CC BY
5
тально-расчетный метод прогноза ОБУВ атмосферных загрязнений, обладающих запахом, исключающий длительные и сложные ольфактомет-рические исследования вещества в воздухе. Предложенный метод получил надежное экспериментальное подтверждение при традиционном обосновании максимальной разовой ПДК 18 веществ, обладающих запахом (различие не превышало 2—5 раз).
Литература
1. ГН 2.1.5.1315—03. Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования. — М., 2003.
2. ГН 2.1.6.1338—03. Предельно допустимые концентрации (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест. — М., 2003.
3. МУ 2.1.5.720—98. Обоснование гигиенических нормативов химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования: Метод, указания // Санитарные правила, нормы и методы безопасного водопользования населения (сборник документов): Сост.: Рах-
манин Ю. А., Жолдакова 3. И., Красовский Г. Н. — М., 2004. - С. 649-693.
4. ОНД—86. Методика расчета концентраций в атмосферном воздухе вредных веществ, содержащихся в выбросах предприятий. — JI., 1987.
5. Пюлылан Б., Пюльман JI. Квантовая биохимия: Пер. с англ. — М., 1965.
6. Райт P. X. Наука о запахах: Пер. с англ. — М., 1966.
7. Amoore J. Е. // Nature. - 1967. - Vol. 198, N 4877.
- P. 271-272.
8. Amoore J. E. // Nature. - 1967. - Vol. 199, N 4896.
- P. 973-977.
9. Wright R. #., Raid C„ Evans G. V. // Chem. and Indus-tr. - 1956. - N 37. - P. 973-977.
Поступила 15.04.08
Summary. The paper presents rapid experimental and calculating methods for predicting the parameters of the olfactory activity of ambient air pollutants. The experimentally established and designed thresholds of the odor of benzene derivatives were compared, which indicated the reliability of the methods. These procedures were used in the studies by this and other investigators to establish the OBUV of more than 30 substances and to design experiments determining the ambient air thresholds of the odor of the substances.
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2008 УДК 613.31-092.9-076.5
В. В. Юрченко, Е. К. Кривцова, Н. Н. Беляева, Ф. И. Мигель, А. А. Олесинов, О. Н. Савостикова, А. Ю. Сковронский
ПРИМЕНЕНИЕ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА ДЛЯ ОЦЕНКИ ПИТЬЕВЫХ ВОД
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва
В последние годы внедряются новые методы очистки и кондиционирования воды, основанные на физических (безреагентных) способах водообра-ботки. При использовании этих технологий вода может изменить свою структуру, вследствие чего меняется и ее биологическая активность [1, 4, 5, 7], что делает необходимой оценку безопасности, в том числе потенциальной генотоксичности. Классические методы выявления мутагенности на клетках костного мозга животных в остром опыте не представляются адекватными для питьевых вод. Поэтому мы выбрали режим длительного воздействия, в качестве объекта — сравнительно медленно обновляющуюся ткань, в качестве инструмента — микроядерный тест, который позволяет учесть разные аномалии ядра.
Цель исследования — изучение влияния питьевых вод с измененной структурой и зарядовым числом на цито- и гистоморфометрические показатели печени и почек, на кариологические показатели эпителия слизистой оболочки преджелудка животных, уточнение гигиенического значения сдвигов малоизученных дополнительных показателей микроядерного теста путем оценки их сопряженности с цито- и гистоморфометрическими показателями, имеющими установленные критерии вредного действия [2].
Материалы и методы
Использовали воды, приготовленные с помощью энергоинформационных воздействий на арте-
зианскую (4 технологии и исходная вода) и водопроводную (3 технологии и исходная) воды. Перед началом опыта для оценки фонового состояния, а затем в динамике через 6 и 12 мес (по 5—6 крыс на каждый образец) животных забивали под эфирным наркозом.
Печень и почки фиксировали в фиксаторе Лили, по стандартной методике получали срезы, окрашенные гематоксилином и эозином. Препараты печени анализировали по 12 показателям, почки — по 7 [2].
Преджелудок фиксировали в формалине, выдерживали в 50% КОН 13 ч при 20°С, переносили в дистиллированную воду, где отделяли эпителиальный пласт, который переносили в центрифужные пробирки с дистиллированной водой. После 3-кратного промывания и легкого пипетирования клеток из густой суспензии готовили мазки, выдерживали их 15 мин в спиртово-уксусной смеси 3:1 и окрашивали ацетоорсеином и зеленым светлым. Перед просмотром стекла шифровали.
Препараты анализировали при увеличении 10 х 100. Использовали критерии идентификации аномалий и протокол анализа, разработанный ранее для эпителия слизистой щеки человека [8, 9]. Для учета аномалий 1—7 (рис. 1 на вклейке) от каждого животного анализировали по 1000 отдельно лежащих эпителиальных клеток полигональной формы с сохранной цитоплазмой и непрерывным краем ядра. Отдельно отмечали клетки с множественными (> 1) протрузиями. Параллельно (сверх
[гиена и санитария 6/2008
в
в
О 2 4 6 8 10
Рис. 2. Связь степени структурированности воды с цито-, гистоморфометрическими и кариологическими показателями состояния крыс.
По оси абсцисс — степень структурированности воды, ранг; по оси ординат: а — ИАГ, % (12 мес); б — выраженность жировой дистрофии печени, баллы (12 мес); в — доля стромы, % на единицу плошади среза (12 мес); г — суммарная частота эпителиоцитов преджелудка с протру-зиями ядра, X. (6 мес). Здесь и на рис. 4: ИАГ — индекс альтерации ге-патоцитов.
этих 1000 клеток) анализировали отдельно лежащие полигональные клетки, в которых учитывали аномалии 8—11 (см. рис. 1).
Различия между группами животных по цито-гистометрическим показателям оценивали по критерию, по показателям микроядерного теста — по критерию х2. сопряженность — по критерию Спирмана.
Результаты и обсуждение
Для анализа эффектов воды все 9 изученных образцов расположили в ряд в порядке возрастания
степени их структурированности и использовали порядковый номер (ранг) при обработке данных. Статистический анализ всего массива данных показал, что фуппы животных разнонаправленно различались по большому количеству показателей, хотя выраженных закономерностей не обнаружено. Поэтому использовали ряд диагностических критериев, основанных на значениях ряда показателей состояния печени, разработанных Н. Н. Беляевой [2] для оценки статуса организма в общепринятых токсикологических терминах.
Этот анализ показал, что в течение опыта во всех 18 группах (по 9 групп на 2 срока) не наблюдалось ухудшения морфофункционального состояния животных. Следовательно, изученные воды не обладали выраженным токсическим действием.
Ранг питьевой воды коррелировал с 4 из 27 изученных показателей состояния животных (рис. 2). Ранг 2 соответствует исходной артезианской воде, ранг 5 — исходной водопроводной, ранги 4, 6 и 7 — модифицированной водопроводной, ранги 1, 3, 8 и 9 — модифицированной артезианской воде. На рис. 2 видно, что повышение ранга связано с увеличением альтерации гепатоцитов и жировой дистрофии печени при одновременном снижении степени разрастания стромы в печени. С рангом воды положительно коррелировала суммарная частота клеток преджелудка с протрузией ядра (сумма клеток с аномалиями 2—5 на рис. 1), а группа с максимальной частотой клеток с протрузий (ранг 8) значимо отличалась от исходной воды (ранг 2; р < 0,001). В этой группе спектр протрузий изменился по сравнению с исходной водой в сторону форм с более выраженным отделением от ядра. Частота протрузий типа везикула, яйцо и ниппель удвоилась, а вклад в спектр формы мыс снизился с 77 до 50%. Важно, что в группе крыс, потреблявших воду ранга 8, частота эпителиоцитов с микроядрами (МЯ) была максимальной (1 ± 0,8%о против 0,4 ± 0,4%о в контроле). При этом превышение над контролем не было статистически значимым, но отличалось от среднего значения по всем 43 крысам (0,4 ± 0,1%о; р < 0,05). Любопытно, что в этот же срок обследования суммарная частота клеток с протрузией в преджелудке отрицательно коррели-
Рис. 3. Связь между протрузиями ядра в эпителии преджелудка и гипертрофией клубочков в почках у крыс (6 мес).
По оси абсцисс — суммарная частота эпителиоцитов преджелудка с протрузиями ядра, %.; по оси ординат — доля гипертрофированных клубочков в почке, %.
SOBO-70-60-50-40-30-20-10-
0-1-1-1-1-1-1-1-
<5 6-10 11-16 16-20 21-25 26 и более
Рис. 4. Связь между вакуолизацией эпителиоцитов в преджелудке и состоянием РЭС и паренхимы в печени крыс (6 мес).
По оси абсцисс — частота эпителиоцитов с перинуклсарной вакуолью в слизистой преджелудка, по оси ординат — клетки РЭС на 10 полей зрения и ИАГ, %. 1 - РЭС, 2 - ИАГ.
ровала с частотой гипертрофированных клубочков в почках крыс (рис. 3).
В настоящее время повышение частоты клеток с протрузией ядра рассматривают исключительно как индикатор генотоксического действия [16], приводящего к избыточному содержанию в ядре целых хромосом, их фрагментов [12] или многочисленных копий (амплификации) одного или нескольких структурных генов [15]. Однако с начала 20-х годов прошлого века протрузии ядра описывали в клетках нормальных тканей растений, насекомых и млекопитающих как признак повышенной функциональной активности [13, 14]. Часто они содержали ядрышкообразующий материал, их формирование не сопровождалось структурными и численными нарушениями хромосом в ана-тело-фазе [14]. После заражения эпителиальных клеток вирусом герпеса наблюдали значительное удлинение перетяжек хромосом в метафазе и образование из этого материала ядерных почек в интерфазе [13]. После панорамной рентгенографии зубов в бук-кальном эпителии отмечали снижение частоты клеток с протрузиями, на основании чего авторы признали протрузии признаком "нормальной диф-ференцировки эпителиоцитов щеки" [11]. Таким
30-1
Рис. 5. Связь между выраженностью гемодинамических сдвигов в печени и вакуолизацией эпителиоцитов в преджелудке (6 мес).
По оси абсцисс — выраженность гемодинамических сдвигов в печени, баллы; по оси ординат — клетки с перинуклсарной вакуолью в слизистой преджелудка, %о. Здесь и на рис. 7, 8: ••р < 0,01; •••р < 0,001.
80-1
<5 6П 0 11-15 16-20 21-25 26 и более
Рис. 6. Связь между частотами кариопикноза в преджелудке, РЭС в печени и гипертрофией клубочков в почке (6 мес).
По оси абсцисс — число клеток с пикнозом, X»; по оси ординат — число клеток РЭС на 10 полей зрения. 1 — РЭС, 2 — гипертрофия клубочков.
образом, в нашем эксперименте не представляется возможным сделать однозначное заключение относительно происхождения протрузий.
Интересно, что в настоящем опыте частоты клеток с МЯ и протрузиями коррелировали между собой: с разбитым яйцом и с везикулой — г = 0,48; р < 0,0009; с множественными — г = 0,52; р < 0,0003. Это наблюдение согласуется с данными литературы [14, 15], что спонтанные везикулы могут целиком отделяться от ядра и формировать в цитоплазме МЯ. Нельзя отрицать и вероятность формирования МЯ в митозе из утраченных хромосом или их фрагментов [12, 16]. Следует отметить, что ни в одном из 5 обследований детей и взрослых (от 30 до 224 человек в каждом) в эпителиоцитах щеки не наблюдали корреляций между частотами клеток с МЯ и протрузиями типа разбитое яйцо.
На рис. 4, 5 видно, что животные с высокой частотой вакуолизированных клеток в эпителии преджелудка отличались и более выраженным угнетением клеток ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), усилением альтерации гепатоцитов и гемодинамических сдвигов. Вероятно, повышение частоты клеток с вакуолью в преджелудке может служить индикатором токсического действия. Это согласуется с общепринятым на сегодня мнением,
Рис. 7. Связь между частотами кариорексиса в эпителии преджелудка и высокоплоидных гепатоцитов (> 8п) у крыс (6 мес).
По оси абсцисс — доля высокоплоидных гепатоцитов, %; по оси ординат — клетки с кариорексисом на 1000.
^игиена и санитария 6/2008
81 7-
6-
5-
4-
3-
2-
1-
1
2 и более
Рис. 8. Связь между частотой двуядерных клеток в эпителии слизистой преджелудка и нарушением структуры печени у крыс (6 мес).
По оси абсцисс — выраженность дискомплексации балок, баллы; по оси ординат — частота двуядерных клеток, %».
что вакуолизация клетки является одним из признаков некроза [12, 13, 16].
Неожиданные корреляции получили для частот эпителиоцитов с пикнозом ядра и кариорексисом. На рис. 6 видно, что минимальные нарушения в печени и почке обнаруживали у животных, в пред-желудке которых частота эпителиоцитов с пикнозом ядра была максимальной. Высокоплоидных ге-патоцитов в печени было меньше у крыс, имевших много клеток с кариорексисом в эпителии слизистой преджелудка (рис. 7). Поскольку повышение частоты высокоплоидных гепатоцитов, как и угнетение РЭС печени и гипертрофия клубочков в почке, связаны с увеличением токсического действия |2], низкая частота эпителиоцитов с пикнозом и рексисом ядра может являться неблагоприятным признаком для организма.
Как известно, пикноз и рексис ядра являются стадиями гибели клеток по одному из двух путей — некроза или апоптоза [6]. На рис. 6 знак корреляции между частотами встречаемости клеток с пикнозом и клеток РЭС противоположен таковому для индикатора некроза — вакуолизированных эпителиоцитов (см. рис. 4). Поэтому логично предположить, что в данном случае пикноз и рексис ядра имеют преимущественное отношение к апоптозу, причем апоптоз как механизм элиминации поврежденных клеток на тканевом уровне может иметь благоприятное значение для организма.
На рис. 8 видно, что у крыс, в преджелудке которых находили много двуядерных клеток, была сильнее выражена дискомплексация балок в печени. В литературе повышение уровня двуядерных клеток разные исследователи связывают с усилением в ткани пролиферации любого генеза (13], с ответом на токсическое воздействие [3] или считают генотоксическим событием [16]. В то же время показано, что одним из факторов дискомплексации балок в печени является восстановительная регенерация [2]. Когда тяжи вновь поделившихся клеток, зачастую повышенной плоидности и соответственно большего размера, встраиваются в балки, происходит нарушение регулярной структуры ткани печени. Тогда крысы, отличающиеся низким уровнем пролиферации (на что указывает относительно
низкая частота двуядерных клеток в эпителии преджелудка), имеют и меньшую балочную дис-комплексацию. Следует отметить, что это лишь второе в литературе прямое указание на связь уровня двуядерных клеток в плоском эпителии с уровнем пролиферации. Ранее нами была выявлена прямая корреляция частоты двуядерных клеток в эпителии слизистой щеки людей с митотическим индексом лимфоцитов через 52 и 72 ч их культивирования [9].
Интересно, что в настоящем эксперименте не обнаружено выявленной ранее в эпителии щеки человека связи между частотами клеток с конденсацией хроматина в ядре и лизисом ядра [9, 10]. Эти аномалии ядра в слизистой щеки мы отнесли к процессу естественного созревания клеток [10]. Возможно, данный этап созревания не характерен для преджелудка ввиду отсутствия эксфолиации эпителия.
В ы вод ы . 1. При отсутствии изменений в токсикологическом статусе животных установлена связь степени структурированности питьевой воды с выраженностью жировой дистрофии, альтерации гепатоцитов, разрастанием стромы в печени, а также с частотой эпителиоцитов с протрузией ядра в слизистой преджелудка.
2. Получены данные, указывающие на некротическую природу вакуолизации эпителиоцитов преджелудка; преимущественную причастность пикноза и рексиса ядра эпителиоцитов к апоптозу, двуядерности — к уровню пролиферации ткани.
3. Микроядерный тест на преджелудке крыс может оказаться полезным при комплексной оценке безопасности питьевых вод.
Л ите ратура
1. Аскоченская М. А., Петинов Н. С. // Успехи соврем, биол. - 1972. - Т. 73, вып. 2. - С. 288-306.
2. Беляева Н. Н. Клеточная восстановительная регенерация как биомаркер вредного действия при гигиенической оценке факторов окружающей среды: Ав-тореф. дис. ... д-ра мед. наук. — М., 1997.
3. Беляева Н Н., Сычева Л. П., Журков В. С. и др. // Итоги и перспективы научных исследований по проблеме экологии человека и гигиены окружающей среды / Под ред. Ю. А. Рахманина. — М., 2005.
- С. 10-30.
4. Вода — космическое явление. Кооперативные свойства. Биологическая активность. / Под ред. Ю. А. Рахманина, В. К. Кондратова. — М., 2002.
5. Камбурова В. С. Гигиеническая оценка термических способов обработки питьевой воды по влиянию на иммунный статус организма: Дис.... канд. мед. наук.
- М., 1990.
6. Лушников Е. Ф., Абросимов А. Ю. Гибель клетки (апоптоз). — М., 2001.
7. Семихина Л. П. Низкочастотная диэлькометрия жидкостей в слабых вихревых элетических полях: Автореф. дис. ... д-ра физ.-мат. наук. — М., 2006.
8. Юрченко В. В. // Токсикол. вестн. — 2005. — № 6.
- С. 14-21.
9. Юрченко В. В., Подольная М. А., Иигель Ф. И. и др. // Полиорганный микроядерный тест в эколого-гигие-нических исследованиях / Под ред. Ю. А. Рахманина, Л. П. Сычева. - М., 2007. - С. 220-267.
10. Юрченко В. В., Подольная М. А., Кривцова Е. К. и др. // Гиг. и сан. - 2007. - № 6. - С. 83-86.
11. Cerqueira E. M., Gomes-Filho L. S., Trindade S. et al. I I Mutat. Res. - 2004. - Vol. 562, N 1-2. - P. 111-117.
12. Fenech M., Chang W. P., Kirsch- Volders M. et al. // Mutat. Res. - 2003. .- Vol. 534, N 1. - P. 65-75.
13. Koss L. G. Diagnostic Cytology and its Histopathologic Bases. - Philadelphia; Toronto, 1979. - Vol. 1—2.
14. Longwell A. C., Yerganian G. I I J. Natl. Cancer Inst. — 1965. - Vol. 34, N 1. - P. 53-63.
15. ShimizM N.. hon N.. Ufiyama H. et al. // J. Cell Biol. — 1998. - Vol. 140, N 6. - P. 1307-1320.
16. Tolbert P. E., Shy С. M., Allen J. W. // Mutat. Res. -1992. - Vol. 271. - P. 69-77.
Поступил« 07.05.08
Summary. The effect of drinking waters with their altered
structure and charge state (a total of 9 samples) on the epi-
theliocytes of the proventriculus, liver, and kidney was studied in rats after 6- and 12-month water consumption. It was found that in the absence of changes in the animals' morphofunc-tional status, the degree of water structuredness was associated with the frequency of epitheliocytes with nuclear protrusion into the proventricular mucosa following 6-month water consumption and with the manifestations of adipose degeneration, hepatocytic alterations, and stromal overgrowth into the liver after 12-month water use. The biological implication of little studied (additional) types of anomalies of the proventricular epitheliocytic nucleus: the necrotic nature of a perinuclear vacuole, the predominant implication of nuclear py-knosis and rrhexis to apoptosis and the association of binu-cleated patterns with the restorative proliferation of hepatic and renal tissues, was specified.
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 200S УДК 613.6-07:616.318-018.73-076.5
В. В. Юрченко, Е. К. Кривцова, М. А. Подольная, Ю. А. Ревазова, И. Е. Зыкова
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА НА ЭПИТЕЛИИ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЩЕКИ ЧЕЛОВЕКА
ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина РАМН, Москва
Частота микроядер (МЯ) в эпителиоцитах слизистой щеки является признанным маркером экспозиции генотоксикантами и атрибутивного риска развития рака [11]. Возможности теста значительно шире, поскольку позволяют оценивать ряд дополнительных аномалий, считающихся более чувствительными для выявления экспозиции [12], однако методическая база для использования в анализе этих дополнительных показателей разработана недостаточно [4, 5].
В настоящей работе рассматриваются методические особенности подготовки экспериментального материала, оценивается влияние возраста обследуемых людей на частоты аномалий ядра эпителио-цитов слизистой щеки.
Материалы и методы
Обследование проводили в разных городах и населенных пунктах РФ. Всего обследованы 126 мужчин, в том числе занятых уничтожением особо токсичных веществ (табл. 1, 1-я группа), а также прекративших 1 — 10 лет назад контакт с особо токсичными веществами при их производстве, хранении или испытании (стаж от I года до 40 лет, в среднем 19,4 ± 2,2 года) (см. табл. 1; 2, 3, 4-я группы). В 3-й
Состав обследованных групп
и 4-й группах все добровольцы имели установленный диагноз профессионального заболевания. Группы сравнения формировали из жителей тех же населенных пунктов.
Сбор экспериментального материала. После двукратного полоскания ротовой полости водопроводной водой производили соскоб со слизистой оболочки обеих щек двумя способами: с помощью урогенитальной щеточки (1-я и 5-я группы) и деревянного шпателя (2—4-я и 6—8-я группы).
Приготовление и микроскопический анализ препаратов. Материал соскоба равномерно распределяли по предметному стеклу шлифованным стеклом. Высушенные на воздухе мазки фиксировали в спиртово-уксусной смеси 3:1, окрашивали ацето-орсеином и зеленым светлым, после чего зашифровывали.
Препараты микроскопировали в проходящем свете при увеличении 10 х 100. Учитывали аномалии ядра, показанные на рисунке (на вклейке).
От каждого человека анализировали по 2000 отдельно лежащих клеток с непрерывным краем ядра, среди которых учитывали клетки с аномалиями 1—8 (см. рисунок), результат выражали в %о. Параллельно сверх этих 2000 клеток анализировали отдельно лежащие клетки, ядро которых не имело
Таблица 1
Группа обследованных Регион Экспозиция Число обследованных Возраст, годы
М ±т пределы колебаний
1-Я Волгоградская обл., поселок Горный 1 19 28,58 0,69 23-33
2-Я Москва 1 17 4L,19 1,46 33-55
3-я Волгоград 1 12 53,09 3,57 33-74
4-я Санкт-Петербург 1 9 53,25 2,16 49-66
5-я Волгоградская обл., пос. Горный 0 30 35,87 1,58 23-54
6-я Москва 0 23 39,48 8,23 20-52
7-я Волгоград 0 10 53,4 3,86 36-66
8-я Санкт- Петербург 0 6 50,17 2,41 41-67
