CC BY
7
содержание ТМ и частота ХА (табл. 2). В результате было установлено, что из всех ТМ, присутствующих в хемозе-мах в повышенных концентрациях, наиболее интенсивно поглощается молибден. Полученные данные свидетельствуют об исключительной биологической активности молибдена.
В своих исследованиях мы использовали разные виды дикорастущих растений, как широко распространенные, так и более редкие. В данном случае определяли частоту аномальных анафаз в корневой меристеме проростков. Частота аномальных анафаз возрастала в 2—2,5 раза по сравнению с чистой зоной (см. табл. 2).
В районе расположения ТГОК отмечено загрязнение речной воды, почв и воздуха целым рядом ТМ. Так, в речной воде содержание молибдена достигало 24 мкг/л, меди — до 49 мкг/л (эти концентрации не превышают ПДК для питьевой воды), концентрации остальных металлов не отличались от таковых в чистой зоне. В загрязненных почвах содержание молибдена 30—40 мг/кг, меди — 30—40 мг/кг; свинца — 30 мг/кг. В дренажных водах содержание молибдена 15—17 мг/л; свинца — 2—3 мкг/л и меди — 55 мкг/л. В сухих выпадениях из атмосферы: молибден — до 39 мкг/м2 в сутки, свинец — до 44 мкг/м2 в сутки [3].
Заключение
В наших исследованиях неорганические соединения меди не проявили мутагенный эффект. У вольфрама тоже практически не были обнаружены мутагенные свойства, для С. сарШапБ Ь. мутагенной была очень высокая концентрация — 10~2М, что соответствует 18,3 г/л вольфрама, таких количеств нет в окружающей среде. Низшей
мутагенной концентрацией молибдена была Ю^М, что соответствует 9,6 мг/л, свинца — Ю-4M (20,7 мг/л). В речной воде и сухих выпадениях такие концентрации отсутствуют, содержание вольфрама, свинца и молибдена в этих компонентах окружающей среды ниже мутагенной концентрации.
Концентрации же свинца и молибдена в почвах в районе хвостохранилища ТГОК значительно превышают наименьшие мутагенные. Именно эти компоненты окружающей среды вызывали повышение частоты мутаций у произрастающих на них растений. Следовательно, результаты, полученные в модельных опытах на растительных тест-системах и видах дикорастущей флоры, произрастающих в условиях реального загрязнения, хорошо совпадают. Поэтому их вполне можно рекомендовать для первого этапа мониторинга генетической безопасности окружающей среды.
Литература
1. Гогуа М. Л. Изучение генотоксического потенциала солей хрома, молибдена, вольфрама на растительных тест-систе-мах: дис. ... канд. биол. наук. — М., 2003.
2. Дубинина Л. Г. Структурные мутации в опытах с Crépis сар-illaris L. - M., 1978. - С. 188.
3. Реутова Т. В., Воробьева Т. И., Гущина Л. П. и др. // Метеоспектр. - 2005. — № 3. - С. 93—98.
4. Урбах В. Ю. Математическая статистика для биологов и медиков. — М., 1963.
5. Ohe T., Vatanabe T., Vakabayashi К. // Mutat. Res. — 2004. - № 567. - P. 109-149.
6. White P. A., Claxton L. D. // Mutat Res. - 2004. - № 567. -P. 227-345.
Поступила 14.02.11
Оценка мутагенных эффектов факторов окружающей и производственной среды в экспериментальных исследованиях
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2011 УДК 612.014.44.084
В. В. Юрченко', Е. К. Кривцова', Н. А. Юрцева', Е. А. Тульская', Р. А. Мамонов', 3. И. Жолдакова', О. О. Синицына', М. М. Мальцева2, Г. П. Панкратова2, Л. П. Сычева'
ПОКАЗАТЕЛИ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА НА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ДИОКСИДА ТИТАНА
'ФГБУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина Минздравсоцразвития России; 2ФГУН НИИ дезинфектологии Роспотребнадзора, Москва
Генетическая безопасность потребления населением пищевых и косметических продуктов, содержащих диоксид титана (ДТ), изучена недостаточно. В работе оценивали мутагенную активность ДТ в микроядерном тесте на эпителии слизистых оболочек внутренних органов животных. Два образца анатаза (средний размер 160 и 33,2 нм; покрытый симетиконом) вводили в желудок мышей в дозах 40—200—1000 мг/кг 7-кратно и наносили на выстриженную кожу крыс однократно на 4 ч в составе крема (10 и 25%, дозы соответственно 250 и 625 мг/кг). Анализ цитогенетических нарушений (микроядра, протрузии и атипичная форма ядра) не выявил мутагенные свойства ДТ на эпителии слизистых оболочек кишечника мышей и крыс, преджелудка мышей и мочевого пузыря крыс. Отмечено повышение митотической активности во всех изученных тканях после воздействия обоих образцов диоксида титана в некоторых или во всех (в эпителии слизистой оболочки мочевого пузыря крыс) дозах.
Ключевые слова: диоксид титана, микроядерный тест, эпителий слизистых оболочек, митотическая активность
V. V. Yurchenko, Е. К. Krivtsova, N. A. Yurtseva, Е. A. Tulskaya, R. A. Mamonov, Z. I. Zholdakova, О. О. Sinitsyna, М. М. Maltseva, G. P. Pankratova, L. P. Sycheva. - VALUES OF THE MICRONUCLEUS TEST WITH ANIMAL EPITHELIAL CELLS EXPOSED TO TITANIUM DIOXIDE
The genetic safety of titanium dioxide (TD)-containing foods and cosmetic products has been little investigated. The study evaluated the mutagenic activity of TD in the micronucleus test with animal visceral mucosal epithelial cells. Two simethicone-coated anatase samples (mean size 160 and 33.2 nm) were inserted into the mouse stomach in doses
[гиена и санитария 5/2011
of 40-200-1000 mg/kg seven times and applied as an ingredient of 10 and 25% cream (doses 250 and 625 mg/kg, respectively) to the hair-sheared rat skin once for 4 hours. Analysis of cytogenetic disorders (micronuclei, protrusions, and the atypical form of the nucleus) revealed no mutagenic properties of TD on the mucosal epithelium of the mouse and rat intestine, mouse prostomach, and rat uterine bladder. Enhanced mitotic activity was observed in all the study tissues after exposure of both samples to TD given in some or in all (in the rat urinary bladder mucosal epithelium) doses. Key words: titanium dioxide, micronucleus test, mucosal epithelium, mitotic activity
Порошки диоксида титана (ДТ) используют в течение более полувека в разных отраслях промышленности, в том числе пищевой и косметической, что делает реальным для населения риск поступления ДТ в организм эн-терально или через кожу. В последние 10 лет расширяется применение ДТ в форме наночастиц (наноДТ), для которых доказана способность к продукции на своей поверхности свободных радикалов [15, 17, 18], что ставит вопрос о генетической безопасности их применения. Действительно, установлено, что анатаз вызывал в культуре клеток разрывы ДНК [7, 10, 17], делеиии [4] и микроядра [7, 10, 13, 16]. Работы по оценке мутагенной активности ДТ на млекопитающих единичны. Известно, что у крыс частицы размером 180 нм при однократном введении в трахею индуцировали генные мутации в пневмоцитах [6]. Анатаз (21 нм) при поступлении с питьевой водой в организм мышей вызывал разрывы ДНК в клетках костного мозга и печени, микроядра в эритроцитах и даже мутации у потомков самок, экспонированных во время беременности [20]. Таким образом, изучение мутагенной активности ДТ на млекопитающих представляется актуальным.
Целью настоящего исследования была оценка влияния частиц ДТ разного размера на показатели микроядерного теста на эпителии слизистых оболочек внутренних органов животных.
Материалы и методы
Изучены два образца анатаза — покрытый симетико-ном наноДТ (размер частиц 33,16 ± 16,7 нм) (Германия) и высокочистый ДТ косметического качества микроДТ с размером частиц 160 ± 59,4 нм (США). В качестве стандартного мутагена использовали циклофосфан (ЦФ) ("Брынцалов, Ферейн").
Эксперименты проводили на самцах мышей Р1 СВАхС57В1/В6 массой тела 20 г и самцах белых крыс массой тела 210—240 г по 6 особей в группе*.
В опыте на мышах применили стандартную схему испытаний [2]. Суспензию ДТ в дистиллированной воде вводили в желудок в дозах 40, 200 и 1000 мг/кг 1 раз в
Юрченко В. В. — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (wyurchenko@mail.ru); Кривцова Е. К. — науч. сотр. лаб. генетического мониторинга; Юрцева Н. А. — ст. инженер лаб. генетического мониторинга; Тульская Е. А. — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. комплексного эколого-гигиенического нормирования (labtox430@mail.ru); Мамонов Р. А. — канд. мед. наук, науч. сотр. лаб. комплексного эколого-гигиенического нормирования (Iabtox430@mail.ru); Жолдакова 3. И. — д-р мед. наук, проф., вед. науч. сотр. лаб. комплексного эколого-гигиенического нормирования; Синицына О. О. — д-р мед. наук, зав. лаб. комплексного эколого-гигиенического нормирования; Мальцева М. М. — канд. биол. наук, зав. лаб. токсикологии; Панкратова Г. П. — канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. токсикологии; Сычева Л. П. — д-р биол. наук, зав. лаб. генетического мониторинга
•Исследования выполнены при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках Государственного контракта от 11.11.2008 г. № 01.648.12.3024.
день в течение 7 дней. В отдельной серии опыта мышам вводили водный раствор ЦФ в дозе 10 мг/кг 5-кратно с интервалом 24 ч. Животным контрольных групп вводили дистиллированную воду в том же режиме, что и опытным.
Крысам ДТ наносили на выстриженную поверхность кожи спины (0,5 г на 200 г массы тела на 16 см2) однократно в составе крема, в котором содержание ДТ (10 и 25%) не превышало разрешенное для применения на кожу человека. Экспозиция под повязкой продолжалась 4 ч с последующим смывом теплой водой. Дозы составили 250 и 625 мг/кг на 1 кг массы тела. Контрольных животных (с нанесением основы крема в том же объеме и без нанесения) также стригли и выполняли у них процедуру смывания.
По окончании экспозиции животных подвергали цервикальной дислокации (мышей через 1 сут после последнего введения, крыс — через 2 сут после аппликации), у мышей извлекали проксимальную часть толстой кишки и преджелудок, а у крыс — проксимальную часть толстой кишки и мочевой пузырь. После фиксации в формалине кусочки органов промывали 5 ч в проточной воде, выдерживали в 50% КОН при 20°С в течение 9— 11,5 ч и затем помещали в дистиллированную воду, где отделяли эпителиальный пласт, переносили его в центрифужные пробирки с дистиллированной водой и легко пипетировали. Диссоциированные клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1000 об/мин и из густой суспензии готовили мазок. Препараты окрашивали 2,5% ацетоорсеином при 37°С и 1% зеленым светлым. Перед просмотром препараты шифровали.
Анализировали по 1000 отдельно лежащих эпителиальных клеток на каждый образец (ув. 10x100). Учитывали как надежный маркер хромосомных и геномных мутаций клетки с микроядрами (МЯ) и как предположительные маркеры цитогенетической активности — клетки с выбуханием ядра в цитоплазму (протрузией) и с ядром атипичной формы [3]. Учитывали также клетки с числом ядер более одного.
Сверх этих 1000 клеток учитывали отдельно лежащие эпителиоциты в митозе**, а также дегенерирующие клетки с вакуолью, кариолизисом, конденсированным хроматином в ядре и кариорексисом.
Различия между группами оценивали с использованием критерия соответствия х2 в компьютерной программе Statistica for Windows 6.0.
Результаты и обсуждение
Среднегрупповые уровни цитогенетических нарушений и митотического индекса (МИ) представлены в табл. 1. Как видно, после введения в желудок мышам ДТ не индуцировал цитогенетические нарушения в эпите-лиоцитах толстой кишки и преджелудка. У крыс основа крема вызывала повышение частоты клеток с ядром атипичной формы в эпителии толстой кишки, но ДТ не проявил активности. В эпителии мочевого пузыря увеличивалась частота клеток с ядром атипичной формы после
**В мазках эпителия кишечника часто встречались лимфоциты из лимфоидных фолликулов. Как в интерфазе, так и в митозе цитоплазма в эпителиальных клетках хорошо окрашивалась зеленым светлым, а в лимфоцитах оставалась бесцветной.
нанесения на кожу наноДТ только в дозе 250 мг/кг. Однако этого результата недостаточно, чтобы сделать заключение о мутагенности наноДТ, так как положительный ответ был получен в единственной точке опыта.
ЦФ вызывал незначительное повышение частоты клеток с МЯ в эпителии толстой кишки мышей.
В табл. 1 можно видеть, что в тканях мышей микроДТ в дозе 40 мг/кг вызывал максимальное повышение МИ эпителиоцитов, который на больших дозах снижался до уровня контроля. НаноДТ индуцировал повышение МИ в кишечнике только в дозе 200 мг/кг, а в преджелудке — в дозе 40 мг/кг. У крыс в толстой кишке МИ увеличивался только под действием максимальной дозы микроДТ, а в мочевом пузыре — во всех случаях. Ни в одной ткани животных при экспозиции разными формами ДТ не было отмечено снижение МИ ниже уровня контроля, в то время как ЦФ проявил цитостатическое действие на эпителии преджелудка мышей.
Повышение МИ после воздействия ДТ могло быть связано с увеличением как пролиферативной активности клеток, так и продолжительности митоза. Задержку или блок в метафазе можно обнаружить по изменению индекса фаз (ИФ) митоза. Поэтому мы оценили ИФ для каждой точки опыта (за исключением мочевого пузыря крыс, где затруднительно было набрать для анализа дос-
таточное количество фигур деления). Накопление мета-фаз и относительное снижение частоты ана-телофаз было обнаружено только в двух точках опыта (рисунок). Очевидно, что столь ничтожный прирост доли метафаз среди других фаз митоза не мог обеспечить отмеченное в эксперименте удвоение МИ. Поэтому обнаруженное увеличение МИ следует отнести за счет ДТ-индуциро-ванного повышения митотической активности в ткани.
Если ускорение пролиферации имело восстановительный характер, то логично было бы ожидать и увеличение темпа гибели клеток. В эпителии кишечника клетки с признаками дегенерации не встречались. В эпителии преджелудка мышей частота клеток с вакуолью значительно увеличивалась после введения 40 и 200 мг/кг микроДТ, а клеток с лизисом ядра - при действии 200 мг/кг микроДТ, а также 40 и 1000 мг/кг наноДТ (табл. 2).
В эпителии мочевого пузыря крыс основа крема вызывала повышение частоты вакуализированных клеток и клеток повышенной ядерносги, однако введение в состав крема ДТ не сопровождалось усилением цитотоксичности.
Таким образом, увеличение митотической активности, отмеченное в разных тканях животных под действием двух форм ДТ, нельзя целиком отнести к восполнению убыли поврежденных клеток и надо искать другое объяснение обнаруженного эффекта.
Таблица 1
Средняя частота эпителиоцитов с онтогенетическими нарушениями и в митозе на 1000 (± ошибка среднего) после воздействия диоксида титана в микро- и наноформе
Вещество и доза, мг/кг
Микроядро
Протрузия ядра
Атипичное ядро
Митоз
Толстая кишка мышей
Контроль 1,7 ± 0,8 3,0 ± 1,1 3,7 ± 2,1 18,5 ± 4,8
Микро 40 0,7 ± 0,3 2,8 ± 0,9 5,5 ± 1,8 40,0 ± 6,3***
Микро 200 1,8 ± 0,7 3,3 ± 1,1 5,3 ± 2,4 26,0 ± 7,6*
Микро 1000 0,7 ± 0,2 2,0 ± 1,1 3,7 ± 2,9 19,2 ± 4,2
Нано 40 1,0 ± 0,3 2,8 ± 1,3 6,2 ± 2,3 27,5 ± 6,6
Нано 200 1,0 ± 0,6 0,5 ± 0,2" 5,0 ± 1,8 32,2 ± 5,3***
Нано 1000 1,2 ± 0,3 2,0 ± 0,9 2,3 ± 1,4 20,2 ±5,3
Контроль 0,2 ± 0,2 1,2 ± 0,6 7,5 ± 2,0 32,2 ± 8,6
Циклофосфан 10 1,5 ± 0,5* 2,0 ± 0,9 Преджелудок мышей 7,2 ± 2,7 26,5 ± 3,8
Контроль 0,5 ± 0,3 2,3 ± 0,6 8,7 ± 1,4 12,8 ± 1,9
Микро 40 0,5 ± 0,2 12,3 ± 0,7 6,7 ± 1,1 27,7 ± 5,4***
Микро 200 0,8 ± 0,3 2,7 ± 0,4 6,3 ± 1,4 29,2 ± 3,6***
Микро 1000 0,4 ± 0,2 2,7 ± 1,0 5,8 ± 1,5 10,0 ± 2,4
Нано 40 0,8 ± 0,4 2,2 ± 0,8 5,8 ± 1,1 23,8 ± 2,3**
Нано 200 0,5 ± 0,2 2,8 ± 0,6 7,0 ± 1,8 12,7 ± 1,8
Нано 1000 0,6 ± 0,2 2,8 ± 0,6 7,7 ± 1,9 10,2 ± 2,7
Контроль 0,5 ± 0,2 1,7 ± 0,5 3,3 ± 0,7 18,2 ± 3,4
Циклофосфан 10 0,4 ± 0,2 2,0 ± 0,6 Толстая кишка крыс 2,8 ± 0,7 11,8 ± 1,9**
Контроль 0,7 ± 0,3 6,6 ± 1,8 26,7 ± 2,4 19,8 ± 3,5
Контроль-основа 0,3 ± 0,3 6,0 ± 1,8 33,3 ± 6,7*** 23,8 ± 9,1
Микро 250 0,3 ± 0,2 7,3 ± 1,4 32,2 ± 6,6 23,3 ± 5,5
Микро 625 0,2 ± 0,2 10,2 ± 2,7 29,6 ± 4,9 36,6 ± 7,7***
Нано 250 0,2 ± 0,2 7,5 ± 0,7 25,2 ± 3,6** 22,5 ± 6,3
Нано 625 0,0 ± 0,0 7,7 ± 0,8 Мочевой пузырь крыс 24,5 ± 4,1 25,3 ± 4,9
Контроль 0,0 ± 0,0 8,0 ± 2,0 9,5 ± 2,1 0,5 ± 0,2
Контроль-основа 0,7 ± 0,3 4,3 ± 1,1 10,2 ± 2,9 0,5 ± 0,2
Микро 250 0,2 ± 0,2 5,2 ± 1,0 10,0 ± 2,3 2,0 ± 0,0*
Микро 625 0,2 ± 0,2 6,8 ± 1,1 10,6 ± 2,4 2,0 ± 0,4*
Нано 250 0,5 ± 0,3 5,2 ± 1,7 15,3 ± 3,0*** 3,0 ± 1,4**
Нано 625 0,5 ± 0,2 5,3 ± 1,1 11,2 ± 2,7 2,2 ± 1,1*
Примечание. Здесь и в табл. 2: * — р < 0,05; * * — р < 0,01; •**—/> < 0,001 по сравнению с контролем (для мочевого пуз
с контролем-основой крема).
jEmi
ена и санитария 5/2011
Таблица 2
Цитотоксичность диоксида титана в микро- и наиоформе для эпнтелиоцитов слизистых оболочек при введении в желудок мышам и нанесении на кожу крысам
Вещество и доза, мг/кг Эпителиоциты с признаком некроза на 1000 Клетки с числом ядер > 1 на 1000
перинуклеарная вакуоль лизис ядра конденсация хроматина в ядре кариорексис
Преджелудок мышей
Контроль 0,8 ± 0,3 0,2 ± 0,2 1,0 ± 0,4 1,2 ± 0,5
Микро 40 3,5 ± 2,7** 1,0 ± 0,6 1.0 ± 0,6 0,8 ± 0,5
Микро 200 8,8 ± 5,9*** 1,2 ± 0,6* 1,2 ± 0,4 0,5 ± 0,3
Микро 1000 1,3 ± 0,7 0,2 ± 0,2 0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,3
Нано 40 1,5 ± 0,4 1,2 ± 0,6* 0,7 ± 0,3 0,5 ± 0,2
Нано 200 1,3 ± 0,4 0,5 ± 0,3 0,2 ± 0,2 0,7 ± 0,5
Нано 1000 1,8 ± 0,9 2,2 ± 1,5** 1,0 ± 0,8 1,0 ± 0,3
Контроль 1,5 ± 0,8 1,3 ± 1,0 1,2 ± 0,4 1,7 ± 0,4
Циклофосфан 10 21,2 ± 13,0*** 7,2 ± 3,8*** 3,8 ± 1,1 4,0 ± 1,5*
Мочевой пузырь крыс
Контроль 3,3 ± 0,9 1,0 ± 0,5 37,4 ± 7,2
Контроль-основа 7,5 ± 2,4** 1,2 ± 0,6 50,3 ± 9,8**
Микро 250 3,7 ± 0,8** 0,8 ± 0,3 47,2 ± 7,8
Микро 625 6,0 ± 1,5 1,8 ± 0,6 58,0 ± 8,6
Нано 250 Нано 625
1,3 ± 0,2"* 5,0 ± 0,7
0,3 ± 0,2 1,2 ± 0,4
43, 7 ± 9,9 44,3 ± 6,3
В литературе имеются сведения о том, что ДТ с размером частиц от десятков до 1000 нм при добавлении в культуру клеток вызывал экспрессию генов, ответственных за продукцию сигнальных молекул воспаления, в том числе активирующих клеточный цикл |8, И, 12, 14, 15, 18, 19]. По мнению экспертов МАИР, воспаление является причиной развития рака при длительном ингаляционном поступлении разных форм ДТ [5]. Альвеолярное воспаление у мышей и крыс возникало даже после однократного интратрахеального введения как микро-, так и наноДТ [6, 9|. При этом в легких обнаруживали не только активацию генов воспаления, но и реальное увеличение доли делящихся пневмоцитов [9]. Энтеральное поступление наноДТ в организм мышей сопровождалось экспрессией т-РНК провоспалительных цитокинов в клетках крови [20].
Опираясь на приведенные, далеко не полные сведения, можно предположить, что наблюдавшееся в наших экспериментах увеличение митотической активности в эпителии изученных тканей мышей и крыс могло быть одним из проявлений ДТ-индуцированно-го воспаления.
100 п
80 -60 -40 -20 -
шя
| Ана-телофаза
40 200 Метафаза
1000
Профаза
Распределение по фазам митоза делящихся эпнтелиоцитов в эпителии преджелудка мышей после введения в желудок диоксида титана в микроформе (микроДТ).
По оси абсцисс — доза, мг/кг; по оси ординат — доля клеток в данной фазе митоза, %.
Закл ючение
Образцы диоксида титана со средним размером частиц 33,2 нм (с покрытием симетиконом) и 160 нм не вызывали цитогенетические нарушения в клетках эпителия слизистых оболочек при введении в желудок мышам в дозах 40, 200 и 1000 мг/кг (толстая кишка и преджелудок) и при нанесении на кожу крыс в дозах 250 и 625 мг/кг (толстая кишка и мочевой пузырь). Во всех изученных тканях оба образца диоксида титана вызывали повышение митотической активности.
JI итература
1. Журков В. С. // Полиорганный микроядерный тест в эко-лого-гигиенических исследованиях. — М., 2007. — С. 8— 16.
2. Оценка мутагенного действия пестицидов: Метод, рекомендации. — М., 2003.
3. Юрченко В. В., Кривцова Е. К., Беляева Н. Н. и др. // Гиг. и сан. - 2008. - № 6. - С. 49-53.
4. An Хи, Yunfei Chai, Takehiko Nohmi et al. // Particle Fibre Toxicol. - 2009. — Vol. 6, N 3. Publ. online 2009 January 20, doi:10.1186/i743-8977-6-3.
5. Baan R. А. // Inhal. Toxicol. - 2007. - Vol. 9 (suppl. 1). -P. 213-228.
6. Driscoll К. E., Deyo L. C., Carter J. M. et al. // Carcinogenesis.
- 1997. - Vol. 18, N 2. - P. 423-430.
7. Falck G. C., Lindberg H. K., Suhonen S. et al. // Hum. Exp. Toxicol. - 2009. - N 6-7. - P. 339-352.
8. Goncalves D. M., Chiasson S., Girard D. // Toxicol. In Vitro.
- 2010. - Vol. 24. - P. 1002-1008.
9. Huei-Wen Chen, Sheng-Fang Su, Chiang-Ting Chien et al. // FASEB J. - 2006. - Vol. 20, N 13. - P. 2393-2403.
10. KangS. J., Kirn B. M„ Lee У. J., Chung H. W. // Environ. Mol. Mutagen. - 2008. - Vol. 49, N 5. - P. 399-405.
11. Kang S. J., Kim В. M., Lee Y. J. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2009. - Vol. 386, N 4. - P. 682-687.
12. Lee Y. S., Yoon H. J., Lee K. et al. // Toxicol. Lett. - 2009. -Vol. 189, N 3. - P. 191-199.
13. Lu P. G., Ho J. C., Lee Т. C. // Mutat. Res. - 1998. -Vol. 414, N 1-3. - P. 15-20.
14. Monteiller C., Tran L., MacNee W. et al. // Occup. Environ. Med. - 2007. - Vol. 64. - P. 609-615.
15. Park E. J., Yi J., Chung К. H. et al. // Toxicol Lett. - 2008.
- Vol. 180, N 3. - P. 222-229.
16. Rahman Q., Lohary M., Dopp E. et al. // Environ. Hlih Per-spect. - 2002. - Vol. 110, N 8. - P. 797-800.
17. Reeves J. F., Davies S. J., Dodd N. J. F., Jha A. N. // Mutat. Res. - 2008. - Vol. 640, N 1-2. - P. 113-122.
18. Singh S., Shi T., Duffin R. et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2007. - Vol. 222. - P. 141-151.
19. Too F., Kobzik L. //Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2002. -Vol. 26, N 4. - P. 499-505.
20. Trouiller В., Retiene R., Westbrook A. et al. // Cancer Res. — 2009. - Vol. 69, N 22. - P. 8784-8789.
Поступила 25.02.11
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2011 УДК 612.014.46:575.113].086
Л. В. Ахальцева, Н. Е. Мошков, Ф. И. Ингель, Н. А. Юрцева, В. В. Юрченко
ВЛИЯНИЕ НАНО- И МИКРОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА НА ПОКАЗАТЕЛИ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА НА КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
ФГБУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина Минздравсоцразвития России, Москва
В микроядерном тесте с цитохалазином В на клетках крови двух доноров изучена активность нано- и микрочастиц диоксида титана (ДТ) в дозах 1,6, 40 и 500 мкг/мл. Показано, что наноДТ в дозах 1,6 и 40 мкг/мл более активно, чем микроАДТ, индуцировал микроядра и нуклеоплазменные мосты, асимметрию деления клеток и ускорение пролиферации клеток. Некоторые различия в индивидуальной чувствительности к ДТ, обнаруженные между культурами крови доноров, были обусловлены противоположной динамикой связи между показателями повреждения генома и апоптоза.
Новый метод морфометрии ядер, разработанный для скрининга генотоксических эффектов и впервые использованный в данной работе, позволил выявить дозозависимое увеличение асимметрии ядер в двуядерных клетках культур обоих доноров под действием наноДТ, причем морфометрические эффекты прямо коррелировали с показателями цитогенетического анализа.
Ключевые слова: наночастицы диоксида титана, микроядерный тест с цитохалазином В на лимфоцитах периферической крови че,ювека, морфометрический анализ асимметрии ядер
L. V. Akhaltseva, N. Е. Moshkov, F. 1. lngel, N. A. Yurtseva, V. V. Yurchenko. - EFFECT OF TITANIUM DIOXIDE NANO- AND MICROPARTICLES ON THE VALUES OF THE MICRONUCLEUS TEST WITH HUMAN WHOLE BLOOD
The activity of the nano- and microparticles of titanium dioxide (TD) given in doses of 1.6, 40.0, and 500 fjg/ml was studied in the cytochalasin В block micronucleus test with blood cells from two donors. It was shown that nano-DT in doses of 1.6 and 40 fjg/ml was more active than micro-DT in inducing micronuclei and nucleoplasmic bridges, asymmetric cell division, and accelerated cell proliferation. Some differences in individual sensitivity to TD between donor blood cultures were due to an inverse trend in the association between the indicators of genomic damage and apoptosis.
The new nuclear morphometry test that had developed to screen genotoxic effects and used in this study for the first time revealed a nano-DT dose-depended increase in the asymmetry of nuclei in the binucleated cells in the cultures of both blood donors, the morphometric effects being directly correlated with the values of cytogenetic analysis.
Key words: titanium dioxide (TD) nanoparticles, cytochalasin В block micronucleus test with human peripheral blood lymphocytes
Частицы диоксида титана (ДТ) входят в состав изделий, применение которых предусматривает непосредственный контакт с организмом человека (косметические препараты, красители для пищевых продуктов и пр.). Однако известно, что частицы ДТ могут индуцировать ге-нотоксические эффекты in vivo и in vitro [6, 10, 11, 15, 17, 18] и усиление пролиферации клеток [4, 14], что характерно для канцерогенов.
Настоящее исследование направлено на оценку влияния разных форм ДТ на показатели нестабильности генома лимфоцитов крови здоровых доноров in vitro. Исследования проводили в микроядерном тесте с цитохалазином В, который официально рекомендован как краткосрочный тест для выявления мутагенов и генотоксических канцерогенов [7, 8]. Расширенный вариант ци-
Ахальцева Л. В. — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (ahallv@mail.ru); Мошков Н. Е. — аспирант лаб. генетического мониторинга (n_moshkov@mail.ru): Ингель Ф. И. — д-р биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (£ат-aingel@mail.ru); Юрцева Н. А. — вед. инженер лаб. генетического мониторинга (urtseva@mail.ru); Юрченко В. В. — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (wyurchenko@mail.ru)
тогенетического анализа в микроядерном тесте с цитохалазином В на лимфоцитах крови человека [2, 3], использованный в данной работе, создает уникальные возможности для оценки комплекса эффектов — повреждения генома, особенностей пролиферации клеток и апоптоза.
Материалы и методы
Изучали два образца ДТ, полученные из природного анатаза (поставщик ТСУ^МесЬпо^еБ"): покрытые си-метиконом частицы размером 33,16 ± 16,7 нм (Германия) — наноДТ и высокочистый ДТ косметического качества (160 ± 59,4 нм, США) - микроДТ.
Влияние ДТ на нестабильность генома определяли на образцах гепаринизированной венозной крови двух молодых практически здоровых некурящих доноров-муж-чин (пробы до начала культивирования 24 ч хранили при 4°С). Постановку и фиксацию культуры проводили в соответствии с международными рекомендациями [7—9]. ДТ до конечных концентраций 1,6, 40 и 500 мкг на 1 мл культуры добавляли на 24-м часу от начала постановки, цитохалазин В (6 мкг/мл) вводили на 44-м часу. Клетки фиксировали на 72-м часу смесью метанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) и окрашивали азур-эозином по Романовскому.
