CC BY
102
УДК 576.52;577.352
Применение метода двумерного электрофореза для изучения состава рецепторного комплекса, образуемого на рецепторе CD95/Fas
Д. Риесс, И. Н. Лаврик*
Немецкий научный центр раковых исследований, 69120, Гейдельберг, Германия *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 25.05.2010 г.
реферат Активация рецептора CD95 (APO-1/Fas) приводит к инициации апоптоза в клетках эукариот. Индукция апоптоза начинается с образования белкового комплекса на рецепторе CD95 (APO-1/Fas), который получил название DISC (death-inducing signaling complex, сигнальный комплекс, индуцирующий гибель клеток). В представленной работе для анализа состава рецепторного комплекса DISC применили методы протеомики. Предположили, что состав комплекса DISC играет ключевую роль в инициации апоптоза. С помощью метода двумерного электрофореза проанализировали комплексы DISС в клетках двух типов, различающихся скоростью индукции апоптоза. Показано, что клетки обоих типов содержат такие основные компоненты комплекса DISQ как рецептор CD95, адаптерная молекула FADD и прокаспаза-8. Также с помощью двумерного электрофореза удалось выявить различия в составе рецепторного комплекса CD95, выделенного из клеток двух типов. Таким образом, методами протеомики показано, что белковый состав комплекса DISС не одинаков в клетках двух типов, что может определять различия в скорости инициации апоптоза. ключевые слова апоптоз, рецептор CD95, двумерный электрофорез, DIS^
введение
Способность запускать самоликвидацию, или апоптоз, является неотъемлемым свойством клеток высших эукариот [1]. В клетках млекопитающих существует несколько программ инициации клеточной гибели в ответ на повреждения ДНК, при отсутствии факторов роста, а также в ответ на активный сигнал смерти, передаваемый секретируемы-ми или мембраносвязанными цитокинами через так называемые рецепторы смерти [1, 2].
Семейство рецепторов смерти состоит из восьми белков: TNF-R1, CD95 (APO-1/Fas), DR3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, DR6, EDA-R и NGF-R [2]. Считается, что для передачи сигнала эти рецепторы должны образовывать олигомерные структуры, предположительно тримеры [1-3]. Цитоплаз-матическая часть рецепторов смерти содержит так называемые домены смерти, которые характеризуются способностью к гомотипической олигомеризации. Адаптерные молекулы, содержащие такой домен, и вовлекаются в ре-цепторый комплекс.
Наиболее полно изучен механизм передачи сигнала клеточной гибели через CD95/APO-1/Fas [1, 3]. Сборка активного инициаторного комплекса, называемого DISC, происходит за секунды после связывания лиганда СD95 с рецептором СD95 [3-5]. В качестве адаптера рецептор использует белок FADD, содержащий домен смерти. Второй функциональный домен этой молекулы - DED (death
effector domain) - за счет гомотипических белок-белковых взаимодействий рекрутирует в рецепторный комплекс прокаспазу-8, которая затем подвергается аутопротеоли-тическому расщеплению с образованием активной формы каспазы-8 (рис. 1). На следующих этапах активируются каспазы-3 и -7, а затем и субстраты апоптоза [2] (рис. 1). Характерная особенность механизма передачи сигнала смерти через CD95 состоит в существовании двух типов сигнальных путей, которые встречаются в клетках двух типов [4] (рис. 1). В клетках первого типа повышено количество комплекса CD95 DISC и соответственно активной каспазы-8, которая затем расщепляет каспазы-3 и -7 [4]. В клетках второго типа комплекс CD95 DISC образуется менее эффективно, и они содержат гораздо меньше каспа-зы-8, чем клетки первого типа. Поэтому для эффективной индукции апоптоза клетки второго типа нуждаются в амплификации сигнала, что достигается с помощью следующего механизма: активированная каспаза-8 расщепляет молекулу Bid, и образовавшийся фрагмент tBid транслоци-руется в митохондрии, что приводит к выходу цитохрома с в цитоплазму с последующим формированием комплекса апоптосомы. В апоптосоме происходит активация каспа-зы-9, которая в свою очередь расщепляет (активирует) каспазы-3 и -7 (рис. 1). К клеткам первого типа относятся клеточные линии В-лимфоцитов SKW6.4, Raji, BJAB; клеточные линии Т-лимфоцитов Hut78, а также перифериче-
CD95
Тип I FADD
гп
Прокаспазы-8/10
Тип II
Bid
Каспаза-8
tBid
Bcl-2
Прокаспазы*
3/7
Bcl-xl
Цитохром с
Прокаспаза-9
Каспазы-3/7 Каспаза-9
с * с ^
Апоптосома
Суб_страты каспаз
Апоптоз
Рис. 2. Контроль образования CD95 DISC с помощью вестерн-блотинга. Иммунопреципитаты CD95 (1/10 от количества образца, нанесенного на двумерный гель) анализировали с помощью одномерного электрофореза и вестерн-блотинга с моноклональными антителами С15 против каспазы-8. Положение прокаспазы-8 (р55/р53) и продуктов ее расщепления р43/р41, р18 и р10 указано стрелками.
Рис. 1. Два типа передачи сигнала через рецептор CD95. Под действием лиганда на мембране происходит сборка комплекса CD95 DISC. Связывание молекулы FADD обусловлено взаимодействием доменов смерти DD (death domain). За счет взаимодействий DED (death effector domain)-доменов в комплекс поступают прокаспазы-8/10 и с-FLIP. При связывании прокаспазы-8 в комплекс CD95 DISC происходит образование активной каспазы-8. Затем в клетках первого типа, которые характеризуются повышенным образованием комплекса CD95 DISC и соответственно активной каспазы-8, апоптоз зависит от активации каспаз-3 и -7. В клетках второго типа образуется гораздо меньшее количество комплекса CD95 DISC, и для эффективной индукции апоптоза необходима амплификация сигнала, включающая расщепление Bid с помощью каспазы-8, транслокацию tBid в митохондрии, выход цитохрома с из митохондрий, образование апоптосо-мы и последующую активацию каспаз.
ские Т-клетки. К клеткам второго типа относятся клеточные линии Т-лимфоцитов СЕМ и Jurkat [4].
Природа различий между клетками первого и второго типа пока не установлена. Предполагается, что белковый состав комплекса CD95 DISC в клетках разного типа не одинаков. Вероятно, в клетках второго типа в состав комплекса CD95 DISC входят белки, ингибирующие активацию прокаспазы и инициацию апоптоза. Проверка этой гипотезы, а именно сравнительный анализ белкового состава комплекса CD95 DISC в клетках двух типов с помощью методов протеомики, и стала задачей нашей работы.
В представленной работе методом двумерного электрофореза проанализирован состав комплекса CD95 DISC. Этот метод основан на электрофоретическом разделении белков в двух направлениях - в соответствии с величинами изоэлектрических точек (pI) в первом и в соответствии с молекулярной массой (М ) во втором [6]. Этот подход является важнейшей частью современной стратегии протеом-ных исследований. Вместе с тем существуют с различные модификации двумерного электрофореза, что позволяет анализировать белковые комплексы различной сложности. Мы использовали метод с иммобилизованными градиентами рН (IPG) как подход, обладающий высокой воспроизводимостью [7]. Проанализирован состав рецепторного комплекса CD95 в интервале pI от 3 до 10, а также подобраны условия проведения двумерного электрофореза в области pI 6-11 с последующим анализом белков, ассоциированных с рецептором CD95. Наш анализ позволил найти различия в белковом составе комплекса CD95 DISC, выделенного из клеток двух типов.
экспериментальная часть
Реактивы и биопрепараты
В работе использовали следующие реактивы и материалы: 1,4-дитио-0,Ь-треитол (DTT), N,N,N' ,N'-тетраметилэтилендиамин (TEMED), мочевину, додецилсульфат натрия (SDS), акриламид, N,N'-метиленбисакриламид, белок-А-сефарозу фирмы «Serva»;
pi 10
pi ю
3 «Да
кДа
— 66 — Л6
— 30
б
р! Ю
3 кДа
г
р! 10
-U
О Охарактеризованные белки DISC
1, 2 - FADD, САР1 и САР2
4 - Прокаспаза-8 (САР4 = p55)
3, 5, 6 - Продукты расщепления прокаспазы-8
(САР3, САР5 = p26 и САР6 = p24)
7,8 - Каспаза-8 (p10, p18)
О Неохарактеризованные белки DISC
Рис. 3. Анализ CD95 DISC в клетках первого (SKW6.4) и второго (СЕМ) типа. К 5 х 107 клеток SKW6.4 добавили LZ-CD95L
(а) или оставили без стимуляции
(б). К 7 х 107 клеток СЕМ добавили LZ-CD95L
(в) или оставили без стимуляции
(г). Иммунопре-ципитаты CD95 анализировали
с помощью двумерного электрофореза в области pI от 3 до 10. Время экспозиции радиоавто-грамм - 4 недели. Представлен один из трех экспериментов. Положение CD95 отмечено стрелками. Положения основных белков комплекса CD95 указано номерами. Дифференциальные пятна показаны сплошной линией, отсутствие пятна - пунктиром.
персульфат аммония, хлорид аммония, бромфеноловый синий - фирмы «Merck».
В качестве радиоактивной метки применяли [35S]Met и [35S]Cys фирмы «Amersham».
В работе использовали линии В- и Т-лимфоцитов, SKW6.4 и СЕМ, соответственно, а также среды для культивирования клеток RPMI фирмы «Gibco». LZ-CD95L был приготовлен как описано ранее [8]. Моноклональные антитела к каспазе-8 С15 и С5 [9]; а также анти-APO-l [10] приготовлены в лаборатории согласно ранее описанному методу. Использовали поликлональные антитела к рецептору CD95 (С20) фирмы «Santa Cruz».
Мечение клеток [35S]
Для радиоактивного мечения 5 х 107 клеток SKW6.4 или 7 х 107 клеток СЕМ переносили в среду RPMI без мети-онина и цистеина. После инкубации в течение 1 ч при тем-
пературе 370С к клеткам добавляли [35S]Met и [35S]Сys, а затем культуры клеток растили в течение 24 ч до проведения эксперимента.
Иммунопреципитация рецептора CD95
К 5 х 107 клеток SKW6.4 или 7 х 107 клеток СЕМ добавляли лиганд LZ-СD95L (концентрация 10 мкг/мл), инкубировали в течение 10 мин при температуре 370С. Получение клеточных лизатов, иммунопреципитацию комплекса и вестерн-блотинг проводили как описано в [11].
Двумерный электрофорез
Для изоэлектрофокусирования образцов в первом направлении применяли готовые стрипы с нанесенными амфоли-тами длиной 18 см, с р1 от 6 до 11 («Amersham»).
Для изоэлектрофокусирования клеточных лизатов к 10 мкл лизатов добавляли 340 мкл буфера А (9 М мочеви-
а
в
pi 6
11 pi 6
pl
Изоэлектрическое фокусирование
Рис. 4. Оптимизация условий изоэлек-трофокусирования. Проведено изоэлек-трофокусирование клеточных лизатов, полученных из 107 клеток SKW6.4. Затем образцы наносили на 12% гель и проводили электрофорез по Лэммли. Белки окрашивали серебром. Изоэлек-трофокусирование проводили в буфере А (а, в) и буфере Б (б). Был применен следующий протокол для изоэлектро-фокусирования: (а, б) 12 ч - дегидратация, 1 ч - 500 В, 1 ч - 1000 В, 1 ч - 3000 В, 8000 В до достижения 60000 В/ч. (в) 12 ч - дегидратация, 1 ч - 100 В, 1 ч -150 В, 1 ч - 300 В, 1 ч - 400 В, 1 ч - 500 В, 1 ч - 1000 В, 1 ч - 3000 В, 8000 В до достижения 180000 В/ч.
б
а
в
ны, 2% CHAPS, 18 мМ DTT, 0.001% бромфенолового синего, 0.5% IPG-буфера фирмы «Amersham») или буфера Б (9 М мочевины, 2% NP-40, 18 мМ DTT, 0.001% бромфенолового синего, 0.5% IPG-буфера фирмы «Amersham»).
Для изоэлектрофокусирования иммунопреципитатов белки после иммунопреципитации элюировали с белок-А-сефарозы в течение 30 мин при комнатной температуре буфером А.
После изоэлектрофокусирования стрипы инкубировали в течение 20 мин в буфере: 50 мМ Трис-HCl, pH 8.8, 6 M мочевина, 30% глицерина, 65 мМ DTT, 0.001% бромфенолового синего. Затем повторно инкубировали в том же буфере в присутствии 2.5% йодацетамида. После этого стрипы фиксировали с помощью 0.5% агарозы на 12% SDS-полиакриламидном геле и проводили электрофорез во втором направлении.
После электрофореза гели анализировали с помощью радиоавтографии или вестерн-блотинга. В некоторых случаях гели окрашивали серебром, используя набор фирмы «Invitrogen».
результаты и обсуждение
Анализ комплекса CD95 DISC с помощью двумерного электрофореза в области pI от 3 до 10
Для проведения протеомных исследований в качестве клеток первого типа мы выбрали линию В-лимфоцитов SKW6.4, а в качестве клеток второго типа - линию Т-лимфоцитов СЕМ. Обе клеточные линии подробно охарактеризованы ранее и представляют классические примеры клеток первого и второго типа [4].
Для анализа CD95 DISC клетки SKW6.4 и СЕМ выращивали в среде, содержащей [35S]Met и [35S]Cys, в течение суток. Затем для инициации апоптоза культуры клеток обрабатывали лигандом - LZ-CD95L, который специфически связывается с рецептором CD95 и инициирует образование рецепторного комплекса. После этого проводили иммунопреципитацию комплекса CD95 DISC с помощью моноклональных антител анти-АРО-1. Моноклональные антитела анти-АРО-1 распознают внеклеточный домен рецептора CD95 и применяются для иммунопреципитации рецептора или комплекса CD95 DISC [10-12]. Имму-
нопреципитаты анализировали с помощью двумерного электрофореза.
Эффективность иммунопреципитации контролировали, проводя одномерный электрофорез с использованием одной десятой части образца, анализируемого методом двумерного электрофореза, с последующим вестерн-блотингом со специфическими моноклональными антителами против каспазы-8 (рис. 2). Этот анализ выявил присутствие в CD95 DISC как прокаспазы-8, так и продуктов ее протеолитиче-ского расщепления р43/р41, что свидетельствует о специфичности использованного метода.
Состав комплекса CD95 DISC после иммунопреципита-ции проанализировали с помощью двумерного электрофореза в области pI от 3 до 10 (рис. 3). На радиоавтограммах комплекса CD95 DISC из клеток как первого, так и второго типа выявлены пятна, соответствующие по pI и молекулярной массе основным белкам комплекса CD95 DISC, охарактеризованным ранее [5, 13]. На двумерных гелях обнаружены белки CD95, FADD в двух формах - CAP1 и CAP2 (нефосфорилированной и фосфорилированной), прокаспаза-8 (CAP4) и продукты ее расщепления - САР3, р26/р24, р18 и р10. В клетках как первого, так и второго типа выявлены новые, неохарактеризованные компоненты комплекса CD95 DISC (рис. 3). Интересно, что молекулярные массы и р! новых белков CD95 DISC были разными в клетках разного типа, что указывает на различия в составе комплекса CD95 DISC.
Анализ комплекса CD95 DISC с помощью двумерного электрофореза в области pI от 6 до 11
Поскольку разрешение метода в области выше pI 6 довольно низкое, нам удалось установить только часть белков, возможно, ассоциированных с CD95. Соответственно огромный интерес представляли белки комплекса CD95 DISC в области pI от 6 до 11.
Известно, что изоэлектрофокусирование в области pI 6-11 осложнено электроосмосом воды и миграцией DTT в сторону анода [14]. Все это значительно ухудшает качество "картины" двумерного электрофореза. Поэтому сначала мы попытались подобрать оптимальные условия изо-электрофокусирования. С этой целью приготовили лизаты клеток SKW6.4 и провели изоэлектрофокусирование, ис-
Рис. 5. Анализ CD95 DISC в клетках первого (SKW6.4) и второго (СЕМ) типа. К 5 х 107 клеток SKW6.4 добавили LZ-CD95L
(а) или оставили без стимуляции
(б). К 7 х 107 клеток СЕМ добавили LZ-CD95L
(в) или оставили без стимуляции (г). Иммунопреципи-таты CD95 анализировали с помощью двумерного электрофореза
в области pI от 6 до 11. Время экспозиции радио-автограмм - 4 недели. Представлен один из трех экспериментов. Дифференциальные пятна показаны сплошной линией, отсутствие пятна -пунктиром.
а р<
ЬС*л
и
АЬ.
--
о '-1 —
п " ■ *«
-
О
о* *
б
pt i
Изоэлектрическое фокусирование
г
О
i,t
1
Q
1Л
Изоэлектрическое фокусирование
в
пользуя различные протоколы и детергенты (CHAPS и NP-40) в буфере для первого направления (рис. 4). В качестве критерия качества результатов двумерного электрофореза мы рассматривали количество полученных пятен и их разрешение.
Разрешение было существенно лучше при использовании детергента CHAPS (рис. 4а) по сравнению с детергентом NP-40 (рис. 4б). Протокол изоэлектрофокусирова-ния, использованный в наших экспериментах (рис. 4а,б), включал всего четыре режима напряжения: 500, 1000, 3000 и 8000 В. Для того чтобы получить еще более высокое разрешение двумерного электрофореза мы попытались использовать восемь режимов напряжения (от 100 до 8000 В) и более продолжительное время изоэлектрофокусирования (рис. 4в). По-видимому, эти условия способствовали более эффективному вхождению белков в гель, поскольку разрешение при этом значительно улучшилось (рис. 4в). Таким образом, в дальнейшем мы использовали детергент CHAPS в буфере для первого направления и такие же условия изо-электрофокусирования, как на рис. 4в.
Для сравнительного анализа комплекса CD95 DISC в области pI выше 6 в качестве клеток первого типа мы выбрали клеточную линию В-лимфоцитов SKW6.4, а в качестве клеток второго типа - линию Т-лимфоцитов CEM. Клетки SKW6.4 и CEM выращивали в среде, содержащей [35S]Met и [35S]Cys, в течение суток. Затем для образования комплекса CD95 DISC культуры клеток обрабатывали ли-гандом LZ-CD95L, после чего комплекс CD95 DISC имму-нопреципитировали с помощью моноклональных антител анти-АРО-1, а затем анализировали методом двумерного электрофореза в оптимизированных условиях.
На радиоавтограммах обнаружен ряд белков, которые появляются в CD95 DISC клеток как первого (рис. 5а), так и второго типа (рис. 5в). Всем белкам, имеющим молекулярную массу более 30 кДа, присвоены номера от 1.1 до 1.7, а до 30 кДа - номера от 2.1 до 2.7 (рис. 5). Молекулярные массы и р! дополнительных белков CD95 DISC из клеток первого и второго типа различались, за исключением пятна 2.5, которое присутствовало в клетках обоих типов. Следовательно, белковый состав двух комплексов не одинаков.
45-
30-
14-
66 -
-
30-
14 -
Изоэлектрическое фокусирование
Рис. 6. Анализ двумерных электрофорезов с помощью вестерн-блотинга. CD95 DISC, иммунопреци-питированный из клеточной линии SKW6.4, анализировали методом двумерного электрофореза с помощью вестерн-блотинга со специфическими поликло-нальными антителами С20 против рецептора CD95 (а) и с моноклональными антителами С15 против каспазы-8 (б). На радио-автограмме (в) показано положение каспазы-8 и рецептора CD95.
б
а
в
Эффективность иммунопреципитации контролировали, как описано выше и на рис. 2. Также с помощью вестерн-блотинга нам удалось локализовать положение уже известных компонентов комплекса на двумерных гелях: CD95 (рис. 6а,б) и активной каспазы-8 (р10) (рис. 6б). Соотнесение р1 и молекулярной массы активной каспазы-8, выявляемой методом вестерн-блотинга, с пятнами на радиоавтограммах показало, что белок 2.5 соответствует активной каспазе-8 (рис. 6в). Таким образом, мы впервые подобрали условия проведения двумерного электрофореза в области р1 от 6 до 11 для анализа белков, ассоциированных с CD95.
заключение
Применение двумерного электрофореза позволило провести сравнительный анализ белкового состава CD95 DISC клеток первого и второго типа: SKW6.4 и СЕМ. Следует специально отметить, что различия в спектрах белков cD95 DISc из клеток первого и второго типа подтверждают гипотезу о существовании различных механизмов инициации апоптоза в этих клетках, определяющих более быструю смерть (апоптоз) клеток первого типа. В настоящий момент мы пытаемся с помощью масс-спектрометрии идентифицировать белки, обнаруженные в данной работе. •
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Krammer P.H. // Nature. 2000. V. 407. P. 789-795.
2. Lavrik I.N., Golks A., Krammer P.H. // J. Cell Science. 2005. V. 11. P. 265-267.
3. Peter M., Krammer P.H. // Cell Death and Diff. 2003. V. 10. P. 26-35.
4. Scaffidi C., Fulda S., Srinivasan A., et al. // EMBO J. 1998. V. 17. P. 1865-1687.
5. Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I., et al. // EMBO J. 1995. V. 14. P. 5579-5588.
6. O'Farrel P.H. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 4007-4021.
7. Gorg A., Postel W., Gunter S. // Electrophoresis. 1998. V. 9. P. 531-546.
8. Walczak H., Miller R.E., Ariail K., et al. // Nat. Medicine. 1999. V. 5. P. 157-163.
9. Scaffidi C., Medema J.P., Krammer P.H., Peter M.E. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 26953-26958.
10. Trauth B.C., Klas C., Peters A.M., et al. // Science. 1989. V. 245. P. 301-305.
11. Lavrik I.N., Golks A., Baumann S., Krammer P.H. // Blood. 2006. V. 108. P. 110-117.
12. Golks A., Brenner D., Fritsch C., Krammer P.H., Lavrik I.N.// J. Biol Chem. 2005. V. 280. P. 14507-14513.
13. Golks A., Brenner D., Schmitz I., et al. // Cell Death and Diff. 2005. V. 13. P. 489-498.
14. Gorg A. // Methods Mol. Biol. 1999. V. 112. P. 197-209.
