CC BY
62
УДК 577.24:616.151.
CD95-INDUCED APOPTOSIS AND MULTI RESISTANT PHENOTYPE OF THE HUMAN LYMPHOBLASTOID T-CELLS
D. Yu. Blokhin', A.A. Sokolovskaya'. A.D. Mikhailov2, J.E. Eriksson2 'N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS 2 Turku Center for Biotechnology, University of Turku, Finland
ABSTRACT
Apoptosis can be induced by a multitude of stimuli, including treatment with anticancer drugs, depletion of growth factors and hormones, heat shock, Y-irradiation. stimulation of death factors receptors such as TNF and CD95(APO-l/Fas)-ligand. It has been proposed that theCD95 signaling pathway perhaps plays a significant role in drug-induced apoptosis and that the absence or diminished expression of CD95 on the surface of tumor cells would be associated with resistance to cytotoxic drug treatment. We generated a model CD95-deficient cell clone (JA4) from the parental wild type cell line (Jurkat/wt) by serial treatment with apoptosis-inducing anti-CD95 monoclonal antibodies (mAb), clone IPO-4, class IgM. Comparative studies showed that JA4 acquired CD95-negative phenotype, but both lines equally expressed DR4. DR5 and TNFR-1 receptors. However, clone JA4 was highly resistant to induction of apoptosis by both agonistic anti-CD95 mAb and TRAIL. Surprisingly. JA4 was also highly resistant to induction of apoptosis by anti-cancer drugs (doxorubicin, etoposide. cis-DDP. cycloplatam). X-rays, UV-light, staurosporin. hydrogen peroxide, menadione, while all these treatments induce the apoptosis of parental Jurkat/wt cells in time- and dose-dependent manner. In addition, etoposide. TRAIL and agonisticanti-CD95 mAb induced caspase-3 activation in Jurkat/wt cells while all three stimuli failed to induce caspase-3 activation in JA4 cells. Western blot analysis showed that Bcl-XL and Bcl-2 were expressed in Jurkat/wt more than in JA4 cells, whereas heat shock proteins of HSP90 family expression level was elevated in JA4. Its resistance is base not only on the deficiency of CD95 expression, but it is mainly due to the defects of other molecular targets, which are involved in the execution phase of programmed cell death (apoptosis) as well. The model can reflect usual clinical situation when microevolution of cancer cells under pressure of the immune system yields highly malignant multiresistant tumors.
С095-ИНДУЦИР0ВАННЫЙ АПОПТОЗ И МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНЫЙ ФЕНОТИП Т-ЛИМФОБЛАСТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Д.Ю. Блохин1. А.А. Соколовская1, А.Д. Михайлов2, Й.Е. Эрикссон2 'ГУ Российский онкологический научный центр int. Н.Н.Блохина РАМН 2Центр биотехнологии Университета Турку, Финляндия
РЕЗЮМЕ
Программированную гибель клеток (апоптоз) индуцируют различные сигналы экзо- и эндогенной природы: факторы роста, гормоны, тепловой шок, радиация, внутриклеточные медиаторы трансдукции сигнала, а также белки суперсемейства TNF-подобных лигандов к рецепторам гибели клеток (TNFR-1, Fas. DR4. DR5 и др.). Рецепторно-лнгаидная система—важный компонент лекарственно-индуцированного апоптоза. и полихимиоре-зистентиость опухолевых клеток может быть связана с неполноценностью сигнальных путей программированной гибели. Исследовашм выполнены на клетках Т-лимфобластных линий человека J urkat и Н9. В условиях культивирования с апоптоз-шщуцируюшимн моноклональными антителами (МКА) к антигену Fas/APO- 1/CD95 (клон IPO-4) из родительской линии Jurkat дикого типа (Jurkat/wt) получен С095-дефицитный вариант (JA4). Клеточный клон J А4. в отличие от родительской линии, имеет СП95-негатнвный фенотип, при этом клетки обеих линий экспрессируют рецепторы гибели АРО-2 (DR4 и DR5) и TNFR-1. Однако клон JA4 оказался резистентным к воздействию как aiiTii-CD95 МКА (IPO-4), так и TRAIL, и TNFct. Клетки JA4 также резистентны к противоопухолевым иитостатикам разных классов (доксорубииин. этопозид. цисплатин. циклоплатам). Н,0„ рентгеновскому и УФ-облучению, ингибитору протеннкиназ — стауроспорину. тогда как все эти агенты в тех же условиях эксперимента эффективно индуцируют апоптоз клеток Jurkat/wt. Экспериментально показано, что стимуляция МКА анти-СЭ95, TRAIL или этопозидом активирует каспазу-3 в клетках Jurkat/wt, в то же время не удалось зарегистрировать активации каспазы-3 в клетках JA4 после воздействия тех же индукторов. Методом иммуно-блоттинга обнаружено снижение экспрессии в клетках JA4 антиапоптотических белков Вс1-2 и Bcl-XL. в то время как экспрессия белков теплового шока семейства HSP-90, напротив, повышена. Таким образом, благодаря
длительной стимуляции С095-реиепторов эффекторными анти-С095 МКА (ТРО-4) получена мультирезистент-ная линия 1А4. Причина резистеитности к противоопухолевым агентам клеток JA4 связана не только с отсутствием Раз-рецепторов апоптоза. но и с дефектами других молекулярных мишеней, вовлеченных в каскады трансдук-ции сигнала или выполнения терминальных стадий апоптоза. Данная модель может отражать реальную клиническую ситуацию, когда под давлением иммунной системы селекция клеток и/или индукция их неспособности к апоптозу приводит к появлению мультирезистентных злокачественных опухолей. Понимание природы сигнальных путей в лекарственно-индуцированном апоптозе в перспективе позволит управлять этим процессом для повышения эффективности лекарственных методов лечения злокачественных опухолей.
Введение
Апоптоз является процессом активной, энергозависимой самоликвидации клеток в ответ па большое разнообразие внеклеточных (цнтокины. лиганды смерти, гранзимы и др.) или внутриклеточных (генотоксический стресс, субстратное голодание, и др.) факторов. Первичным акцептором сигнала апоптоза выступают трансмембранные рецепторы экстрацеллюлярных лигандов смерти, а также ряд внутриклеточных сенсоров. инициирующих активацию эффекторных механизмов от внутриклеточных стимулов.
Тpai 1смембранные рецепторы сигнала апоптоза формируют суперсемейство TNF-подобпых рецепторов (TNFRSF — Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily). которое к настоящему времени насчитывает около двух десятков членов: TNFR-1, TNFR-2, LTA-R. LTB-R. АРО-1. DR4. DR5. АРО-3 и др. До настоящего времени многие из них упоминаются в литературе под своими исторически сложившимися названиями. что создает определенный информационный хаос, однако попытки систематизировать рецепторы этогосу-персемейства пока безуспешны. Так. одни из наиболее изученных рецепторов апоптоза открыт одновременно двумя независимыми научными коллективами и назван ими АРО-1 и Fas соответственно [25; 28]. Позже, когда выяснилось, что в обоих случаях речь идет об одном и том же рецепторе, он был обозначен в рамках Кластера дифферениировочпых (CD) антигенов лейкоцитов человека индексом CD95, хотя до настоящего времени используются как оба исторически сложившиеся, так и объединенное обозначение CD95/Fas/APO-1.
Структура, механизмы активации и передачи сигнала всех TNFRSF весьма сходны, так же как сходны между собой по структуре природные лиганды этих рецепторов. В рамках настоящей работы интерес представляют CD95/Fas/APO-l: рецепторы TRAIL (INF-Ilelated Apoptosis /ndusing Ligand — APO-2L) DR4 и DR5: рецептор фактора некроза опухолей-альфа и лимфотоксина-альфа TNFR-1.
CD95 с молекулярной массой (ММ) 45 кДа содержит три экстрацеллюлярных рецепторных домена, трансмембранный и цитоплазматический домены, последний называют «доменом смерти» (DD — Death Domain). Наличие DD весьма существенно, поскольку структурно он имеет 6 альфа-спиральных участков, способных при определенных условиях образовывать гомофильные ассоииаты с другими DD-содержаши-ми белками, необходимые для трансдукции специфического сигнала. Делеция «домена смерти» или его укорочение в результате альтернативного сплайсинга мРНК, так же как критическая мутация кодирующего
DD гена, приводят к функциональной инактивации рецептора, а также к образованию так называемых рецепторов-приманок (Decoy Receptors) — как. например, DcRl, DcR2 [8].
CD95 в рамках суперсемейства отнесен к TNFRSF6. Его природный лиганд (CD95L. TN FSF6) представляет собой мембраноассоциированный белок, пмеюший в качестве специфического участка связывания гомотри-мерный сайт. Экспрессия CD95L на поверхности клеток не является конститутивной: экстериализация молекул .лиганда осуществляется для выполнения киллерных фун-кций и/или для аугокринной индукции апоптоза. Мемб-раносвязашшн лиганд достаточно быстро элиминируется с клеточной поверхности матрикснымн металлопро-теиназами. значительно теряя активность в растворимой форме. Возможно, потеря активности связана с утратой гомотримерной структуры, так как растворимый рекомбинантный лиганд (имеющий один сайт связывашш с рецептором). несущий так называемый LZ-мотив (Leucin-Zipper motif), способен к олигомеризации и обладает высокой активностью [27].
Взаимодействуя с рецептором. CD95L вызывает его тримеризаиию (за счет одновременного взаимодействия гомотримерного участка лиганда с экстрацеллюлярны-ми доменами трех близко расположенных молекул CD95). приводящую к кластеризации внутриклеточных доменов рецептора смерти. В тримеризованном состоянии домены смерти рекрутируют находящийся в цитоплазме адаптер FADD (Fas-Associated Death Domain protein) — белок, имеющий на одном конце молекулы домен смерти DD. а на другом —домен эффектора смерти DED (Death Effector Domain). Первый служит для связывания FADD с цитоплазматическим DD доменом CD95, а второй—для специфического связывания с аналогичным доменом цитозольного проэнзима прокаспа-зы-8. Так формируется надмолекулярный ассоциат состава CD95/FADD/ripoKacria3a-8. именуемый апоптоз-ный шаперон или «Сигнальный комплекс, индуцирующий смерть» (DISC Death InducingSignalingComplex). В составе этого комплекса прокаспаза-8 способна к аутопроцессированшо. что приводит к отщеплению ее N-концевого регуляторного участка и разрезанию оставшейся части молекулы на 2 субъедшшцы с ММ 20 и 10 кДа соответственно. Они образуют друг с другом гетеродимер с одним катал нтическнм центром, а 2 гетеродимера соещшяются в тетрамерную конструкцию с двумя независимыми активными центрами — активную кас-пазу-8, освобождающуюся в цитозоль.
Каспазы — семейство цистеиновых протеииаз. расщепляющих субстрат в cairrax. следующих за остатками аспарагиновой кислоты (Cystein Aspartat specific
proteinase). Принято выделять инициирующие каспазы (каспазы-2; -8: -9: -10). участвующие втрансдукции сигнала апоптоза и трансактивируюшие другие компоненты сигнальных каскадов, в частности, эффекторные («казнящие») каспазы (-3; -6; -7), расщепляющие «ключевые су бстраты» (субстрат каспазы-3 — ингибитор каспазо-активируемой ДНКазы 1CAD. а также фермент поли-/АДФ-рибозо/полимераза PARP; субстрат каспа-зы-6 — белки фиброзной оболочки ядерного матрикса
— ламины). Активация инициирующими каспазами эф-фекториых каспаз означает финальную, быструю и необратимую. стадию апоптоза с присущей ему межнукле-осомной фрагментацией ДНК. деградацией хроматина, ядерной оболочки и др.
Похожий механизм индукции образования комплекса DISC установлен для других рецепторов смерти: TNFR-1. DR4 и DR5. Отличие от CD95 заключается в том. что DD этих трех рецепторов рекрутируют FADD через промежуточный адапторный белок TRADD (TNF-Receptor Associated double DD), несущий два DD: одним он связывается с DD активированного рецептора. а вторым — с DD адаптера FADD [20].
Замечательно, что активация каспаз является не единственным следствием сигналов, запускаемых рецепторами смерти. Так. помимо адаптера FADD. с DD активированного рецептора могут связываться другие DD-содержашне белки: ядерный DAXX—с CD95: цн-тозольиый — RIP (Receptor Interacting Protein) — с TNFR-1. DR4n DR5. Активированный DAXX способен. как полагают, трансактивировать киназу ASK-1 (ApoptosisStimulating Kinase — 1) и JNK1/2 (c-Jun N-terminal Kinases 1/2) [12; 17]. Значение этого сигнального пути не вполне понятно; результаты, полученные на различных объектах, противоречивы: от антиапоп-тотического эффекта JNK до апоптотического FADD-пезавнеимого сигнала. ASK1 может рекрутироваться в сигнальном пути, инициируемом рецептором TNFR-1. но в этом случае роль адаптера выполняет не DAXX. а ROS (Reactive Oxygen Species). Активация RIPTpancaK-TiiBiipyeTTRAF (TNF Receptor Associated Factor). который. в свою очередь, активирует транскрипционные факторы антиаполтотических (ТАР — Inhibitor of Apoptosis. Bcl-XL) и провоспалительных генов.
Таким образом, инициирующим событием при индукции сигнала С095-опосрсдованного апоптоза природным лигандом является пространственная кластеризация (минимально — трнмеризация) рецептора.
Подобны!! механизм активации присущ всем представителям суперсемейства TNF-подобных рецепторов (за исключением относящегося к суперсемейству рецептора фактора роста нервов NGFR. или TNFRSFI6). Видимо, логика такого механизма индукции сигнала клеточной гибели направлена на предотвращение фатальных последствий возможной спонтанной агрегации молекул TN FRSF при их хаотическом латеральном дрей-(|»е в фосфолнпидном бислое клеточной мембраны: вероятность спонтанной тримеризации достаточно мала. Дтя TNFR-1 обнаружен дополнительный механизм зашиты от случайной олигомеризации: DD-содержаший цитозольный белок SODD (Silencer QfDD) связывается с DD мономеров TNFR-1. препятствуя их агрегации: после специфического взаимодействия рецептора с лигандом
SODD диссоциирует из состава комплекса [14].
Имитировать действие природного лиганда на рецептор удается с помощью моноклональных антител (МКА) к его экстрацеллюлярному домену. Поскольку МКА изотипов IgG и IgA являются бивалетиыми мономерами, агонистическими (эффекторными. индуцирующими апоптоз) свойствами могут обладать МКА. имеющие более одного эпитопа связываш!я на экстрацеллю-лярном домене рецептора (перекрестное сшивание — cross-linking), либо способные к спорадическому гидрофобному взаимодействию друг с другом своими Fc-фрагментами. либо искусственно кластеризуемые, например. вторичными антителами, стреп гавидином или иммобилизацией па микроносителях. МКА изотипа IgM, являясь декавалентным пентамером, эффективно кластеризуют рецептор, индуцируя сигнал апоптоза.
Имеется арсенал искусствешгых стимуляторов рецепторов смерти, имитирующих действие природных лигандов. Это — агонистические МКА к рецептору CD95, упоминавшийся выше растворимый рекомбинантный LZ-FasL. рекомбинантный мономер TRAIL с FLAG-эпитопом и др. Использование этих инструментов позволяет исследовать тонкие механизмы клеточного сигналинга. межклеточной кооперашш и соподч!шен-ности. С другой стороны, являясь летальными индукторами, они ставят рецептор-познтивные клетки перед альтернативным выбором между жизнью и смертью, т е. играют роль агента селективного давления на клеточную популяцию. Последствия такой селекции даже при использовании одного объекта 'зависят от множества неконтролируемых параметров клеточного контекста и не могул быть предсказаны заранее. Так, использу я культивируемую Т-лимфобластную линию клеток человека Jurkat в качестве исходного биологического материала, сотрудпики лаборатории S.Nagata получили сублинию клеток JB-6. сохранившую С095-позитивный фенотип, но дефицитную по экспрессии каспазы-8. в результате— резистентную к С095-опосредованному, но способную к лекарственно-индуцироваиному апоптозу [15]. В лаборатории P.Krammer из той же линии получен трансформант. имеющий С095-негативный фенотип, но сохранивший чувствительность к противоопухолевым ци-тостатикам[9]. В лаборатории фармакоцнтокипетики из родительской линии Jurkat в результате С095-нсгатив-ной селекции получен клон Jurkat/A4 (далее JA4), имеющий С095-негативный фенотип и резистеигный не только к С095-индуцируемому апоптозу, но к действию противоопухолевых цитостатиков разных классов. TRAIL. TNFa. стауроспорину, перекиси водорода, менадиону. рентгеновскому и УФ-С-облучетпо [23].
В настоящей статье кратко изложены методика получения клона JA4. сравнительное исследование свойств клеток J А4 и родительской линии Jurkat, показаны молекулярно-биологические особенности клеток JA4.
Материалы и методы
Культура клеток. В исследовании использованы суспензионные культуры Т-лимфобластных клеток человека линий Jurkat и Н9. Клетки культивировали в среде RPMI-1640. содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка. 100 мкг/мл гента-
мишша. 2 мМ L-глутамина. 10 мМ HEPES (pH 7.3), при 37' С в атмосфере. 5% СО, в воздухе. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пассированием культуры через каждые 2-3 сут.
Моноклональные антитела и реагенты. Агонистические (эффекторные) МКА aHTH-CD95 (изотип IgM, клоп IPO-4) любезно предоставлены С.П.Сидорепко (11 нсти-тут экспериментальной патологии, онколопш и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины. Киев). Использованы также неагоігастические МКА анти-CD95-F1TC (IgGl. клон DX2. BD PharMingen. США). aimi-DR4-FITC. aHTH-DR5-FITC. анти-TNFR-l-FITC (BD PharMingen. США). Специфическими лигандами TNF-подобных рецепторов служили: рекомбшшнтный TRAIL (Alexis, Швейцария), несущий FLAG-эпнтоп для связывания вторичными антителами aimi-FLAG-M2 (Sigma, США): TNFa (Alexis. Швейцария). В качестве лекарст венного индуктора апоптоза использовали противоопухолевый химиотерапевтический препарат этопо-зид(Alexis. Швейцария: Nippon Kavaku Сотр., Япония).
Определение апоптотических клеток по окрашиванию ДН К пропидий йодидом (PI). Субпопуляцию гипо-днплоидных клеток определяли методом проточной ци-тофлуориметрии па цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson. США), предварительно окрашивая ядра фе-нантридиновым флуорофором PI по методу Nicoletti 1., для чего клетки (2.5 х 105) суспендировали в охлажденном 70 %-иом этаноле, осаждали центрифугированием (7 мин, 200 g). ресуспенлировали в 1 мл раствора, содержащего 5 мкг/мл Р1. 0.1% натрия цитрат, 0,1% Тритон Х-100. и инкубировали 15 мин в темноте [18].
Выявление апоптотических клеток двойным прижизненным окрашиванием А ннексином V-FITC/PI Клетки суспендировали в «связывающем буфере» (140 тМ NaCl. 2.5 тМ СаС1;, 10 тМ HEPES/NaOH) в концентрации 1 х 10s клеток в 100 мкл и окрашивали добавлением 10 мкл PI (5 мкг/мл) и 5 мкл (100 мкг/0,5мл) Аинексина V-FITC, инкубировали 15 мин при комнатной т емпературе в темноте. Для анализа методом проточной цитофлуориметрии к суспензии клеток добавляли 400 мкл «связывающего буфера».
Проточная цитофлуориметрия {FA С S-анализ). Анализ клеточных суспензий методом проточной цитофлуориметрии выполняли на цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с возбуждением флюоресценции аргоновым лазером (488 нм) и регистрацией эмиссии зеленого диапазона по каналу FL1 (525 нм), красного диапазона — по каналу FL2 (585 нм). Прямое и боковое светорассеивание регистрировали по каналам FSC и SSC соответственно.
Иммуномагнитный препарат на основе МКА aimiu-CD95 для индукции и изоляции сигнального комплекса DISC. Неагонистические МКА aHTU-CD95 (клон ICO-160, изотип IgG2a. НПЦ «МедБиоСпектр». Россия) иммобилизовали на поверхности (|>ерроснликатных микрочастиц, активированных ТіС14 [1:2]. Клетки линий Н-9 и Jurkat/wt инкубировали с нммуномагнитным препаратом в полной питательной среде при комнатной температуре в течение 20 мин, пос іє чего клетки лнзировали добавлением Protein extraction reagent (Pierce, США). Иммуно-маппггиый препарат собирали на магнитный стержень, дважды промывали и переносили в «буфер образца».
Иммуноблоттинг. Тотальный клеточный лизат получали лизисом 1 х 10* клеток в «буфере образца» с 2% додецилсульфата натрия и 100 мМ дитиотреитола по Laemmli U. Аналогично лизировали комплексы DISC, сорбированные на поверхности иммуномагнитного препарата. Электрофорез вели в 10*% ПААТ. Белки переносили из геля на PVDF-мембрану (Amersham. Pharmacia Biotech. Англия) поперечным электрофорезом, регашки инкубировали с МКА к Bcl-2 (Sigma. США). Bcl-XL. Bid (Santa Cruz Biotechnology, США), p53 (Calbiochem. Германия). p44/42 МАРК (New England. Biolab, США). CD95. FADD(BD PharMingene. США). HSP90. HSC70 и белкам Ла.мины В (Cell Signaling. США), каспазе-8 (любезно предоставлены Р К rammer. Гермаш(я). Положение белковых зон выявляли хемилюминесцентным методом с использованием ECL-system (Amersham. Pharmacia Biotech, Англия).
Определение активации каспазы-3. Дня определения активации каспазы-3 1 х 10* клеток обрабатывали в соответствии с инструкцией к набору Apoptosis Kit-1 (BD PharMingen, США) и инкубировали с РЕ-мечен-нымн МКА к активной каспазе-3 из состава набора. Анализ проводили методом проточной иитофлуори-метрин. Общую активность каспазы-3 в клеточных экстрактах оценивали методом флюоресценции с временным разрешением (DELFIA) с использованием набора Caspase-3 Wallak Kit (Wallak. Финляндия).
Флюоресцентная и световая микроскопия. Светлопольную микроскопию фиксированных мазков клеточных суспензий, окрашенных гематоксилином и эозином. а также прижизненную флюоресцентную и фазо-во-контрастную микроскопию клеток, «окрашенных» агонистическими М КА анти-СС)95 (клон 1РО-4)сфлю-оресцентпой меткой цианинового красителя СуЗ (Amersham. Pharmacia Biotech. Англия), выполняли с использованием люминесцентного микроскопа Axioscope-20 и цифровой системы регистрации и анализа изображений (Carl Zeiss Jena. Германия).
Результаты и обсуждение
Взаимодействие флюоресцентно меченных агонистических МКА IPO-4cCD95‘ клетками достаточно быстро вызывает агрегацию рецепторов на клеточной поверхности (рис. 1. А), что можно видеть по образова-ншотак называемых пегчей (пятен). латерально перемещающихся к одному из полюсов клетки (рис. 1. В; С) с образованием кэппинга (от англ. cap — шапка). Кэппинг рецептора по времени предшествует характерному для начата терминатыюй статии апоптоза процессу блеббин-га (англ. bleb—волдырь)—сокращению мембраносвязанных элементов цнтоскелета с формированием своеобразных вздутий клеточной поверхности, напоминающих псевдоподш! амебы (рис. 1. D). Параллельно с блеб-бингом наблюдается элиминация метки с клеточной поверхности. что. видимо, является результатом шеддннга (слущнвания) антигена, а неего интернатизашш.
Включение С 095-индуциро ванного ферментативного каскада сопровождается экстернализацией фос-фатиднлеерина на внешнюю поверхность клеточной мембраны, активацией эффекторных каспаз и прогрессирующей деградацией ДНК (рис. 2). Таким образом, применяя пршшип эскапацин концентрации МКА в сре-
Рис. 1. Культура опухолевых клеток меланомы кожи, полученная с помпшыо:
А - механической диссоциации медимашиной:
Б - диссоциации коллагенами:
В - диссоциации трипсином.
Окрашивание акридиновым оранжевым и бромистым >тилисм. Люминесцентный микроскоп Отрезок шкалы равен 50 мкм
Рис. 2. Стромальные элементы в культуре клеток меланомы, полученных с помощью механической диссоциации.
Инвертированный микроскоп, отрезок шкалы равен 50 мкм
Ч’3<
Рис. 3. Прижизненные изображения полученных культур опухолевых клеток меланомы кожи:
А - культура опухолевых клеток больного К.. 21 г. (адгезионный тип роста);
Б - культура опухолевых клеток больной А., 48 л. (адгезионный тип роста);
В - культура опухолевых клеток больной Ф.. 23 г. (суспензионный тип роста);
Г - культура опухолевых клеток больного П.. 60 л. (суспензионный тип роста).
Отрезок шкалы равен 50 мкм
Рис. ?. Культура клеток меланомы кожи больной А., 48 л., трансфеиированная геном ЕСКР. Третий день после трансфекции:
A. Б - использование метода электропорации;
B, Г - использование системы липосом ишСесПп-21;
Д. Е - использование системы липосом ишГесип-56;
А. В, Д- световой микроскоп. 100;
Б. Г, Е - люминесцентный микроскоп
I
* ' ;1г и‘ .
ШЙня.'с • •
Рис. 6. Культу ра клеток меланомы кожи больного Г.. 23 т.. трансфеиированных геном р-тала кюзидазы:
А - гистохимическая реакция с образованием нерастворимого субстрата при использовании липосомнои системы ишГесПп-21. Б - гистохимическая реакция с образованием нерастворимого субстрата при использовании лииосомпой системы Гп|Гесип-56. Трети день после трансфекции. Отрезок шкалы равен 100 мкм
£ Рис. 7. Иммуноблor-аналнз экспрессии белка Tag 7
v ^ трансфецированнымн опухолевыми ^ О клетками больных меланомой кожи:
детекция oeJiKaTag 7 производилась при помощи моноклональных антител к синтетическому эпигону F.FRH (Novartis, Швейцария).
^ Для анализа использовались лизаты опухолевых клеток.
96.7 kDa —— гее mTag 7 - рекомбинантный мышиный белок Tag 7;
7l,g kDa ---- Mel Р - лизат опухолевых клеток больного П.;
45.4 kDu — Mel II - лизат опухолевых клеток больного Ил.;
28.6 kDa ---- Mel Р< hTag 7 - лизат опухолевых клеток больного П..
фансфецированных геном tag 7;
19 7 kDa ---- Mel И/ hTag 7 - лизат опухолевых клеток больного И..
трансфепнрованных геном tag7
14 s kDa ----------
Рисунки к статье “Характеристика методов регистрации апоптоза” (стр.53-60)
Рис. 4. Флуоресцентная микроскопия клеток линии .)игка( после обработки Этоиозидом (10 мкг/мл, 24 ч) и окрашенных Аннексином \-FlTC в сочетании с РІ:
А - интактная (живая) клетка и ранняя апоптотическая клетка;
В - апоптотическая клетка с зеленой флуоресценцией на поверхности мембраны клеток и окрашенным ядром:
С - образование апоптотических телец;
О - некротическая клетка с красной флуоресценцией ялра и зеленой флуоресценцией на мембране клеток;
А-'600;
В, С. D - 1500
<
.% * в * *'
Рис. 6. Анализ апоптоза клеток костного мозга на грепанбиоптате больного МДС. выявляемого с помощью метода ТиХЕЬ в сочетании Ноес1Ы 33342:
А - флуоресценция ДНК-содержащнх фрагментов клеточных ядер, окрашенных флуорохромом НоесЬя 33342. 400;
В - зеленая флуоресценция < Р1 ТС ) тех же фрагментов с наличием шггевых разрывов ДИК (окрашивание ТЦХЕ1-). 400
Рис. 7. Анализ апоптоза клеток костного мозга на зрепанбиоптатах:
А - больного ОНЛЛ;
В - больного РА. выявляемого методом ТЦМЕГ. с псроксидазным окраитванием. 400
V:) /ГЧ V Л А _ А , , и іГ":4 ‘ X. • V. '-..і в
л V • } <3* С -О Л л ! Б
..у,.'.-: ' ", л «, ж Ш
10‘
4
•• Ч ■ - ТЛІІ'-І-'-
-*•
10° )0' 10* 101 10‘
В
Рис 1. Сочетанная флюоресцентная и 1Ж -микроскопии клеток 119 после связывания с клеточной поверхностью аити-С095 МКА ІРО-1/СуЗ:
А — через 0 мин;
Б — через 2 мин;
С —черезЮ мин;
О — через 30 мни.
Аппаратное увеличение 1250*
де культивирования антнген-позитивиых клеточных линии, можно ожидать деплешш С095* субпопуляции и приобретения линией С095-негативного фенотипа.
Суспензионную культуру линии Т-лимфобластных клеток человека Лигка^ умеренно экспрессирующих С095-рецептор, в питательной среде КРМ1-1640, содер-жашей дополнительно 10 мМ НЕРЕБ. Ь-глутамии, гента-миш1Н и 10% эмбриональной сыворотки теленка, выращивали в 24-луночном культуральном планшете (105 клеток в 1 мл) в атмосфере 5% СО, в воздухе при 37°С. Через 12 ч культивирования в лунки вносили \1КА 1РО-4доих дробно понижающейся конечной концентрации: 1000; 500; 250:125; 63; 31; 16; 8 и 4 нг/мл соответственно. Через 24 ч инкубации с \1КА в лунках Л1 и А2 (1000 и 500 нг/мл МКА) практически все клетки погибли или находились в состояшш развивающегося апоптоза. в лу нках АЗ и А4 (250 и 125 нг/мл МКА) сохранилась популяция выживших клеток (30 и 50% соответственно), в остальных лунках количество погибших и погибающих клеток снижалось пропорционально по1шжетппо концентрашш МКА. Клетки из лунок АЗ н А4 былн переведены в свежую питательную среду без МКА для восстановления устойчивого роста. В течение 20 дней культивирования рост клеток из лунки А4 восстановился, и в дальнеГццей работе использовалась именно эта культура (далее — .1А4). Культуру .1А4 вновь инкубировали 24 ч в среде с МКА 1РО-4. повысив их концентрацию (250 нг/мл); далее—3 недели в среде без антитеч. Третий и четверт ый циклы селекции выполнены аналогично, но концентрация МКА в среде составляла 500 нг/мл [3].
Рис 2. FACS-aHa.nu популяций интактных (слева) и стимулированных в течение 24 ч МКА анти-С095 ІРО-4 (справа) клеток Литка^И:
А — двойное прижизненное окрашивание Аннексином У-НТТС (абсцисса) и РІ (ордината);
В — гистограммы распределения клеток по флюоресценции после окрашивания нх РЕ-МКА к активной каспазе-3;
С — гистограмма распределения клеток по содержанию ДНК после окрашивания ее Р1. Клетки в состоянии апоптоза отмечены маркером М-1
Результатом проведенной селекции явился клон клеток ЛА4, морфологически (рис. 3) и иммунофенотипически (табл. 1) сходный с клетками родительской лнниии .Кігкаї и обладающий стабильным ростом в суспензионной культуре. По показателям прямого и бокового светорассеивания (анализ популяции методом проточной цитометрии) культура М4 мало отличается (рис. 4. А) от родительской линии «дикого типа» (далее по тексту — Лигка1У«ч), менее требовательна к условиям культнвироваїшя (уровень спонтанного апоптоза клеток і А4 не превышает 5%, в то время как в тех же условиях 15-20% клеток «дикого типа» подвержены спонтанной табели) (рис. 4. В).
Неожиданным, но стабильно воспроизводящимся свойством клеточной поверхности Л А4 явился повышенный (по сравнешпо с клетками -ІигкаїЛуО уровень фонового связывания интактными клетками Аннексина V-Р1ТС—характерный для апоптоза флиппинг(от Пір —
В
Рис 3. Морфология иитактных клеток:
А — .Іигкаї/»!:
В — М4.
Окраска гематоксилином и эозином, аппаратное увеличение 1250'
щелчок) фосфатидилсерина (рис. 5. А). Поскольку никаких других признаков клеточной гибели иитактных клеток 1\4 не наблюдалось, экстернализация фосфатидил-серина на внешний листок липидного бислоя клеточной мембраны, видимо, является следствием каких-то иных, не связанных с аиоптозом. внутриклеточных процессов.
Как и предполагалось, отсутствие экспрессии на поверхности клеток М4 рецептора С095 определяет их резистентность к МКА анти-С095-индуцированно-му апоптозу (рис. 5, В), однако их перекрестная резистентность к ТЯАІ[.-индуцированному апоптозу (рис.
5. С) и действию ТКТа (данные не представлены) не связана с дефицитом соответствующих рецепторов.
Таблица 1
Пммунофеногип клеточных популяций Лигкаї/иГ и ЛА4. выполненный методом РАСЯ-анализа
Антиген Антигенпозитивные клетки, %
■Іитка^чі .ІА4
СЭЗ 70-99 70-98
СБ4 30-50 25-45
С05 60-85 50-94
С07 40-90 35-90
С08 2-7 1-5
СЭ25 1-3 1-2
<Л)71 90-99 80-90
СР95 40-80 1-6
ОЯ4' + +
ОЯ5* + +
ТОТЯ-Г + +
" РАСБ-анализ данных антигенов не выявил достоверного разрешения пиков специфической флюоресценции и отрицательного контроля с изотопическими МКА, в связи с чем заключение о наличии в популяции антиген-позитивных клеток сделано по смещению модуля флюоресценции (без определения % рсцептор-позитивных клеток).
Ранее [3] при описании свойств полученных нами клеток ЛА4 (в предыдущих публикациях мы употребляли терміні «сублиния Лигкаі/А4». поскольку не могли рассчитывать на стабильность и воспроизводимость приобретенных клеточной популяцией фенотипических свойств, однако дтительньш срок существования полученной культуры—более 2 лет культивирования, более 200 пассажей, более 600 клеточных генераций — является достаточным основанием говорить о генетически детерминированном фенотипе клона или линии і А4) был
От 7718
СУ 2154 і
[Б5-162) 300
0° 10' 10* 10і 10’
От 74 79 СУ 25 26
(85-1621119 (5X1%)
|________МІ^ ^
О» 10' 10* 101 10*
Рис 4. Анализ прямого (абсцисса) и бокового (ордината) светорасссивання популяциями иитактных клеток:
А — .ІигкаїЛм (слева) н ЇА4 (справа):
В — гистограмма распределения клеток тех же популяции по содержанию ДНК.
Доля клеток в спонтанном апоптозе («гиподиплондная» субпо-пуляция) отмечена маркером М1
іЩ і 1
*0 /
«мтіш ЗР) rі gyaneto * 14)
Pw зим!»? З (3| v* РтымШ л (Г)
щ
.дУр"
Рис 5. Двойное прижизненное окрашивание Аннексииом V-FITC (абсцисса) н PI (ордината):
А — интахтных:
В — стимулированных в течение 24 ч МКА aHTii-CD95 IPO-4 или
С — TRAIL культур клеток JurkaiAn (слева) и JA4 (справа)
рых активируется при инкубации как с МКА IPO-4, так и при индукции TRAIL, оба воздействия не приводили к активации эффекторной каспазы в клетках JA4 (рис.
6. А: 7; табл. 2). Аналогичный эффект наблюдается при использовании в качестве индуктора апогттоза этопози-да (см. рис. 6. В: 7).
Известно, что С095-индуцированный каспазный каскад, приводящий к активации эффекторов апоптоза, развивается в различных клетках по одному из двух, как минимум, сценариев: в клетках I типа (к ним относятся клетки В-клеточной линии SK W6 и Т-клеточной лимфо-мы Н9) активированная в составе комплекса DISC кас-паза-8 непосредственно трансактивирует «киллерные» каспазы-3; -6; -7; в клетках же II типа (Jurkat. СЕМ) активности каспазы-8 недостаточно для трансактивации эффекторов, в связи с чем действует механизм мультипликации сигнала путем трансактивации каспазой-8 гтро-апоптотического фактора семейства Вс1-2 белка Bid, который в активном состоянии транслоцируется в мито-хондріш и стиму лирует выход из трансмембранного пространства последних в цитозоль цитохрома С [10; 19]. Цитохром С в цитоплазме связывается с апоптотичес-ким фактором Apaf-І, формируя апоптосому — матрицу для активного процесашга каспазы-9. Регуляторным противовесом на уровне освобождения в цитозоль цитохрома С служат антиапоптотическне факторы того же семейства: белки Вс1-2 и Bcl-XL способны блокировать поры митохондриальной мембраны, через которые происходит выход в цитоплазму цитохрома С. и, кроме того, конкурентно ингибируя на молекуле Apaf-1 сайты связывания с цитохромом С. они осуществляют даун-регуляцию сигнала на стадии образования апоптосом [11]. Взаимодействуя с апоптосомой. аутоактивируется про-
Сип W 10 CV 15Д1
Pi 6-1023] «&43 («й • %)
продемонстрирован феномен их резистентности к противоопухолевым препаратам разных классов и механизмов действия: адриамишшу. этопозиду', цисплатииу и иик-лоплатаму [3]. Позднее список юнотоксических агентов, к действию которых в значительной мере резистентны клетки.) А4. пополнился рентгеновским излучением, жестким УФ-светом (254 нм —диапазон УФ-С); клон М4 устойчив также к оксидативному стрессу (действию перекиси водорода, менадиона), умеренно чувствителен (по сравнению с высокочувствительной линией родительских клеток) к неспецифическому ингибитору протеинки-наз стауроспорину. причем при воздействии последнего клетки Л А4 погибают преимущественно с проявлением некротического морфотипа [5:22; 23].
В настоящем исследовании мы использовали 2 независимых методических подхода для детекции активной формы каспазы-3 в клетках обеих линий— проточный шггофлуорнметрнческий анализ и прямое измерение активности каспазы-3 в клеточных экстрактах. Результаты. полученные этими методами, совпали: в отличие от клеток родительской линии, каспаза-3 в кото-
195 О О •*)
Рис. 6. Гистограмма распределения клеток JurkatAvt (слева) и JA4 (справа) но флюоресценции после окрашивания их РЕ-МКА к активной каспазе-3 ннтактных (контурная линия) и стимулированных к апоптозу (сплошная заливка)24 ч инкубацией:
А — с МКА анти-СГ)95 ГРО-4 или В — с этопозилом
Caspase-3 (fluorometry)
I
і контроль
ЯН»
-j s Этопозид 5 ug/ml
150000 j-
m TRAIL+M2
a anti-CD95 (200 ng/ml) Jurkat/wt J/A4
Piic. 7. Тотальная активность каспазы-3 в экстрактах Hi иитактных н стимулированных к апоптозу клеток Jurkat/wt (левая группа) и JA4 (правая группа), определенная метолом флюоресценции с временным разрешением (DELFIA)
каспаза-9, субстратами для которой становятся эффек-торные прокаспазы-3: -6; -7 [16].
Таким образом, в клетках II типа, к которым относят клетки линии Jurkat, в реализации механизма С095-опосредованного апоптоза задействован митохондриальный путь передачи сигнала, конститутивная блокировка которого может предопределить формирование фенотипа мультирезистентности к апоптоз-ицдуцируюшим стимулам.
Действительно, используя С095-опосредоваиную индукцию апоптоза клеток Т-лнмфобластных линий Jurkat/wt и Н9 иммобилизованными на магнитоуправляемых микроносителях МКА к аитигеиу CD95 с послед)тощей иммуномагнитной изоляцией сигпального комплекса DISC и анализом его компонентов [1:2], мы показали существенную количественную разницу в формировании комплекса DISC клетками I (Н9) и II (Jurkat/wt) типов (рис. 8).
Однако анализ популяций родительской линии J urkat/wt и J А4 методом проточной нитофлуориметрии с М КА анти-Вс1-2 показал, что в популяции JA4 доля Bcl-2-позитивиых клеток ниже, чем в родительской линии, кроме того, экспрессия белка, определяемая по медиане флюоресценции антиген-позитивных клеток, также уступает аналогичному показателю Jurkat/wt (рис. 9). Такие же результаты получены методом иммуноблоттинга (Western-blot): специфическими \1КА к бачкам митохондриального пути передачи сигнала в клетках JA4 выявлено достоверное снижение экспрессии Вс1-2 и Bcl-XL
при неизменном уровне Bid и митоген-активируемой про-теинкиназы МАРК р44/42 (рис. 10).
Таким образом, фенотип мультирезистентности клеток JA4 ие может быть связан с конститутивным блоком митохондриального сигнального пути на уровне Bid — Bcl-2 — Bcl-XL. Возможно, блокирование апоптотических сигналов в клетках JA4 происходит на других уровнях за счет смешенного баланса про- и аитиапоптотических факторов.
Воспользовавшись достижениями современных нанобнотехнологий. мы получили возможность про-
Сазр-8
--
т
PADD Ф* Щ-
9 ЩШ Ж* й-
CD95
HSC70
Рис. 8. II ммуноблоттинг компонентов енгиа. шного комплекса DISC, индуцированного и изолированного нмму-номагнитным анги-( П95 препаратом из клеточного лизата клеток Н9 (треки 1-2), Jurkat/wt (греки 3-4) и J А4 ( греки 5-6) в качестве отрицательного контроля
Рис. 9. Гистограмма распределения клеток Jurkat/wt (сплошная линия) и JA4 (пунктир) по флюоресценции посте окрашивания их FITC-MKA анш-Вс1-2. Пик, соответствующий аутофлюоресценции, не показан
Таблица 2
Активация каспазы-3 и флиппинг фосфатидилсернна в клетках Jurkat/wt и JA4 при инкубации с TRAIL+M2 (100 иг/мл) и МКА aiiTii-CD95 1РО-4 (100 нг.мл) в течение 24 ч
Индуктор апоптоза Активация каспазы-3 Флиппинг фосфатидилсерина
Jurkat/wt JA4 Jurkat/wt JA4
Интактный контроль 7 + 2 5 + 1 6 + 2 7 + 2
+ DMSO (коїпроль) 6 + 2 4 + 2 6 + 2 5 + 1
+ TRAIL/FLAG 56 + 8 7 + 2 68 + 10 8 + 2
+ МКА анти-FLAG М2
+ МКА anrn-CD95 (IPO-4) 88+12 6 + 2 84+14 6 + 2
анализировать результаты конкурентной гибридизации библиотек кДНК, синтезированных обратно-транс-криптазной реакцией на матрицах мРНК. изолированных из интактных клеток Jurkat/wt н JA4. Библиотеки кДН К представляли собой флюоресцентно меченные полидезоксирибонуклеотнды, комплементарные нуклеотидным последовательностям транскрнптов мРНК. Использование дифференциальных меток (флу-орофор Су5 Д1я кДНК Jurkat/wt и СуЗ дая кДНК JA4) позволяет проводить нормированную конкурентную гибридизацию полученных библиотек с иммобилизованными в ячейках ДНК-мнкрочгшов полинуклеотид-ными зондами с последующим сравнительным анализом уровня экспрессии генов клетками двух линий.
Гибридизация выполнена с использованием ДНК-микрочипов HumanGene U133A (Affymetrix. США), предназначенных для одновременного анализа экспрессии более 20 тыс. генов человека и их транскрипционных вариантов, включая продукты альтернативного сплайсинга мРНК Результаты анализа представлены в виде электронных таблиц формата MicroSoft Excel и содержат информацию об абсолютном уровне нормированного сигнала по каналам флюоресценции СуЗ н СуЗ, логарифме их соотношения, уровне достоверности данных и предполагаемом белковом продукте данного транскрипта.
Уровень экспрессии различных генов, кодирующих компоненты сигнальных путей, про- и антнапоп-тотические факторы, активаторы и ингибиторы сигналов, компоненты каскадов МАР-кипаз, рецепторы II эффекторы, др., в большинстве случаев самостоя-
тельной ценности не представляет, но является ориентиром при определении тактики последующих исследований: наличие транскрипта гена (мРНК) еще не означает синтеза его белкового продукта, который в конечном итоге определяет фенотип. Так. ген, кодирующий ядерный белок р53. экспрессирован в клетках обеих линий на уровне транскрнптов, в то время как сам белок р53 методом иммуноблоттинга в клетках Jurkat/wt и JA4 не обнаруживается (рис. 11).
Как и ожидалось, снижение экспрессии антиапоп-тотических факторов Вс1-2 и Bcl-XL контролируется на генетическом уровне: количество соответствующих мРНК в клетках JA4 заметно меньше, чем в родительской линии, тогда как транскрипгы, кодирующие Вах, Bid. Apaf-1 и AIF. представлены в обеих линиях одинаково, так же как мРНК адаптеров FADD, TRADD, DAXX. DEDD. R1P. Не обнаружено сушествешшх различий в экспрессии генов, кодирующих каспазы, за исключением каспазы-1 (Интерлейкин-1-бета-конверга-за), экспрессия которой повышена в клетках JA4 так же. как экспрессия субстрата этого энзима — IL-lp.
Не обнаружено сколько-нибудь драматических изменений уровня экспрессии генов, кодирующих рецепторы суперсемейства TNFRSF: снижение дозы мРНК CD95 (TNFRSF6) в клетках J A4 «компенсируется» повышением дозы мРНК TNFR-I, TNFRSF4 и CD27. В то же время экспрессия генов, кодирующих TN F-подобные лиганды этих рецепторов, заметно повышена в клетках JA4: лимфотоксины-альфа и -бета, CD70 (лиганд CD27). CD95L и APO-2L достоверно и значимо превалируют над аналогичными транскриптами в клетках родительской линии, так же как LPS-induced TNFa-factor и Гранзимы А и В. В целом киллерный эффекторный аппарат клеток JA4 (во всяком случае на уровне транскрипции соответствующих генов) выглядит более агрессивным.
Неожиданно результаты гибридизации кДРПч выявили значительный акцент в клетках JA4 на экспрессию белков теплового шока HSP-27, HSP-40. HSP-70 и HSP-90; оверэкспрессия последнего подтверждена результатами иммуноблоттинга (см. рис. 10). Учитывая возрастающий интерес к этим белкам как к потенциальным регуляторам процессов программированной клеточной табели [13]. они могут оказаться претендентами
HSP-90
р44/42
Bel-Xl
Bel - 2
•Я
X
ь
W
(J
BID
HSC-70
Рис. 10. Иммуиоблоттинг белков сигнальных каскадов аиоитоза, выделенных из интактных клеток Jurkat/wt (слева) и JA4 (справа). Количееч во белка нормировано к внутреннему контролю (HSC-70)
р53
Рис. 11. Иммуноблоттиш белкового продукта гена Р53 в тотальном лизате клеток Лигка1/*1 (трек 1), М4 ( грек 2) н клеточной линии СЕМ ( грек 3) в качестве положи I ель-ного контроля
на ключевые роли в процессе формирования мультире-знстептного фенопша клеток JA4. Обозначились еще два возможных кандидата на ту же роль: гиперэкспрессия 5' -эктонуклеотндазы (CD73), обнаруженная в клетках JA4. в ряде случаев коррелирует с фенотипом множественной лекарственной устойчивости [24:26], а С-терминаль-но связывающий белок-2 (C-terminal Binding Protein-2), тоже гнперэкспресснрованный в этих клетках, рассматривается как транскрипционный ингибитор ряда генов, продукты которых вовлечены в процессы внутриклеточного снгналинга [6; 7].
В настоящее время мы не знаем, с поломкой какого конкретного молекулярного механизма программированной гибели связана мультирезистентность клеток JA4. однако полученные результаты позволяют заключить, что:
• полирезистентность к индукции апоптоза клеток JA4 коррелируете их устойчивостью к химио-, радио-, биопрепаратам циторедуктивного действия;
• появление мультирезистентного клона J А4 спровоцировано хроническим сублетальным воздействием на CD95-penenrop. что в реальной клинической ситуации может быть как следствием применения соответствующих средств биотерапии [4:21], так и результатом давления на популяцию опухолевых клеток со стороны иммунной системы.
Учитывая исключительную важность феномена программированной гибели клеток дтя поддержания гомеостаза многоклеточного организма, редукция опухолевыми клетками этого регуляторного механизма может отражать процесс необратимой опухолевой прогрессии.
Авторы выражают искреннюю благодарность профессору С П. Сидоренко (Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавец-кого ПАН Украины. Киев) за любезпо предоставленные для работы агонистические моноклональные антитела IPO-4 к антигену CD95.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блохин Д. Ю., Иванов ПК, Михайлов АД. и др. Создание анти-Рах-иммуномаггагтных микрогранул для активации и изоляции апоптоз-инлушфующего сигнального комплекса DISCII Сб. 10-ii Межлунар. Плесекой конф. по магнитным жидкостям. — Плес. Россия. — Сентябрь. 2002. — С. 352-5
2. Блохин Д.Ю., Иванов Г/.К.. Соколовская А.А. и др. 11ммуно-магнитные aimi-Fas микрочастицы дтя активации и выделения апоптоз-индупируюшего комплекса DISC //Сб. 1-го Симп. «Применение биомаггагтных носителей в медицине». — Москва. — Россия. — Ноябрь 19-20,2002. — С. 82-6.
3. Соколовским А. А.. Заботина Т.Н.. Блохин ДЮ. и dp. CD95-лефишггные клетки сублннии Jurkal/A4, устойчивые к лекарственно-индуцированному апоптозу II Эксп. онкол.
— 2001 Т. 23. № 3, —С. 174-180.
4. ЧехунВ.Ф.. ШииюваЮ.В.. Юрченко О. В. udp Синергическое шпотокснческое действие цисплатнны и моноклональных анпггел IPO-4 на клетки эпидермальной карциномы человека линии КВ //Эксп. онкол. —1998. — Т. 20. —С. 210-6.
5. Blokhin D.Yu., Sokolovskaya A.A.. Zaboiina T.N. el al.
Chemical anti radiation resistance of C'D95-deficient Jurkat/ A4 cell line // Proc. 4th World Meeting ADRITELF / APG1 / A VP. — Florence, Italy. — April 8-11. 2002 P. 87-8.
6. Chinnadurai G. CtBP, an unconventional transcriptional corepressor in development and oncogenesis // Mol. Cell. — 2002 —Vol. 9 (2). P 213-224.
7. Clwmadurai G. CtBP family proteins: More than transcriptional corcpressors II Bioessays. — 2003. — Vol. 25 (1). — P. 9-12.
8. Degli-Esposti M.A.. Smolak P.J., Walczak H. et al. Cloning and
characterization of TRAIL-R3, a novel member of the emerging TRAIL receptor family // J. Exp. Med. — 1997. — Vol. 186. — P 1165.
9. FriesenC.. Herr I., Krammer P.H.. Debatin K. M. Involvement of the CD95 (APO-l/Fas) receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cells // Nature Medicine. — 1996.— Vol. 2, —P 574-7.
10. GrossA., YinX.M., Wang M.C.et al. Caspase cleaved BID targets mitochondria and is required for cytochrome c release, while BCL-XL prevents this release but not tumor necrosis factor-R 1/Fas death Hi Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P 1156— 1163.
11 Hengarlher M. O. The biochemistry of apoptosis // Nature. — 2000. — Vol. 407. — P 770-6.
11 Ichijo H . Nishida E . trie K. el al. Induction of apoptosis by ASK. 1. a mammalian MAPK K K that activates SAPK/J N K and p38 signaling pathways // Scienc. — 1997. — Vol. 275. — P. 90-4.
13 Jaattela M. Escaping cell death: survival protein in cancer // Exp. Cell Res. — 1999. — Vol. 248. — P. 30-43.
14. Jiang Y., Woronicz J.D., Liu fV.. Goeddel DA'. Prevention of constitutive TNF receptor 1 signaling bv silencer of death domains II Science. —1999. — Vol. 283.5409. — P. 1852-1860.
15. KauaharaA., Ohsawa Y. MatsumuraH . Uchiyama Y. Nagata
S. Caspase-independent cell killing by Fas-associated protein with Death Domain//J. Cell Biol. - 1998 —Vol. 143.№30.
— P. 1353-1360.
16. Li P.. Nijhawan D., Budihardjo I. et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-l/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade II Cell. — 1997. — Vol. 91. —P. 479-489.
17. LiuZ.G. HsuH.. GoaddelD etui. Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-( B activation prevents cell death // Cell. — 1996. — Vol. 87. — P. 565-576.
18. Nicoletti /.. Migliorati G.. Pagliacci M.C. el al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immun. Meth. - 1991. — Vol. 139. — P 271-280.
19. Scaffidi C.. Fulda S., Srinivasan A. et a! Two CD95 (APO-I/ Fas)signaling pathways//EMBOJ. —1998. — Vol 17. — P. 1675-1687.
20. Schulze-Osthoff K., FerrariD.. Los M. etal. Apoptosis signaling bv death receptors II Fur. J. Biochem. — 1998. — Vol. 254. — P. 439-459.
21. Smyth iVI J.. Tukeda K.. Havakawa Y etal. Nature's TRAIL
— on a path to cancer immunotherapy II Immunity. — 2003.
— Vol. 18, —P. 1-6.
22. Sokolovskaya A. A.. Blokhin D. Yu. Zabotina T.N.. Mikhailov A.D.. Eriksson J E CD95-deficient cell line resistance to death receptors activation and other apoptotic signals II Abstr. 3rd Eur. Workshop on Cell Death. —Salobrena. Spain. — Feb. 23rd-28th, 2002. — P. 22.
23.Sokolovskaya A.A.. Mikhailov A.D.. Moskovtsev A.A.. Eriksson J E.. Blokhin D. Yu. Induction of CD95-resistance cell line leads to multiresistancc phenotype // Proc. Miami Nature Biotech. Winter Symp. — Miami Beach. Florida, USA. — February 1-5,2003, Miami Nature Biotech. Short Rep.— Vol 14, —P. 112.
24. Spychala J. Tumor-promoting functions of adenosine // Pharmacol. Therapeutics. —2000. — Vol. 87. — P. 161-173.
IS.Trautli B.C., Klas C., Peters A.M. et al Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis II Science. —1989. — Vol. 245. — P. 301-5.
26. UjhazyES., BerlethJ.M., PietkiewiczH. etal. Evidence for the involvement of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in drug resistance // Int. J. Cancer. — 1996. — Vol. 68 (4). — P 493-500.
27. Walczak H., Miller RE.. AriailK. etal Tumoricidal activity of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in vivo// Nature Medicine. — 1999. — Vol. 5(2). — P. 157-163.
28. Yonehara S., tshii A.. Yonehara M. A cell killing monoclonal antibody (anti-Fas) to cell surface antigen co-down-rceulated with the receptor to tumor necrosis factor II J. Exp Med. — 1989.— Vol. 169, —P. 1747-1756
