
3 Литвинова Елена Геннадьевна, Кондрашова Мария Николаевна, Овсепян Армен Александрович, лаборатория метаболической биохимии, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Россия, г.Пущино, ул.Институтская, 3.
Проведенные исследования состава и механизма действия экстрактов личинок служат предпосылкой для создания новых лекарственных препаратов, включающих активные компоненты личинок [5-8].
В связи с потенциальной ценностью препарата Galleria Mellonella для медицины заслуживает внимания вопрос о наличии в составе экстракта личинок большой восковой моли, помимо антитуберкулезных факторов, иных биологически активных компонентов. В нашем предыдущем исследовании было показано, что спирто-вый экстракт личинок обладает антибактериальной активностью. Антибактериальная активность была ассоциирована с пептидной фракцией экстракта [9]. Учитывая, что не все биологически активные компоненты личинок переходят в экстракт, в настоящей работе было проведено выделение антибактериальных пептидов из гемолимфы личинок Galleria mellonella.
1. Материалы и методы исследования
1.1. Иммунизация личинок Galleria Mellonella и получение гемолимфы
Личинки большой восковой моли выращивались в питомнике ИТЭБ РАН на специально разработанном корме. Для эксперимента были отобраны целые, подвижные особи, находившиеся в стадии развития, предшествующей окукливанию. Средний вес личинок составил 100±20 мг. Количество личинок в первой серии экспериментов—28, второй — 96. Иммунизацию проводили по методу [10]. Каждой личинке была произведена инъекция 5 мкл 1000 кратно разведенной суспензии бактерий Pseudomonas aeruginosa. Далее личинки 48 часов выдерживали в термостате при температуре 28°С. Через 48 часов после иммунизации гемолимфу личинок первой серии экспериментов фракционировали для выявления бактерицидных компонентов.Гемолимфу второй серии использовали для определения антибактериальной активности без предварительного фракционирования.
Гемолимфу личинок получали, как описано в работе [10], прокалывая иглой верхнюю часть брюшка и надавливая на брюшную полость. В собранную гемолимфу помещали кристаллик тиомочевины, используемый в качестве ингибитора протеолиза и меланизации.
Чтобы подготовить гемолимфу личинок первой серии к фракционированию, к ней добавили 0,7 мл 0,15 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,1. В 2 мл полученного раствора гемолимфы добавили 10 мкл твина. Образец нанесли на колонку.
К гемолимфе личинок второй серии добавили 6 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2. Полученный раствор хранили при температуре -180 °C.
1.2. Получение экстракта личинок Galleria Mellonella, лишенных гемолимфы
В личинки, лишенные гемолимфы, добавляли 25 мл 70% этанола. Экстракцию проводили в темном месте при комнатной температуре в течение 12 дней. К полученному экстракту добавляли 10 мл хлороформа. В образовавшейся двухфазной системе отделяли нижний (хлороформный) слой от верхнего. Верхний слой составил 5 мл. К данному слою добавляли в малых количествах предварительно мелкоизмельченный аммоний сернокислый до полного насыщения раствора. По-
лученный раствор центрифугировали 10 минут при 4200 об/мин для отделения осажденного белка.
К белковому осадку добавляли 2 мл 0,15 М цитрат-фосфатного буфера рН 5,1. Белки растворились частично. Образец нанесли на колонку.
1.3. Фракционирование белков гемолимфы и экстракта личинок
Для ионообменной хроматографии использовали колонку (15x0,7 см), заполненную сефадексом СМ-50. Колонку уравновешивали цитрат-фосфатным буфером с рН 7,2 , затем с рН 5,1 (0,15 М). Градиент создавали изменением молярности цитрат-фосфатного буфера с рН 5,1 от 0,15 М до 1 М.
Измерение оптической плотности проводили на двулучевом спектрофотометре UVIKOM 923 Double Beam UV/BIS и на спектрофотометре ЛОМО СФ-46.
Концентрацию белка в полученных экстрактах и фракциях определяли по методу Варбурга и Кристиана [11]. Концентрацию белка вычисляли по формуле:
С(мг/мл)=1,55А280 - 0, 76260.
1.4. Определение антибактериальной активности
В качестве тестового микроорганизма использовался суточный инокулят E.coli, выращенный на среде следующего состава: г/л пептон — 5 г; глюкоза —10 г; NaCl —4,68 г; KCl —1,49 г; NH4CI —1,07 г; CaCb —0,44 г; трис —6, pH= 7,0; K2HPO4 — 1,55 г; MgSO4 — 5 г.
Бумажные диски с диаметром 0,6 см предварительно стерилизовали с помощью бактерицидных ламп. Стерильные диски пропитывались фракциями и помещались во влажном состоянии на свежие посевы E.coli. Количество повторов для каждой пробы равно 8. Посев проводился в микробиологическом боксе на чашки Петри методом распределения по поверхности шпателем Дригальского, после чего чашки Петри помещались в термостат при 37 °C на двое суток. Антибактериальная активность определялась по размерам зон ограниченного роста E.coli (наличие единичных точечных колоний или отсутствие колоний) вокруг дисков, пропитанных фракциями гемолимфы. Контролем служили диски, пропитанные растворителем (0,15 М цитрат-фосфатный буфер рН 5,1—для фракций гемолимфы иммунизированных личинок первой серии; 0,1 М фосфатный буфер рН 7,2 — для раствора гемолимфы иммунизированных личинок второй серии). Пробы на антибактериальную активность растворов разделенных электрофрезом белков, экстрагированных из геля, проводились по вышеописанной методике, в качестве контроля использовали раствор, полученный из фрагмента геля, не содержащего белка. Достоверность результатов оценивалась с помощью критерия Стьюдента [12].
1.5. Электрофорез
По результатам микробиологического тестирования пяти фракций гемолимфы личинок первой серии для электрофореза были выбраны 2 фракции (№ 3 и № 6), обладающие наибольшей антибактериальной активностью.
Кроме того, был проведен электрофрез гемолимфы иммунизированных личинок из второй серии экспериментов. Для этого 0,5 мл раствора гемолимфы иммунизированных личинок второй серии отцентрифугировали, отделили надосадоч-
ную жидкость, к осадку прилили 0,5 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7,2 и для полного его растворения подкислили фосфорной кислотой.
0,5 мл каждого исследуемого раствора белка смешивали с 0,5 мл 40% раствора сахарозы и наслаивали на слой геля в каждой электрофоретической ячейке.
Для фракций гемолимфы личинок первой серии было сделано 2 повтора (2 электрофореграммы), а для раствора гемолимфы личинок второй партии и осадка из данного раствора 3 повтора (3 электрофореграммы).
Электрофорез проводили в 7,5% полиакриламидном геле (ПААГ) в щелочной боратной буферной системе (рН 9,2). Для электрофореза использовали универсальный источник питания УИП-1, реактивы и камеру фирмы ”Кеапа1”. В качестве маркерного красителя в верхний буфер добавлен бромтимоловый синий. Первые 30 минут электрофорез проводили при силе тока 100 мА, затем повысили до 200 мА. Электрофореграммы окрашивали 0,5% амидочерным В в течение 7 мин. Электрофореграммы отмывали от избытка красителя 7% уксусной кислотой в течение 28 дней.
Денситометрическое определение проводили на анализаторе фракций. Электро-фореграммы помещали в анализатор таким образом, чтобы сканирование происходило от старта к финишу. Интервал сканирования равен 6 см.
1.6. Элюция белков с электрофореграммы
Из электрофореграммы вырезали фрагменты геля, содержащие анализируемый белок, размером 3 X 4 мм и растирали в гомогенизаторе. Белки из измельченного геля экстрагировали дистиллированной водой (1,5 мл) в течение суток при 40 °С. Во время элюции суспензию измельченного геля встряхивали. После окончания экстракции гель удаляли центрифугированием.
1.7. Масс-спектрометрический анализ
Масс-спектрометрический анализ экстрагированных из геля белков проводили на масс-спектрометре Вгикег иНгаАех БаНюшсв методом матричной лазерной де-сорбционной ионизации (МЛДИ).
В качестве матрицы использовали раствор циано-4-гидроксикоричной кислоты в изопропаноле концентрацией 10 мг/мл.
Раствор матрицы (0,5-2 мкл) наносили на специальную плашку, затем после испарения растворителя матрицы сверху наслаивали анализируемый раствор белка. Контролем служил раствор, полученный из фрагмента геля, не содержащего белка. Интервал детектируемых масс составлял 4000-100000 Да. Масс-спектромет-рия проводилась в режиме положительных ионов.
2. Результаты исследования
При росте бактерий Б.евИ на питательной среде вокруг фильтров, пропитанных гемолимфой, наблюдали зону отсутствия роста (отсутствие колоний) и зону ограниченного роста (наличие единичных точечных колоний). Исследование антибактериальной активности показало, что гемолимфа иммунизированных личинок обладает выраженной антибактериальной активностью, что обнаруживается по достоверному увеличению ширины зон задержки роста Б.евИ по сравнению с контрольными фильтрами, пропитанными буферным раствором (табл. 1).
Таблица 1
Значения зон задержки роста Е.соИ на плотной среде вокруг дисков, пропитанных раствором гемолимфы
Проба Зона ограничения роста, мм Зона отсутствия роста, мм Достоверность различий (к контролю)
Гемолимфа иммунизированных личинок 10,10±0,53 6,9±0,06 P < 0,01
Контроль (0,1 М фосфатный буфер рН 7,2) 5,0 ± 0,80
С целью выделения и очистки антибактериальных компонентов была проведена ионообменная хроматография гемолимфы иммунизированных личинок Galleria Mellonella, а также экстракта личинок, лишенных гемолимфы.
В случае фракционирования гемолимфы было собрано 17 фракций по 2,5 мл (рис. 1, 2), а фракционирования экстракта личинок —12 фракций по 2,5 мл (рис. 3, 4).
Рис. 1. Ионообменная хроматография гемолимфы личинок Galleria Mellonella на колонке (15x0,7 см) с сефадексом СМ-50
В процессе ионообменной хроматографии произошло разделение гемолимфы на две белковые фракции: высокомолекулярную (молекулярная масса выше 200000 Да) и среднемолекулярную (молекулярная масса ниже 200000 Да).
Данные хроматографического анализа экстракта личинок Galleria Mellonella лишенных гемолимфы, представлены на рис. 3 и 4.
Как видно из хроматограмм, в процессе ионообменной хроматографии не произошло удовлетворительное разделение белков.
Рис. 2. Содержание белка во фракциях гемолимфы личинок Galleria Mellonella
Объем элюента, мл
Рис. 3. Ионообменная хроматография белков, полученных из экстракта личинок Galleria Mellonella, лишенных гемолимфы, на колонке с сефадексом СМ-50 (15x0,7 см)
2.1. Микробиологическое тестирование на наличие антибактериальной активности у фракций гемолимфы
Для проведения микробиологического тестирования было отобрано пять фракций гемолимфы, обладающих концентрацией белка, превышающей 0,7 мг/мл.
Получены достоверные расширения зон задержки роста E.coli в белковых фракциях гемолимфы. (табл. 2) На основании этого сделано предположение о наличии в данных фракциях компонентов, обладающих бактериостатическим действием.
По результатам микробиологического тестирования установлено, что фракция № 3, обладающая наименьшей концентрацией белка из выбранных фракций, имеет высокую антибактериальную активность. Данная фракция при микробиологическом тестировании давала три четко различающиеся концентрические зоны: зону полного отсутствия роста (1), зону мелких колоний (уменьшение скоростироста), зону единичных, но более крупных колоний (3). Вероятно, наличие нескольких
Номер фракции
Рис. 4. Содержание белка во фракциях, полученных из экстракта личинок Galleria Mellonella, лишенных гемолимфы
зон связано с многокомпонентностью данной фракции, обнаруженной в дальнейших экспериментах.
Выявлено, что 2 фракции гемолимфы (№7 и №8), имеющие самые высокие концентрации белка, не обладают антибактериальной активностью.
Таблица 2
Значения зон задержки роста Е.соИ на плотной среде вокруг дисков, пропитанных фракциями гемолимфы
№ фракции Зона ограничения роста, мм Достоверность различий (к контролю)
3 Первая зона: 7,10 ± 0,01 Зона мелких колоний в виде кольца: 8,20 ± 0,30 Вторая зона: 13, 5 ± 0,77 P < 0,01
6 7,58 ± 0,38 P < 0,01
7 6,00 ± 0,00
8 6,00 ± 0,00
9 7,00 ± 0,33 P < 0,05
Контроль (0,15 М цитрат-фосфатный буфер рН 5,1) 6,00 ± 0,00
2.2. Гель-электрофорез
С целью анализа биологически активных белков и очистки антибактериальных компонентов проведен гель-электрофорез гемолимфы иммунизированных личинок, а также растворенного в 0,5 мл 0,1 м фосфатного буфера рН 7,2 осадка гемолимфы иммунизированных личинок и двух фракций гемолимфы иммунизированных личинок (№ 3 и № 6), обладающих по результатам микробиологического тестирования наибольшей антибактериальной активностью (рис. 5).
Рис. 5. Электрофореграммы двух фракций гемолимфы иммунизированных личинок: № 3 (А) и № 6 и электрофореграммы раствора гемолимфы иммунизированных личинок (В) и осадка гемолимфы (Г) иммунизированных личинок. На всех электрофореграммах белки расположены в порядке уменьшения их молекулярных масс
На электрофореграммах фракции № 3 отчетливо видны 2 белковые полосы. На электрофореграммах фракции № 6 видна 1 белковая полоса. Установлено, что фракция № 6, обладающая средней антибактериальной активностью, содержит один белковый компонент, а фракция № 3, обладающая наименьшей концентрацией белка и имеющая высокую антибактериальную активность содержит, два белковых компонента (рис. 5).
ны области 5 белковых полос: первые три белковые полосы выражены слабо, две следующие — ярко.
На электрофореграммах осадка гемолимфы иммунизированных личинок белки расположены неравномерно, это значит, что в процессе электрофореза данные белки частично или полностью гидролизовались.
В качестве белка-маркера был использован трипсин (23500 Да). Можно предположить, что массы большинства обнаруженных белков либо сравнимы с молекулярной массой трипсина в пределах погрешности эксперимента, либо ниже этой массы.
Относительную электрофоретическую подвижность (Иш) обнаруженных белковых полос (табл. 3) рассчитывали по формуле:
Расстояние, пройденное зоной белка Яш =------—----------------------------.
Длина электрофореграммы
Таблица 3
Среднее значение электрофоретической подвижности исследуемых
белков
Проба Количество полос Среднее значение Иш
Фракция № 3 2 0,78915 0,85540
Фракция № 6 1 0,80952
Осадок гемолимфы иммунизированных личинок 2 0,4408 0,4838
Гемолимфа иммунизированных личинок без осадка 5 0,1304 0,2391 0,3043 0,5333-0,5869 0,9347-0,9565
Трипсин 1 0,5189
2.2.1. Масс-спектрометрия
После избирательной элюции разделенных электофорезом белков из геля полученные растворы белков анализировали методом матричной лазерной десорб-ционной ионизации МЛДИ (рис: 6, а-е) Контролем служил раствор, полученный также из фрагмента геля, не содержащего белка (рис. 7).
Масс-спектрометрический анализ показал наличие в каждом из полученных растворов белкового компонента с молекулярной массой 5627 (5633) Да. Это значит, что в данных условиях в процессе электрофореза не произошло корректного фракционирования белков, имеющих указанный диапазон масс.
Присутствие указанного белкового компонента в осадке гемолимфы, вероятно, вызвано механическим захватом или иным взаимодействием, произошедшим в процессе осаждения или отделения осадка от гемолимфы, и, возможно, обусловливает антибактериальную активность осадка гемолимфы иммунизированных личинок (табл. 4).
Многочисленные осколочные ионы невысокой интенсивности на масс-спектрах осадка гемолимфы неинформативны и, возможно, обусловлены фрагментацией белков осадка с молекулярной массой выше 90000 Да (рис. 6 а, б).
Масс-спектр нижнего белка с электрофореграммы гемолимфы иммунизированных личинок позволил оценить его молекулярную массу, которая составила 5627 Да. Данный белок проявляет антибактериальные свойства, поскольку достоверно увеличивает размеры зоны задержки роста Б.еоИ (табл. 4).
Рис. 6 а. Масс-спектр белка Г1 осадка гемолимфы иммунизированных личинок
Немногочисленные осколочные ионы невысокой интенсивности на масс-спектре центрального белка, возможно, обусловлены наличием высокомолекулярного белка, пик молекулярного иона которого находится за пределами области детектирования. Антибактериальная активность данной фракции, вероятно, обусловлена либо присутствием белкового компонента с молекулярной массой 5627 (5633) Да, либо наличием указанного высокомолекулярного белка.
Шеш.
ХІ08 6 ^
5627
4 -
7975
5000 6000 7000 8000 9000 т!г
Рис. 6 в. Масс-спектр белка В2 из гемолимфы иммунизированных личинок
ьиепв. 4 хЮ9
1,0 0,8
0,6
0,4
0,2
5656
Т--1--1--1-----------------1-1-1-1-1----1-1-1-1-1------1-1-1-1-1-----1-1-1-1-1------1-1-1-1-1-------1-1-1-1-Г"
5000 5500 6000 6500 7000 7500
т/г
Масс-спектр белка фракции № 6 позволил оценить его молекулярную массу, которая составила 5628 Да. Данный белок также проявляет антибактериальные свойства, так как достоверно увеличивает размеры зоны задержки роста Б.еоИ (табл. 4).
Масс-спектрометрический анализ фракции № 6 и белков гемолимфы иммунизированных личинок выявил единую природу антибактериальных белковых компонентов из гемолимфы иммунизированных личинок, полученных разными способами.
Intens. f
xio'
1,5
1,0
0,5
5652
0,0
5000 6000 7000 8000
Рис. 6 д. Масс-спектр белка из фракции № 6 (Б)
L-plp ,.|ЦЧу1„к .Jy _
9000 m/z
Рис. 6 ж. Масс-спектр двух белковых компонентов фракции № 3 (А] и А2)
Многочисленные пики на данном масс-спектре (рис. 6, ж) мало информативны. Высокая антибактериальная активность данной фракции, возможно, обусловлена неисследованными белковыми компонентами с молекулярной массой, превышающей предел детектирования 100000 Да. Это согласуется с данными проведенной нами ионообменной гель-хроматографии.
Масс-спектрометрический анализ раствора, полученного из фрагмента геля, не содержащего белка, позволил оценить фоновый уровень шумов, возникающих при снятии масс-спектров белков, элюированных с фрагментов гомогенизированного геля.
Проведение микробиологического тестирования растворов белка, экстрагированных из геля, показало достоверное увеличение зон ограничения или полного отсутствия роста Б.еоИ (табл. 4).
Рис. 7. Масс-спектр раствора, полученного из фрагмента геля, не содержащего белка (контроль)
В конце 1970 гг. был проведен ряд биохимических исследований на иммунизированных насекомых, которые закончились выделением новых классов антибактериальных пептидов, названных цекропины [13] и др. В настоящее время гемолимфа насекомого считается одним из самых богатых источников новых антибактериальные агентов; число новых индуцированных антибактериальных пептидов из насекомых превышает 150 [15].
В 1980 году в гемолимфе иммунизированных личинок Galleria mellonella обнаружены 4 неспецифических бактериолизина, представляющих собой основные белки, обладающие лизоцим- и цекропинподобной активностью [15-19]. В 2001 году были выделены, биохимически охарактеризованы и названы два индуцированных антимикробных пептида из гемолимфы иммунизированных личинок Galleria Mellonella. Показано, что один пептид принадлежит к классу цекропинов, а второй богат остатками пролина и, возможно, является членом нового класса антибактериальных пептидов [20].
Таблица 4
Значения зон задержки роста E.coli на плотной среде вокруг дисков, пропитанных растворами разделенных электрофорезом белков из гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella
Проба Зона ограничения роста, мм Зона отсутствия роста, мм Достоверность различий (к контролю)*
Белок 1 из осадка гемолимфы (верхний белок) 8,71 ± 0,22* 6,00 ± 0,00 P < 0,01*
Белок 2 из осадка гемолимфы (нижний белок) 7,89 ± 0,15 7,75 ± 0,20* P < 0,01*
Белок 1 из раствора гемолимфы (нижний белок) 8,14 ± 0,18* 6,00 ± 0,00 P < 0,01*
Белок 2 из раствора гемолимфы (центральный белок) 8,07 ± 0,18* 6,00 ± 0,00 P < 0,01*
Фракция № 6 8,13 ± 0,15 6,50 ± 0,10 P < 0,01
Контроль 6,02 ± 0,80 6,00 ± 0,00
Настоящая работа описывает обнаружение и выделение неизвестных белковых компонентов из гемолимфы иммунизированных личинок Galleria mellonella, обладающих (специфической) антибактериальной активностью, выявляемой по увеличению размеров зон ограничения роста бактерии Е. coli.
В работе были обнаружены и выделены белковые компоненты, обладающие значительной антибактериальной активностью, и которые в дальнейшем могут быть использованы для лечения бактериальных инфекций.
Полученные данные позволяют обосновать целесообразность применения препаратов, полученных из личинок Galleria Mellonella в медицине, гомеопатии и терапевтической практике.
Масс-спектрометрический анализ показал присутствие в гемолимфе личинок Galleria mellonella антибактериального пептида с молекулярной массой 5627 Да, который в дальнейшем предполагается очистить и охарактеризовать.
Литература
[1] Prevention of restenosis using the gene for cecropin complexed with DOCSPER liposomes under optimized conditions / S.Nikol [et. al.] // Int. J. Angiol. -2000. - V. 9. - №2. - Р. 87-94.
[2] Characterisation of antibacterial activity of peptides isolated from the fenomen of the spider Cupiennius salei (Araneae: Ctenidae) / S.Haeberli [et. al.] // Toxicon. - 2000. - V. 38. - № 3. - Р. 373-380.
[3] Sawa, T. Antimicrobal peptides/proteins - application to the therapy of sepsis / T.Sawa, K. Kurahashi // Masui. - 1999. - V. 48. - №11. - Р. 1186-1193.
[4] Спиридонов, Н.А. Сердечнососудистый препарат из восковой моли / Н.А. Спиридонов, А.К. Рачков , М.Н. Кондрашова // Пчеловодство. - 1993. -№4. - С. 5-8.
[5] Spiridonov, N.A. On chemical composition of a biologically active preparation from Galleria mellonella / N.A. Spiridonov, E.V. Kashparova, B.P. Baskunov // Comp. Biochem. Physiol. - 1992. - Р. 109.
[6] Rachkov, A.K. Adaptogenic and cardioprotective action Galleria mellonella extract in rats and frogs / A.K. Rachkov, N.A. Spiridonov, M.N. Kondrashova // J. Pharm. Pharmacol. - 1994. - №46. - Р. 221.
[7] Antioxidannt and immunoprotective properties of the ancient remedy of folk medicine from Galleria Mellonella / E.G. Litvinova [et. al.] // Intern. Symposium ’’Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Diagnostic, Preventive and Therapeutic Values” St.Petersburg-Kizhi. - SPb., 2002. - Р. 126.
[8] Натуральный экстракт доктора Мухина — биологически активная добавка из личинок восковой мoли с лечебным и профилактическим действием при бронхо-легочных заболеваниях: иммуномодулирующая и антибактериальная активность, лечебное действие / Е.Г. Литвинова [и др.] // Х Международный Съезд ФИТОФАРМ 2006 "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения”. - СПб., 2006. - С. 219-223.
[9] Обнаружение и выделение антибактериальных пептидов из экстрактов личинок Galleria mellonella / П.П.Пурыгин [и др.] // Вестник Самарского госу-ниверситета. Естественнонаучная серия. - 2006. - №6/1(46). - С. 201-211.
[10] Stephens, J.M. Bactericidal activity of the blood actively immunized wax moth larvae / J.M. Stephens // Can. J. Microbiol. - 1962. - №8. - Р. 597-602.
[11] Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот; под ред. К. Джонса. - М.: Мир, 1991. - С. 544.
[12] Фролов, Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и программирование: теоретические основы и практикум / Ю.П. Фролов. - Самара: Изд-во СамГУ, 1997. - С. 265.
[13] Hoffmann, D. Insect immunity: Galleria mellonella and other lepidoptera have cecropiaP9-like Factors active against Gram negative bacteria / D. Hoffmann, D. Hultmark, H.G. Boman // Insect Biochem. - 1981. - V. 11. - Р. 537-548.
[14] Isolation from the lepidopteran heliohtis vireskins of a novel insekt defensin with potent antifungal activity / M.Lamberty [et. al.] // J. of biological chemistry. -1998. - V. 274. - №14. - Р. 9320-9326.
[15] Powning, R.F. Studies on insect bacteriolytic enzymes — 1. Lysozyme in haemolymph of Galleria mellonella and Bombex mory / R.F. Powning, W.J. Davidson // Comp. Biochem. Phisiol. - 1972. - V. 45B. - Р. 669-686.
[16] Jarosz, J. Active resistance of entomophagous rhabditid Heterorarhabditix bacteriophora to insect immunity / J. Jarosz // Parasitology. - 1998. - V. 117. -№ 3. - Р. 201-208.
[17] Jarosz, J. Simultaneous induction of protective immunity and selective Synthesis of hemolymph lysozyme protein in larvae of Galleria mellonella / J. Jarosz // Biol. Zbl. - 1979. - V. 98. - Р. 459-471.
[18] Phipps, D.J. Gallysin-1, an antibacterial protein isolated from hemolymph of Galleria mellonella / D.J. Phipps // Dev. Comp. Immunol. - 1994. - V. 18. -№ 1. - Р. 13-23.
[19] Virulence of Candida albicans mytants toward larval Galleria mellonella (Insecta, Lepidoptera, Galleridae) / M. Whiteway [et. al.] // Can. J. Microbiol. - 2003. -V. 49. - №8. - Р. 514-524.
[20] Mak, Р. Antibacterial peptides of the moth Galleria mellonella / Р. Mak,
D. Chmiel, G.J. Gacek // J. Acta Biochimica Polonica. - 2001. - №4. -Р. 1191-1195.
Поступила в редакцию 13/XII/2006; в окончательном варианте — 13/XII/2006.
EXCRETING ANTIBACTERIAL COMPONENTS FROM HEMOLYMPH OF LARVAE OF GALLERIA MELLONELLA
© 2007 P.P. Purygin, O.S. Sribnajaf N.A. Klenova, D.N. Khudyakovaf
E.G. Litvinova, M.N. Kondrashova, А.А. Ovsepjan6
This work deals with the antibacterial activity of hemolymph of immunized larvae of Galleria Mellonella. There are protein fractions with antibacterial activity excreted with the help of ion-exchange chromatography and gel-electrophoresis from hemolymph. The mass-spectrometric analysis of fractions showed the presence of peptide with the mass of 5627 Da. Probably, this peptide determines the antibacterial activity of hemolymph.
Paper received 13/X///2006. Paper accepted 13/X///2006.
4Purygin Pyotr Petrovich (purygin2002amail.ru), Sribnaja Olesya Sergeevna, Dept. of Organic Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.
5 Klenova Natalia Anatolevna, Khudyakova Darya Nikolaevna, Dept. of Biochemistry, Samara State university, Samara, 443011, Russia.
6 Litvinova Elena Gennadevna, Kondrashova Maria Nikolaevna, Ovsepjan Armen Aleksandrovich, Laboratory of Metabolic Biochemistry, Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Science, Puschino, 142290, Ruassia.
