CC BY
5
16. Rahman Q., Lohary M., Dopp E. et al. // Environ. Hlih Per-spect. - 2002. - Vol. 110, N 8. - P. 797-800.
17. Reeves J. F., Davies S. J., Dodd N. J. F., Jha A. N. // Mutat. Res. - 2008. - Vol. 640, N 1-2. - P. 113-122.
18. Singh S., Shi T., Duffin R. et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2007. - Vol. 222. - P. 141-151.
19. Too F., Kobzik L. //Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2002. -Vol. 26, N 4. - P. 499-505.
20. Trouiller В., Retiene R., Westbrook A. et al. // Cancer Res. — 2009. - Vol. 69, N 22. - P. 8784-8789.
Поступила 25.02.11
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 2011 УДК 612.014.46:575.113].086
Л. В. Ахальцева, Н. Е. Мошков, Ф. И. Ингель, Н. А. Юрцева, В. В. Юрченко
ВЛИЯНИЕ НАНО- И МИКРОЧАСТИЦ ДИОКСИДА ТИТАНА НА ПОКАЗАТЕЛИ МИКРОЯДЕРНОГО ТЕСТА НА КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
ФГБУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина Минздравсоцразвития России, Москва
В микроядерном тесте с цитохалазином В на клетках крови двух доноров изучена активность нано- и микрочастиц диоксида титана (ДТ) в дозах 1,6, 40 и 500 мкг/мл. Показано, что наноДТ в дозах 1,6 и 40 мкг/мл более активно, чем микроАДТ, индуцировал микроядра и нуклеоплазменные мосты, асимметрию деления клеток и ускорение пролиферации клеток. Некоторые различия в индивидуальной чувствительности к ДТ, обнаруженные между культурами крови доноров, были обусловлены противоположной динамикой связи между показателями повреждения генома и апоптоза.
Новый метод морфометрии ядер, разработанный для скрининга генотоксических эффектов и впервые использованный в данной работе, позволил выявить дозозависимое увеличение асимметрии ядер в двуядерных клетках культур обоих доноров под действием наноДТ, причем морфометрические эффекты прямо коррелировали с показателями цитогенетического анализа.
Ключевые слова: наночастицы диоксида титана, микроядерный тест с цитохалазином В на лимфоцитах периферической крови человека, морфометрический анализ асимметрии ядер
L. V. AkhaUseva, N. Е. Moshkov, F. 1. lngel, N. A. Yurtseva, V. V. Yurchenko. - EFFECT OF TITANIUM DIOXIDE NANO- AND MICROPARTICLES ON THE VALUES OF THE MICRONUCLEUS TEST WITH HUMAN WHOLE BLOOD
The activity of the nano- and microparticles of titanium dioxide (TD) given in doses of 1.6, 40.0, and 500 fjg/ml was studied in the cytochalasin В block micronucleus test with blood cells from two donors. It was shown that nano-DT in doses of 1.6 and 40 /jg/т! was more active than micro-DT in inducing micronuclei and nucleoplasmic bridges, asymmetric cell division, and accelerated cell proliferation. Some differences in individual sensitivity to TD between donor blood cultures were due to an inverse trend in the association between the indicators of genomic damage and apoptosis.
The new nuclear morphometry test that had developed to screen genotoxic effects and used in this study for the first time revealed a nano-DT dose-depended increase in the asymmetry of nuclei in the binucleated cells in the cultures of both blood donors, the morphometric effects being directly correlated with the values of cytogenetic analysis.
Key words: titanium dioxide (TD) nanoparticles, cytochalasin В block micronucleus test with human peripheral blood lymphocytes
Частицы диоксида титана (ДТ) входят в состав изделий, применение которых предусматривает непосредственный контакт с организмом человека (косметические препараты, красители для пищевых продуктов и пр.). Однако известно, что частицы ДТ могут индуцировать ге-нотоксические эффекты in vivo и in vitro [6, 10, 11, 15, 17, 18] и усиление пролиферации клеток [4, 14], что характерно для канцерогенов.
Настоящее исследование направлено на оценку влияния разных форм ДТ на показатели нестабильности генома лимфоцитов крови здоровых доноров in vitro. Исследования проводили в микроядерном тесте с цитохалазином В, который официально рекомендован как краткосрочный тест для выявления мутагенов и генотоксических канцерогенов [7, 8]. Расширенный вариант ци-
Ахальцева Л. В. — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (ahallv@mail.ru); Мошков Н. Е. — аспирант лаб. генетического мониторинга (n_moshkov@mail.ru): Ингель Ф. И. — д-р биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (£ат-aingel@mail.ru); Юрцева Н. А. — вед. инженер лаб. генетического мониторинга (urtseva@mail.ru); Юрченко В. В. — канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. генетического мониторинга (wyurchenko@mail.ru)
тогенетического анализа в микроядерном тесте с цитохалазином В на лимфоцитах крови человека [2, 3], использованный в данной работе, создает уникальные возможности для оценки комплекса эффектов — повреждения генома, особенностей пролиферации клеток и апоптоза.
Материалы и методы
Изучали два образца ДТ, полученные из природного анатаза (поставщик "ЬСУ/^есЬпок^еБ"): покрытые си-метиконом частицы размером 33,16 ± 16,7 нм (Германия) — наноДТ и высокочистый ДТ косметического качества (160 ± 59,4 нм, США) - микроДТ.
Влияние ДТ на нестабильность генома определяли на образцах гепаринизированной венозной крови двух молодых практически здоровых некурящих доноров-муж-чин (пробы до начала культивирования 24 ч хранили при 4°С). Постановку и фиксацию культуры проводили в соответствии с международными рекомендациями [7—9]. ДТ до конечных концентраций 1,6, 40 и 500 мкг на 1 мл культуры добавляли на 24-м часу от начала постановки, цитохалазин В (6 мкг/мл) вводили на 44-м часу. Клетки фиксировали на 72-м часу смесью метанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) и окрашивали азур-эозином по Романовскому.
ГИГИ
ена и санитария 5/2011
Таблица 1
Влияние диоксида титана на особенности пролиферации клеток в культуре цельной крови человека (в % каждой фракции в спектре клеточных популяций)
Размер частиц Донор Концентрация ДТ, мкг/мл Одноядерные Двуядерные Трехъядер-ные Четырехъ-ядерные Более четырех ядер Все ускоренно делящиеся** Митоз Апоптоз
Нано 1 0 23,20 44,4 5,4 15,8 1,8 23,0 3,20 6,20
1,6 18,80 34,4* 6,4 23,0* 6,0* 35,4* 2,40 9,00
40 20,40 29.0* 5,0 20,8* 10,8* 36,6* 4,00 10,00*
500 16,00* 33,0* 4,2 21,8* 12,4* 38,4* 2,80 9,80*
2 0 28,60 34,2 4,4 14,2 4,6 23,2 2,60 11,20
1,6 23,00 32,6 4,2 19,8 5,4 29,4* 3,20 11,80
40 23,40 33,6 7,2 18,2 8,0* 33,4* 3,20 6,40
500 28,60 33,8 5,0 11,4 3,2 19,6 3,20 14,80
Микро 1 0 23,20 44,4 5,4 15,8 1,8 23,0 3,20 6,20
1,6 25,40 41,8 4,6 19,4 1,8 25,8 2,80 4,20
40 21,60 37,0* 7,0 20,8* 2,2 30,0* 5,60 5,80
500 23,40 35,2* 5,0 20,4 8,4* 33.8* 2,60 5,00
2 0 28,60 34,2 4,4 14,2 4,6 23,2 2,60 11,20
1,6 32,60 34,2 2,6 11,0 3,4 17,0* 4,20 8,20
40 28,40 34,8 3,0 11.4 1,6* 16,0* 3,40 17,40*
500 33,00 32,6 3,4 12,0 2,8 18,2 2,00 14,20
Примечание. Время культивирования рассчитано авторами теста таким образом, чтобы на момент фиксации максимальное количество делящихся клеток имело 2 ядра [7, 8). Поэтому все клетки с большим числом ядер мы определили как ускоренно делящиеся [2, 3]. Полужирным шрифтом выделены различия в спонтанной пролиферативной активности двух доноров: двуядерные клетки, х1 = '0,9; клетки с числом ядер более 4, х2 = 20,8; * — р < 0,01 по сравнению с соответствующим контролем.
Цитогенетический анализ шифрованных препаратов проводили в 2 этапа. Сначала при подсчете 500 клеток определяли количество клеток, содержащих 1, 2, 3, 4 и больше ядер, отмечая среди них клетки с микроядрами (МЯ) и нуклеоплазменными мостами, а также клетки в состоянии митоза или апоптоза. Затем на других участках стекла анализировали на присутствие МЯ и нуклео-плазменных мостов только двуядерные клетки, доводя их общее количество до 1000.
Дополнительно на каждом препарате анализировали микрофотографии 100 двуядерных клеток без МЯ, мостов и других видимых повреждений (ув. 10x40). В программном пакете ADOBE Photoshop проводили обработку этих изображений и измеряли площади ядер. Для каждой (i-й) клетки рассчитывали отношение площади большего ядра к площади меньшего ядра (Sli/S2i). Затем
на основании полученных данных для каждого цитоге-нетического препарата вычисляли медиану, абсолютную (75—25%о) и относительную (75%о/25%о) ширину квартального коридора.
Результаты и обсуждение
Как показал цитогенетический анализ, при одинаковом пролиферативном пуле спектр делящихся клеток доноров исходно различался: у донора 2 в культуре была выше частота клеток с укороченным циклом (содержащих больше 4 ядер), но ниже частота двуядерных клеток (табл. 1). Однако на введение наноДТ культуры крови обоих доноров отвечали сходным образом — увеличением численности фракций ускоренно делящихся клеток, т. е. усилением пролиферации. В культуре донора 1 этот
Таблица 2
Повреждения генома в культурах крови человека под действием разных форм диоксида титана
Концентра- % двуядер- % двуядер- % трехъядер- % четырехъ- % клеток с числом ядер более четырех МЯ и мостами Ускоренно делящиеся клетки с МЯ и % делящихся
Образен ДТ Донор ция ДТ, ных клеток с ных клеток с ных клеток с ядерных клеток клеток с МЯ и
мкг/мл МЯ МЯ и мостами МЯ и мостами с МЯ и мостами мостами
мостами
Нано
Микро
0 0,2 0,4 3,7 2,53 11,11 3,48 2,37
1,6 0 0,2 12,50* 8,7 16,67 10,73* 6,02
40 0,7 0,9 20,00* 12,50* 20,37 15,85* 11,59
500 0,5 0,9 9,52* 11,93* 24,19 15,63* 10,92
0 0,3 0,4 3,85 5,88 25 11,21 5,92
1,6 0,3 0,5 4,76 7,07 25,93 10,20 6,45
40 0,6 0,9 5,56 14,29* 30 16,7 10,75
500 0,3 0,3 8,00* 3,51 6,25 5,10 3,00
0 0,2 0,4 3,7 2,53 1,11 3,48 2,37
1,6 0,5 0,5 0 5,15 22,22 5,43 3,55
40 0,4 0,4 5,71 7,69* 18,18 8,00 4,78
500 0,6 0,6 12,00* 18,63* 28,57 20,12* 11,59
0 0,3 0,4 3,85 5,8В 25 11,21 5,92
1,6 0,3 0,5 7,69* 9,09 5,88* 8,24 4,36
40 0,5 0,5 0 7,02 12,50* 6,25 3,94
500 0,6 0,6 0 8,33 7,14* 6,59 4,72
0,01 по сравнению с соответствующим контролем.
Донор 1
Донор 2
Я =0,56
Связь апоптоза и частоты делящихся клеток с повреждениями в культурах крови доноров при экспозиции нано-формой диоксида титана.
По оси абсцисс — клетки в состоянии апоптоза, %; по оси ординат — делящиеся клетки с повреждениями, 9t.
эффект проявлялся в большем диапазоне концентраций ДТ, чем в культуре донора 2, и сопровождался уменьшением численности двуядерных клеток. Реакция культур донора I на присутствие микроДТ была аналогична описанной выше, а в культурах донора 2, наоборот, доля ускоренно делящихся клеток с увеличением дозы снижалась. В целом можно сказать, что влияние наноДТ на пролиферацию лимфоцитов было более выраженным, чем микроДТ.
ДТ-индуцированные цитогенетические повреждения (табл. 2) наблюдали только среди клеток, успевших за время культивирования пройти не менее 2 митозов (т. е. имевших укороченный клеточный цикл). В культурах обоих доноров эффект наноДТ имел прямую зависимость от дозы в интервале от 0 до 40 мкг/мл с дальнейшим выходом на плато или перегибом, а для микроДТ аналогичную картину наблюдали только в культурах донора I.
Мы попытались связать различие дозовых зависимостей ДТ-индуцированных повреждений у разных доноров с митотической активностью и/или гибелью клеток путем апоптоза (см. табл. 1). Митотическая активность была примерно одинакова во всех культурах и поэтому не могла повлиять на ход дозовой кривой. В то же время при действии наноДТ на клетки донора 1 наблюдалась прямая линейная связь генетических повреждений и апоптоза (см. табл. 1, 2), а для донора 2, наоборот, максимальный уровень повреждений сочетался с минимальным уровнем апоптоза (рисунок), т. е. различия между донорами по чувствительности лимфоцитов крови к воздействию in vitro, вероятнее всего, были связаны с особенностями соотношения процессов повреждения генома и апоптоза. Опыт проведенных ранее массовых обследований разных групп взрослых и детей показал, что прямая корреляционная связь частоты повреждения генома с уровнем апоптоза (как спонтанных, так и после воздействия на культуру ионизирующего излучения или стандартного мутагена) была характерна преимущественно для культур крови людей, находившихся на момент обследования в состоянии психологического комфорта. При этом для людей в состоянии повышенного эмоционального напряжения (неадаптивного стресса) наблюдали обратную зависимость [1—3, 5, 16]. Подобная связь была показана в экспериментах на животных [12, 13]. Мы полагаем, что дальнейшее изучение этого феномена позволит оптимизировать стратегию отбора доноров для испытания факторов in vitro.
В рамках настоящего исследования была проведена апробация нового метода скрининга генотоксических эффектов, основанного на анализе степени асимметрии ядер в двуядерных клетках по соотношению их площа-
дей. Результаты этого анализа показали, что наноДТ вызывал дозозависимое увеличение асимметрии ядер в культурах обоих доноров. При этом были выявлены значимые корреляции между морфометрическими данными и некоторыми показателями цитогенетических эффектов, что доказывает перспективность использования морфометрии ядер для предварительного скрининга генотоксических эффектов в микроядерном тесте с цито-халазином В.
Асимметрия ядер в двуядерных клетках может свидетельствовать об асимметричном делении ядер, наличии анеуплоидии либо о различиях в компактности хроматина, возникших в результате экспозиции, причем индукция любого из этих событий указывает на генотоксиче-скую активность изучаемого фактора.
Обобщая результаты исследования разных образцов ДТ, следует заключить, что наноДТ обладал более выраженной генотоксической активностью на культуре крови обоих доноров, чем микроДТ, индуцируя асимметрию ядер в двуядерных клетках, образование трехъядерных клеток, сокращение продолжительности клеточного цикла (ускорение пролиферации клеток) и повреждения в клетках с укороченным под влиянием ДТ циклом (что свидетельствует о закреплении генетических повреждений в поколениях делящихся клеток).
Индивидуальные эффекты в культурах разных доноров были связаны с противоположной динамикой взаимосвязи показателей повреждения ДНК и апоптоза.
J1 итература
1. Ингель Ф. И. // Экол. генетика. — 2005. — Т. 3, № 3. — С. 38-46.
2. Ингель Ф. И. Ц Экол. генетика. - 2006. — Т. 4, № 3. — С. 7-19.
3. Ингель Ф. И. // Экол. генетика. — 2006. — Т. 4, № 4. — С. 39-54.
4. Bacakova L., Hergel J., Wilhelm J. // Physiol. Res. — 1999. — Vol. 48, N 5. - P. 341-351.
5. Dimilroglou £., Zafiropoulou M, Messini-Nikolaki N. et al. // Int. J. Hyg. Environ. Hlth. - 2003. - Vol. 206, N 1. - P. 39-44.
6. Falck G. C., Lindberg H. К, Suhonen S. // Hum. Exp. Toxicol.
- 2009. - N 6-7. - P. 339-352.
7. Fenech M„ Chang W. P., Kirsch- Volders M. et al. // Mutât. Res.
- 2003. - Vol. 534. - P. 65-75.
8. Fenech M. // Mutât. Res. - 2006. - Vol. 537, N 7. - P. 127-13.
9. Gonzalez L., Sanderson В. J. S., Kirsch-Volders M. // Mutagenesis. - 2011. - Vol. 26, N 1. - P. 185-191.
10. Guideline on the limits of genotoxic impurities committee for medical prodaucts for human use (CHMP) — London, 2006. CPMP/SWP/5199/02; EMEA/CHMP/QWP/251344/2006 ht-tp://www.ema.curopa.eu/docs/en GB/document library/Sci-entific'guideline/2 009/09/WC500002903 .pdf
11. Kong S. J., Kim В. M., Lee Y. J., Chung H. W. // Environ. Mol. Mutagen. - 2008. - Vol. 49, N 5. - P. 399-405.
12. Karpinets T. V., Foy B. D. //J. Theor. Biol. - 2004. - Vol. 227, N 2. - P. 253-264.
13. Karpinets T. V., Foy B. D. // Carcinogenesis. — 2005. — Vol. 6, N 8. - P. 1323-1334.
14. Lee Y. S., Yoon H. J., Lee K. et al. // Toxicol. Lett. - 2009. -Vol. 189, N 3. - P. 191-199.
15. Lu P. О., Но I. С., Lee T. C. // Mutat. Res. - 1998. -Vol. 414, N 1-3. - P. 15-20.
16. Psimadas D., Messini-Nikolaki N., Zafiropoulou M. et al. // Cancer Lett. - 2004. - Vol. 204, N 1. - P. 33-40.
17. Rahman Q., Lohary M., Dopp E. et al. // Environ. Hlth Per-spect. - 2002. - Vol. 110, N 8. - P. 797-800.
18. Sohaebuddin S. K., Thevenot P. T., Baker D. et al. // Part Fibre Toxicol. - 2010. - Vol. 7. - P. 22-38.
Поступила IS.09.1I
