CC BY
35
БИОМАРКЕРЫ
УДК 615.015:577.4
A.A. Sokolovskaya, T.N. Zabotina, T.N. Palkina, D. Yu. Blokhin
A POSSIBLE PARTICIPATION OF CD95 (APO-l/FAS)/CD95L IN DRUG-INDUCED APOPTOSIS
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow
ABSTRACT
The possible role of CD95/CD95L in pathogenesis of drug-induced apoptosis was studied using a model of human leukemic cell line Jurkat. F(ab’)2anti-CD95 (IPO-4) monoclonal antibodies (MoAb) were shown to inhibit etoposide- and doxorubicin-induced apoptosis in these cells. Etoposide treatment unregulated CD95L expression on the surface of the cells. These data suggest the possible involvement CD95/CD95L system in the mechanisms of anticancer induced apoptosis and keep in line with the results obtained by other authors. However, these results do not show this system to be the sole and major mechanism of drug-induced apoptosis, and other mechanisms are possible,
Key words: CD95/CD95L, drug-induced apoptosis, Jurkat
А.А. Соколовская, Т.Н. Заботина, Т.Н. Палкина, Д.Ю. Блохин
ВОЗМОЖНОЕ УЧАСТИЕ С095(АР0-№А8)/С095Ь В ЛЕКАРСТВЕННО-ИНДУЦИРОВАННОМ АПОПТОЗЕ
ГУРОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва
РЕЗЮМЕ
Исследована возможная роль СВ95-рецепторно-лигандной системы в механизме лекарственно-индуцированного аподтоза. С помощью Р(аЬ’)2 фрагментов, полученных из эффекторных моноклональных антител (МКА) к антигену СЭ95 (1РО-4), показано, что Р(аЬ’)2 фрагменты анти-СБ95 МКА могут блокировать этопозид- и доксорубицин-индуцированный апоптоз клеток 1игка1. Выявлена экспрессия СШ5Ь на поверхности клеток 1игка1 после инкубации с этопозид ом. Полученные результаты позволили предположить, что противоопухолевые препараты могут индуцировать апоптоз через систему СТ>951Сй95Ь, что согласуется с данными зарубежных авторов, но однако не служит доказательством доминирующего влияния С095/СБ95Ь-системы на механизм лекарственной индукции апоптоза.
Ключевые слова: С095/С095Ь, лекарственно-индуцированный апоптоз
ВВЕДЕНИЕ
Противоопухолевые препараты, используемые в клинической практике, индуцируют общий финальный путь гибели клетки, известный как апоптоз, или программированная клеточная гибель. Существует по крайней мере два относительно независимых механизма индукции сигнала апоптоза и соответствующих путей его передачи. Первый начинается с формирования сигнала смерти при стимуляции экстра-целлюлярного домена специфического трансмембран-
ного рецептора природным лигандом или его аналогами (рецепторно-лигандный путь), второй связан с генерацией сигнала в ответ на нерепарабельное внутриклеточное повреждение и реализуется по р53-за-висимому или р53-независимому механизму высвобождения митохондриальных медиаторов апоптоза (митохондриальный путь).
Рецептор Fas, или АРО-1, называемый также CD95, - один из первых среди семейства рецепторов TNF (TNFR), для которого была описана и определена роль
в апоптозе [2; 12; 20]. Взаимодействие лиганда CD95L с рецептором CD95 (Fas/APO-1) приводит к образованию сигнального комплекса (DISC), включающего в себя СВ95-рецептор, адаптерный белок FADD и про-каспазу-8. Дальнейшее активирование каспазы-8 приводит к активации других каспаз и расщеплению их субстратов, таких, как ламины ядерной стенки, актин, гистон HI, ICAD, PARP и др. Установлено, что активация каспазного каскада является критическим компонентом лекарственно-индуцированного апоптоза [13; 21]. Так, в клетках линии глиомы U87-MG GB-1 цисплатин- и С095-индуцированный апоптоз блокировался ингибитором каспаз Ac-YVAD-CMK [14]. Протеолитическая активность каспаз обнаружена в клетках СЕМ (Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз) и SH-EP (клетки линии нейробластомы человека) после индукции как цитарабином, доксоруби-цином и метотрексатом, так и антителами анти-СБ95 [18]. Landowski Т.Н. et al. показали, что селективно отобранные по резистентности к противоопухолевым препаратам клеточные линии миеломы человека (8226) и линии СЕМ были резистентны к Fas-индуцированному апоптозу [17].
Показано, что F(ab’)2 фрагменты МКА против антигена CD95 (АРО-1) с изотипом IgG3 могут блокировать лекарствешюиндуцированный апоптоз в различных опухолевых клетках. В частности, было обнаружено, что преинкубация клеток Jurkatc Р(аЬ’)2фрагментамиМКА amn-CD95 (АРО-1) ингибировала цитотоксичность док-сорубицина, этопозида и цисплатина [5; 7].
Известно также, что некоторые противоопухолевые препараты способны индуцировать экспрессию CD95L на поверхности клеток линий лимфобластного лейкоза, нейробластомы и гедатоклеточной карциномы [5; 7; 8].
Было высказано предположение, что активация CD95 рецепторно-лигандной системы является одним из критических событий в лекарсгвенно-ивдуцирован-ном апоптозе опухолевых клеток [7; 9; 10; 18], а резистентность опухолевых клеток к противоопухолевой терапии может быть связана с неспособностью этих клеток к С095-опосредованному апоптозу [7; 17].
Цель настоящей работы - получение экспериментальных доказательств вовлечения CD95 рецепторно-лигандной системы Т-лимфобластных клеток человека в механизм лекарственно-индуцированного апоптоза.
МАТЕРИАЛЫ МЕТОДЫ
Культура клеток
Работа выполнена на клетках линии Jurkat (Т-лим-фобластная линия человека). Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики, 10 мМ HEPES, pH 7,3 при 37 °С в атмосфере 5 % С02 Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пассированием культуры через каждые 2-3 сут.
Противоопухолевые препараты. В работе использованы препараты: доксорубицин (Институт по изысканию новых антибиотиков РАМН, Москва), этоло-зид (Lastet, Nippon Kajaku Co., Япония), цисплатин и циклоплатам (Институт общей и неорганической химии РАН, Москва). Все препараты растворяли в среде RPMI-1640 ex tempore.
Моноклональные антитела
Агонистические эффекторные МКА IPO-4 (анти-CD95/Fas/APO-l) любезно предоставлены С.П.Свдорен-ко (Инсппут Экспериментальной патологии, онкологии ирадиобиологииим. Р.Е.Кавецкого НАНУкраины).
Для исследования экспрессии CD95L на поверхности клеток использовали биотнн-меченные моноклональные антитела анти-FasL, клон NOK-1 (BD PharMingen, США) и конъюгат Avidin-FITC (BD PharMingen, США). Учет антиген-позитивных клеток осуществляли методом проточной цитофлуориметрии (цитометр FACScan, Becton Dickinson, США) с возбуждающим светом аргонового лазера (488 нм) и регистрацией эмиссии по каналу FL-1 (530 нм).
Получение F(ab’)2 фрагментов
F(ab’)2 фрагменты получали из очищенных МКА изотипа IgM airm-CD95 (IPO-4) с и анти-CD 15 (ICO-175) по описанному методу [16].
Предварительно моноклональные антитела диа-лизовали против ацетатного буфера pH 3,5. Раствор моноклональных антител обрабатывали пепсином (Sigma, США) в течение 4 ч при комнатной температуре. После образования кристаллического осадка образец центрифугировали с угловым ускорением 400 g в течение 15 мин. Гель-фильтрацию проводили на колонке 2,5 х 80 см Sephadex G-100 (Pharmacia, Швеция). После сбора на коллекторе фракцию, соответствующую Р(аЬ’)2-фрагментам, анализировали методом SDS-электрофореза в 10 % ПААГ в редуцирующих условиях по U.K. Laemmli, используя набор стандартных белков-маркеров.
Определение апоптотических клеток по окрашиванию ДНК пропидий йодидом (PI)
Апоптозные клетки определяли по методу Nicoletti I. [22]. Клетки в количестве 2,5 х 105 промывали в PBS, ресуспендировали в охлажденном 70 %-ном этаноле и хранили при 4 °С. Перед окрашиванием клетки осаждали центрифугированием (500 об/мин, 7 мин), осторожно ресуспендировали в 1 мл гипотонического раствора, содержащего 5 мкг/мл PI, 0,1 % натрия цитрат; Тритон X-100 (0,1 %), и инкубировали в темноте в течение 15 мин при 4 °С. Суспензию клеток, окрашенных PI, без дальнейшей отмывки анализировали мето-дом проточной цитофлуориметрии (питометр FACScan «Becton Dickinson», США) с возбуждающим светом аргонового лазера (488 нм) и учетом результатов по каналу FL-2 (585 нм). Субпопуляцию клеток с гипо-дипловдным содержанием ДНК (npe-Gg/Gj-область на гистограмме) оценивали как пул апоптозных клеток. Долю индуцированного апоптоза рассчитывали по ранее описанной формуле [23].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Индукция апоптоза МКА анти-СЮ95 и противоопухолевыми препаратами
Поскольку для формирования комплекса DISC необходима пространственная олигомеризация рецептора CD95 (минимальное событие- его тримеризация, т.к. природный лиганд CD95L содержит гомотримерный участок связывания), МКА классов IgG и IgA, являющиеся бивалентными мономерами, могут стимулировать
формирование комплекса DISC только при их кластеризации, например, вторыми, анти-Ig антителами. В то же время декавалентный пентамер класса IgM, специфичный к экстрацеллюлярному домену рецептора CD95, способен самостоятельно кластеризовать рецепторы, т.е. выступать как агонистическое (эффекторное) МКА.
Действительно, МКА анти-С095 (клон IPO-4,
класс 1§М) эффективно индуцирует апоптоз клеток линии 1игка^ а продукт их протео литического расщепления - Р(аЬ’)2 фрагменты - эту способность утрачивают (рис.1, А).
Использованные в настоящем исследовании противоопухолевые препараты также индуцируют апоптоз клеток 1игка1 [23].
7Г
МП; 198.49 CV: 163.64
р45Ш]424 (14.5%)
10< 10* 10s;
Mb; 226,52 CV: 139.43 [245-764J 651 (42.2!
Mns 174.86 tSk Ш40:
(245-76-4383 (Ш%)
" ■ 10г Ю" 10‘
в
Мп: 149.21 СV: 247.94
[258-696] 428 (О %)
10" 10’ 10* 105
Si
Mm 204.60 CV: #7.59
(258^6953 2288 (43,5%
10я 10’ 10? to? 10*:
Hn: 174.88 OJ: 216.10 1258-673] 1338
Mft: 184.38 CV: 19420
psmmm (8.5 щ
10°
■JkIV
10» 10? 105
Ми: 240.68 CV: 142.88
$58-718] 1780 (36.2%)
10° 10' 10* 10’ 10‘
Мш шт CV; 153.92
P08-718J 819 (16.5 %)
10° 10;» 10г 10’ 10‘
Рис.1. Гистограммы распределения окрашенных Р1 клеток 1игкаЬ
А: а - интактный контроль 24 ч; Ъ - результат специфического взаимодействия клеток Дигка! с МКА анти-С095(1Р0-4); с -результат специфического взаимодействия клеток 1игка1 с Р(аЬ’)2-фрагментами МКА анти-СП95(1РО-4),
В: а - интактный контроль 24 ч; Ъ - индукция апоптоза доксорубицином; с - блокирование доксорубицин-ивдуцированного апоптоза Р(аЬ!),-фрагментами МКА анти-СР95 (1РО-4).
С: а - интактный контроль 24 ч; Ь - индукция апоптоза этопозидом; с - блокирование этопозид-индуцированного апоптоза Р(аЬ’)2-фрагментами МКА анти-С095 (1РО-4)
Блокирование лекарственно-индуцированного апоптоза Р(аЬ’)2 фрагментами анти-СТ>95
В настоящем исследовании для специфического связывания мы использовали Р(аЬ’)2 фрагменты МКА анти-СБ95 (1РО-4), в качестве изотипического контроля применяли Р(аЬ’)2 фрагменты, полученные из МКА анти-СВ 15 (клон 1СО-175, класс 1д М).
Клетки линии 1игка1 в концентрации 5 х 104 клеток на лунку рассевали в 96-луночные планшеты. В каждую лунку (кроме контрольных) добавляли Р(аЬ’)2 фрагменты НИЖА анти-СБ95 (1РО-4) или Р(аЪ’)2 фрагменты МКА 1СО-175 в концентрациях от 1,0 до 100 нг/мл, инкубировали планшеты в течение 1 ч, после чего в лунки вносили один из изучаемых противоопухолевых препаратов и инкубировали клетки в течение 24 ч. Апоптоз оценивали методом проточной ци-тофлуорометрии по выявлению клеток с гиподипло-идным содержанием ДНК.
Обнаружено, что Р(аЬ’)2-фрагменты анти-С095 (1РО-4) в концентрации 10 нг/мл блокировали доксо-рубицин- и этопозид-индуцированный апоптоз. Так, если доксорубицин в концентрации 0,5 мкг/мл индуцировал апоптоз 40±5 % клеток, то преинкубация клеток с Р(аЬ’)2-фрагментами анти-СВ95 (1РО-4) уменьшала долю клеток в состоянии апоптоза до 20±3 % (п=3, р<0,001) (рис. 1, В). Этопозид в концентрации 1 мкг/мл индуцировал апоптоз 35+5 % клеток, в то время как преинкубация клеток с Р(аЬ’)2-фрагментами анти-СВ95 (1РО-4) снижала количество клеток в апоп-тозе до 10±4 % (р<0,005) (рис.1, С). Контрольные Р(аЬ’)2-фрагменты МКА 1СО-175 в концентрации 10 нг/мл не блокировали доксорубицин- и этопозид-ин-дуцированного апоптоза: доля апоптозных клеток не зависела от преинкубация с их Р(аЬ’)2-фрагментами.
Доксорубицин 0,5 мкг/мл
Эгошзид 1тт/тп-
Рис. 2. Лекарственноиндуцированный апоптоз клеток 1игка1 (темный столбик) и его подавление преинкуба-цией клеток с Р(аЬ’)2-фрагмеитами МКА анти-С1>95 (1РО-4) (серый столбик):
Белый столбик - преинкубация клеток с Р(аЬ’)2-фрагментами изотипического контроля (МКА анти-СШ5)
На рис.2. представлен график блокирования доксо-рубицин- и этопозид-индуцированного апоптоза.
Однако Р(аЬ,)2-фрагменты анти-С095 (1РО-4) не блокировали циклоплатам- и цисплатин-индуцирован-ного апоптоза. Так, если циклоплатам (5 мкг/мл) индуцировал апоптоз 29±4 % клеток, то при преинкуба-ции клеток с Р(аЬ’)2-фрагментами количество апоптозных клеток не изменялось (31±3 %, п=3, р>0,05). Аналогично цисплатин (3 мкг/мл) индуцировал апоптоз 27±2 % клеток, а при преинкубации с Р(аЬ’)2-фрагмен-тами количество апоптозных клеток составило 28±1 % (п=2, р>0,05).
Таким образом, преинкубация клеток 1игка1 с Р(аЬ’)2-фрагментами специфических анти-СБ95 МКА блокирует этопозид- и доксорубицин-индуцированный апоптоз, но не влияет на эффективность индукции апоптоза цисплатином и циклоплатамом.
Экспрессия СБ95Ь на поверхности клеток Лигка1:, инкубированных с противоопухолевыми препаратами
Клетки линии 1игка1 в концентрации 1 х 106 клеток на лунку рассевали в 24-луночные планшеты и инкубировали с доксорубицином (0,5 мкг/мл), этопозидом (1 мкг/мл) или циклоплатамом (10 мкг/мл) в течение 4 ч. Известно, что активация цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) вирусными антигенами, антителами против Т-клеточного антигена (анги-СБЗ) или форболовым эфиром (РМА) стимулируют экспрессию С095Ь [4]. Поэтому в качестве положительного контроля использовали активацию клеток РМА (10 нг/мл) в комбинации с кальциевым ионофором иономицином (1 мкг/мл). Экспрессию СБ95Ь на поверхности клеток Хигка! оценива-липо связыванию анти-РавЬ МКА (Ж)К-1) и анализировали методом проточнойцитофлуориметрии.
На поверхности интактных клеток .Гигка! экспрессии СБ95Ь не обнаружено; активация РМА вызывает презентацию С1>95Ь на поверхности 50±16 % (п=4) клеток. Инкубация клеток с этопозидом (1 мкг/мл) вызывает экспрессию СБ951) на поверхности 30 % клеток (п=2) (рис.З). Экспрессии СБ95Ь на поверхности клеток 1игка1после инкубации с доксорубицином (0,5 мкг/ мл) и циклоплатамом (10 мкг/мл) не обнаружено.
Полученные результаты совпадают с данными других авторов о том, что лекарственная индукция апоптоза может быть сопряжена с экспрессией СВ95Ь на поверхности клеток (этопозид); в других случаях (адриамицин, циклоплатам) такой экспрессии лиганда нами обнаружено не было. Это, однако, не следует расценивать как объективное доказательство отсутствия таковой, поскольку чрезвычайно цитотоксически активная молекула мембраносвязанного С095Ь является в достаточной мере коротко живущей, и, возможно, выбранные условия инкубации клеток с индуктором (4 ч) не являются оптимальными для решения поставленной задачи.
Предположение о возможной роли СВ95-рецептор-но-лигандной системы в лекарственно-индуцирован-ном апоптозе было описано в ранних работах Р. Кгаттег А а1. [15]. Обнаружено, что апоптоз клеток линии СЕМ, тздуцированвый как эффекторными МКА анти-СВ95 (Раз/АРО-1), так и доксорубицином, не
Mm 70.90 гу. 415 44
P52-1023J109 (2.0 %)
А
Ml,
юв ш W 'т> ю*
Мп: 663,0?
CVj 29,40
;РК4Й2Э$388 (50.7,»
В
Шц
10“ 101 102 103
Шж 55,02 CV: 673.59
[338-1023J 920 (38.5%)
М1
I'd*
Рис. 3. Гистограммы экспрессии СБ95Ь, на поверхности клеток <ГигЬа&
А - интактный контроль 4 ч;
В - клетки инкубировали с этопозидом (1 мкг/мл) в течение 4 ч; С - положительный контроль - активация РМА (10 нг/мл) о иономицином (1 мкг/мл)
блокируется СэА и циклогексемидом. По мнению авторов, доксорубицин-индуцированный апоптоз контролируется теми же генами и их белковыми продуктами, которые регулируют клеточную гибель в активированных Т-лимфоцитах. Кроме того, показано, что клепки линий (СЕМ* и Тигка^), резистентных к СБ95Ь-индуцированному апоптозу, не вступают в доксору-бицин-индуцированный апоптоз. И, наконец, выявлено, что доксорубицин и метотрексат иццуцируют экспрессию т!ША СТ>95Ъ в клетках СЕМ [4; 6; 15].
В исследовании других авторов доксорубицин, это-позид и цисплатин индуцировали экспрессию mRNA CD95 в клетках линии яейробластомы человека (SH-ЕР) [8]. Р(аЬ’)2-фрагментыМКАанти-АРО-1 блокировали индукцию апоптоза указанными цитостатиками. Следует отметить, что клетки SH-EP, так же, как СЕМ и Jurkat, экспрессируют СВ95-рецептор и чувствительны к СБ95Ь-опосредованному апоптозу.
По данным М. Muller et al. блеомицин, доксорубицин, цисплатин и метотрексат индуцировали апоптоз клеток линии рака печени HepG2 [19]. После индукции блеомицином обнаружено накопление белка р53 дикого типа (р53 wt) в клетках HepG2 и увеличение экспрессии CD95 на указанных клетках. Кроме того, блеомицин индуцировал экспрессию mRNA CD95L, а Р(аЬ’)2-фрагменты МКА анти-АРО-1 блокировали бле-омицин-индуцированный апоптоз.
В одной из недавних работ S. Fulda et al. предположили, что CD95/CD95L-onocpeflOBaiiHbie сигналы могут происходить на ранних этапах лекарственно-индуциро-ванного апоптоза [11]. Показано, что Р(аЬ’)2-фрагмен-ты МКА анти-АРО-1 и МКА airra-CD95L (NOK-1) блокировали индукцию апоптоза доксорубицином в течение 24 ч инкубации с цитостатиком. Однако через 48 ч инкубации в тех же условиях блокирующий эффект снижался, что, возможно, связано с активацией CD95/ СБ951,-независимого пути.
Таким образом, лекарственная индукция апоптоза вовлекает в процесс формирования и/или передачи сигнала С095/СБ95Ь-систему в различных опухолевых клетках, а нарушение функционирования CD95-рецепторно-лигандной системы может приводить к лекарственной устойчивости.
Ранее мы получили СВ95-дефицитную линию клеток Jurkat/A4 с подавленной экспрессией рецептора CD95 [1]. Клетки этой линии оказались резистентными к индукции апоптоза не только МКА IPO-4 (отсутствие рецептора CD95), но и TRAIL (лиганд АРО-2), а также химическими (доксорубицин, этопозид, цисплатин, циклоплатам, перекись водорода, менадион, ингибитор протеинкиназы С стауроспорин) и физическими (рентгеновское облучение, коротковолновый УФ-свет) индукторами [24], т.е. обладают мультирезистентностью к различным индукторам апоптоза. Одновременно клетки этой линии проявляют фенотип полихимиорадиорезистентности к тем же воздействиям по критерию сохранения жизнеспособности (МТТ-тест) [3]. Это, однако, не служит прямым доказательством дминирующего влияния CD95/CD95L-cHcreMbi на процесс лекарственной индукции апоптоза.
ВЫВОДЫ
Получены экспериментальные данные о рекрутировании CD95/CD95L-CHCTeMbi в процесс лекарственной индукции апоптоза клеток Jurkat. Показано, что лекарственные противоопухолевые препараты могут стимулировать экспрессию CD95L на поверхности клеток-мишеней, а использование F(ab’)2 фрагментов aiiTH-CD95 МКА способно ингибировать лекарственную индукцию апоптоза.
В то же время, несмотря на совпадение полученных результатов с данными других авторов и резуль-
татами наших собственных предыдущих исследований, причинно-следственная связь между лекарственной индукцией апоптоза и вовлечением в этот процесс
CD95/CD95L-системы остается не ясной.
ЛИТЕРАТУРА
1. Соколовская АА., Заботит ТН., Блохин ДЮ. и dp. CD95-дефицитные клетки сублинии Jurkat/A4, устойчивые к лекарственно-индуцированному апоптозу // Экспериментальная онкология. - 2001. - 23(3). - С. 174-180.
2. Yonehara S., Ishii A., Yonehara М. A cell killing monoclonal antibody (anti-Fas) to cell surface antigen co-down-regulated with the receptor to tumor necrosis factor // J. Exp. Med. -1989. - Vol. 169. - P. 1747-1756.
3. Blokhin D. Yu., Sokolovskaya A.A., Zabotina T.N. et al. Chemical and radiation resistance of CD95-deficient Jurkat/ A4 cell line II Proc. 4th World Meeting ADRITELF / APGI / AVP. - Florence, Italy. - April 8-11,2002. - P. 87-88.
4. Brunner Т., Yoo N.J., Griffith S. et al. Regulation of CD9S ligand expression: a key element in immune regulation? // Behring Inst. Mitt -1996. - Vol. 97. - P. 161-174.
5. Dhein J., Walczak H., Baumler C. et al. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-l(Fas/CD95) // Nature. - 1995. -Vol. 373.-P. 438-443.
6. Dhein J., Walczak H., Baumler C. et al. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-l(Fas/CD95) // Nature. - 1995. -Vol. 373.-P. 438-441.
7. Friesen C., Herr /., Krammer P.H., Debatin K-M. Involvement of the CD95 (APO-l/Fas) receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cells // Nature Medicine. -1996. - Vol. 2. - P. 574-577.
8. Fulda S., Friesen C., Los M. et al Betulinic acid triggers CD95 (APO-l/Fas)- and p53-independent activation of caspases in neuroectodermal tumors // Cancer Res. -1997. -Vol. 57.-P. 4956-4964.
9. Fulda S., Los М., Friesen C-, Debatin K-M. Chemosensitivity of solid tumor cells in vitro is related to activation of the CD95 system // Int. J. Cancer. - 1998. -Vol. 76.-P. 105-114.
10. Fulda S., Scafftdi C„ Santos A. et al. Activation ofmitochondria and realese of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic add IIJBC. -1998. - Vol. 273. -P. 33942-33948.
11. Fulda S., Strauss G., Meyer E., Debatin K-M. Functional CD95 ligand and CD95 death-induced cell death and doxorubicin-induced apoptosis in leukemic T cells // Blood. - 2000. - Vol. 95. - P. 301-308.
12. It oh N., Nagata S. A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of Fas antigen // J. Biol. Chem. -1993. - Vol. 268. -P. 10932-10937.
13. Kaufmann S.H. Proteolytic cleavage during chemotherapy-induced apoptosis // Mol Med Today. -
1996. Vol. 2(7).-P. 269-303.
14. Kondo S., Banara B.P., Morimura T. et al. Interleukin-lb -converting enzyme mediates cisplatin-induced apoptosis in malignant glioma cells // Cancer Res. - 1995. - Vol. 55. -P. 6166-6171.
15. Krammer P.H., Dhein J., Walczak H. et al. The role of APO-1-mediated apoptosis in the immune system // Immunol. Rev. -1994.-Vol. 142.-P. 175-191.
16. Lamoyi E., Nisonoff A. Preparation of F (ab’) 2 fragments from mouse IgG of various subclasses // J. Immunol. Methods. -1983. - Vol. 56(2). - P, 235-243.
17. Landowski T.H., Gleason-GusmanM., Dalton W. Selection for drug resistance results in resisitance to Fas-mediated apoptosis II Blood. -1997. -Vol. 89. - P. 1854-1861.
18. Los M., Herr I., Friesen C. et al. Cross-resistance of CD95-and drug-induced apoptosis as a consequence of deficient activation of caspases (ICE/Ced-3 proteases) II Blood. -
1997.-Vol. 90.-P. 3118-3129.
19. Muller M., Strand S., Hug H. et al. Drug-induced apoptosis in hepatoma cells is mediated by the CD9S (APO-l-Fas) receptor/ligand system and involves activation of wild-type p53 // J. Clin. Invest. -1997. - Vol. 99. - P. 403-413.
20. Nagata S., Golstein P. The Fas death factor // Science. -1995. - Vol. 267. - P. 1449-1456.
21. Nicholson D.W., Ali A., Thornerberry N.A. Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease necessary for mammalian apoptosis // Nature. - 1995. - Vol. 376. - P. 37-43.
22.NicolettiL, MiglioratiG., PagliacciM.C. etal. Arapidand simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immunol. Meth. -1991. - Vol. 139. - P. 271-280.
23.Sokolovskaya A.A., Zabotina T.N., Blokhin D.Y. et al. Comparative analysis of apoptosis induced various anticancer drugs in Jurkat cells // Exp. Oncol. - 2001. -Vol. 23.-P. 46-50.
24. Sokolovskaya A.A., Mikhailov A.D., Moskovtsev A.A. Induction of CD95-resistance cell line leads to multiresistance phenotype // Proc. Miami Nature Biotech. Winter Symp. - Miami Beach, Florida, USA. - February 1-5,2003, Miami Nature Biotech. Short Rep. - Vol. 14. -P. 112.
