CC BY
413
ТОМ 2
НОМЕР 1
ЯНВАРЬ - МАРТ 2009
КЛИНИЧЕСКАЯ
О. її/ ч СЕМИНАР ПО ОНКОЛОГИИ
Н КОгематология
Mechanisms of formation of drug resistance of tumours
Механизмы формирования лекарственной устойчивости опухолевых клеток
Д. Ю. Блохин
РЕФЕРАТ
D. Yu. Blokhin SUMMARY
The molecular mechanisms of becoming and maintenance of a multi-drug resistance phenotype of tumoral cells are briefly analysed. Drug resistance of cells can be developed with high function of the molecular pumps which throw out medicinal substances from a cell, with high activity of detoxication system, and also with repression of the programmed cell death providing a cellular homeostasis and genetic stability of an organism. Repression of the programmed cell death can occur as a result of a natural progression of a tumor and leads to formation of a phenotype of its multidrug resistance.
Keywords:
multidrug resistance, programmed cell death, apoptosis.
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, Moscow
Контакты: blokhin@yandex.ru
Принято в печать: 10 апреля 2009 г.
В работе кратко проанализированы молекулярные механизмы становления и обеспечения фенотипа множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Лекарственная устойчивость клеток может быть связана с активной функцией молекулярных насосов, выбрасывающих лекарственные вещества из клетки, с высокой активностью системы детоксикации противоопухолевых лекарств, а также с репрессией программы клеточной гибели, обеспечивающей клеточный гомеостаз и генетическую стабильность организма. Репрессия программы клеточной гибели может происходить в результате естественной прогрессии опухоли и приводить к формированию фенотипа ее множественной лекарственной устойчивости.
Ключевые слова
множественная лекарственная устойчивость, программированная гибель клеток, апоптоз.
ВВЕДЕНИЕ
Химиотерапия является основным, а при некоторых формах и стадиях распространения — единственным методом лечения онкологических заболеваний. Несмотря на расширяющийся арсенал противоопухолевых лекарственных средств, современное состояние консервативных методов лечения злокачественных опухолей далеко от совершенства. Наиболее серьезным препятствием к повышению эффективности специфической терапии опухолей по-прежнему остается фенотип их множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), который не только формируется в процессе предшествующего лечения онкологических больных, но и возникает в ряде случаев спонтанно, в результате индивидуальных особенностей опухолевой прогрессии у пациентов, ранее не получавших противоопухолевой терапии.
ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ФАРМАКОКИНЕТИКЕ И ФАРМАКОДИНАМИКЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВ
Подавляющее большинство современных противоопухолевых природных и синтетических химических соединений действует на клетки-мишени непосредственно, проникая в них и поражая многообразные внутриклеточные молекулярные мишени. Однако путь лекарственного вещества от аптечной упаковки до опухолевой ткани вовсе не «усыпан розами»: на этом пути армия лекарственных молекул несет значительные потери. Попав в кровь, лекарственные соединения могут связываться с компонентами плазмы, подвергаться окислительному катаболизму в печени, выводиться из организма почками, хотя бы раз преодолев гистогематический барьер, накапливаться в тканях (в т. ч. в нор-
РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
167
Д. Ю. Блохин
мальных). В итоге до опухолевой ткани добирается лишь часть введенного в организм лекарства. Величина этой части зависит от разнообразных факторов, определяющих в совокупности особенности фармакокинетики конкретного лекарственного препарата и его биодоступности. Особенности распределения лекарств в органах и тканях организма могут существенно влиять на лекарственную чувствительность опухолей за счет ограничения накопления лекарств в опухолевой ткани, быстрой их детоксика-ции/дезактивации, выведения из организма и др. Однако в настоящей работе внимание сосредоточено на фармакодинамических аспектах клеточной биологии, имеющих значение для становления и поддержания фенотипа МЛУ опухолевых клеток.
Итак, часть введенного в организм онкологического больного лекарственного вещества попала в ткань опухоли и проникла в опухолевые клетки. С этого момента все дальнейшие события подчиняются законам клеточной биологии: опухоль, состоящая из клеток, чувствительных к химиотерапевтическим средствам, может оказаться рефрактерной к лечению по упомянутым выше причинам; состоящая из резистентных клеток опухоль не может быть чувствительна к терапевтическому лечению ни при каких условиях. Этим обусловлена несостоятельность попыток индивидуализации химиотерапии по результатам тестирования лекарственной чувствительности in vitro. В то же время обратная задача — определение лекарственной резистентности к отдельным лекарствам в краткосрочных культурах опухолевых клеток пациентов — успешно используется в США и странах Западной Европы для исключения из схем лечения заведомо неэффективных комбинантов.1
Становлению фенотипа лекарственной устойчивости в значительной степени способствует применение циторедуктивной химиотерапии. В начале 80-х годов прошлого столетия Банк опухолевых штаммов и клеточных культур Российского (в то время — Всесоюзного) онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН изобиловал модельными штаммами перевиваемых опухолей животных с индуцированной устойчивостью к одному или нескольким лекарственным противоопухолевым препаратам. Способ получения этих штаммов стандартен: индукции резистентности добивались постоянным применением субтерапевтических доз цитостатика на протяжении нескольких десятков пассажей опухолевых клеток in vivo или in vitro. Результатом явилась коллекция вариантов стандартных перевиваемых опухолевых штаммов с индуцированной резистентностью к вызвавшему ее агенту. Достаточно часто такая резистентность сопровождается развитием устойчивости и к другим близким по структуре препаратам того же класса, не применявшимся для ее индукции — перекрестная(кросс-) резистентность.
Значительно серьезнее с точки зрения клинической химиотерапии опухолевых заболеваний выглядит фенотип МЛУ опухолевых клеток — развитие резистентности сразу к большому числу противоопухолевых лекарств с совершенно не похожими друг на друга структурами и механизмами действия: антрациклиновым антибиотикам, алкалоидам барвинка, метотрексату, эпиподофиллотоксинам и др. В настоящее время известно и достаточно подробно изучено, по крайней мере, несколько молекулярно-биологических механизмов обеспечения фенотипа МЛУ: активация энергозависимого обратного транспорта (выброса) лекарственных веществ из клетки, стимуляция системы внутриклеточной детоксикации и усиление процессов репарации внутриклеточных повреж-дений.2,3
ОГРАНИЧЕНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВ В КЛЕТКЕ
Первый механизм обеспечивается гиперфункцией АТФ-зависимых транспортеров (АВС-транспортеры, от англ. ATP-binding cassette), наиболее исследованными из которых являются мембраносвязанные переносчики Р-гликопротеид (Pgp, Р-170) — продукт гена MDR1 (Multidrug Resistance 1), MRP1-7 (MDR associated protein) и BCRP (Breast cancer resistance associated protein), осуществляющие выброс проникших в цитоплазму ксенобиотиков в межклеточное пространство, а также цитозольные белки LRP/MVP (Lung resistance related protein/Major vaults protein), секвестрирующие внутриклеточное распределение цитотоксинов и иммобилизующие их из цитоплазмы в рибонуклеопротеидные везикулы (от англ. vault — склеп), основным компонентом которых они и являются. Иммобилизованные в такие везикулы лекарства в последующем выталкиваются из клетки.
Описанный уровень защиты клеток от повреждающего действия биологически агрессивных химических соединений достаточно эффективно предотвращает катастрофические для клетки-мишени последствия применения противоопухолевых химиотерапевтических средств, хотя эволюционно возник задолго до появления химиотерапии. Природной функцией этих систем является предотвращение опасного влияния агрессивной внешней среды обитания. В этой связи наибольшего развития подобные системы жизнеобеспечения достигли в тканях, потенциально наиболее подверженных атаке со стороны внешних факторов, — в эпителии легких, ЖКТ, почек и печени.4
Видимо, именно естественным предназначением систем обратного транспорта объясняется стрессорно-индуцируемый, адаптационный механизм становления МЛУ такого типа. Гиперфункция обратных транспортеров представляет собой стабильно наследуемую эпигенетическую активацию соответствующих ферментных систем в ответ на не специфическую, но потенциально опасную для жизни клетки экспансию факторов внешней среды: гипертермия, гиперосмия, присутствие солей тяжелых металлов, УФ-облучение.2,5 Показана устойчивая активация гена MDR1 после однократного применения антиметаболита цитарабина — препарата, не являющегося субстратом для белкового продукта данного гена.5 Эти наблюдения свидетельствуют об индуцибельной природе МЛУ такого типа, а не о селективном давлении на популяцию клеток-мишеней. Потенциальная ограниченность подобной стратегии защиты очевидна: энергозатратный механизм функционирования и определенный лимит исполнительных молекулярных машин — соответствующих белков — определяют общий ресурс адаптационных возможностей клетки-мишени.
ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ ИНАКТИВАЦИЯ ЛЕКАРСТВ
Система внутриклеточной детоксикации и катаболизма лекарств использует реакцию связывания последних с глутатионом (GSH) и обеспечивается активностью ферментов семейства глутатион^-трансфераз (GSTs) и глутатион-редуктазы. Конъюгаты противоопухолевых препаратов (в основном, алкилирующих агентов и комплексных соединений платины, активно атакующих SH-группу глутатиона) выбрасываются из клетки обратными транспортерами GS-X, к числу которых принадлежит и упомянутый выше MRP Семейство GSTs составляет несколько различных изоферментов, роль каждого из которых в детоксикации различных ксенобиотиков неодинакова, но, например, повышение активности GSTn: часто обнаруживается в клетках с гиперэкспрессией Pgp,2 что говорит о возможности сосуществования в клетках несколь-
168
Клиническая онкогематология
Лекарственная устойчивость опухолевых клеток
ких уровней защиты одновременно. Существенную роль в обеспечении дезактивации ксенобиотиков играют белки семейства цитохромов Р450, осуществляющих внутриклеточный окислительный катаболизм лекарственных средств. Важно, что системы дезактивации функционируют не только в опухолевых клетках-мишенях, но и в клетках нормальных тканей, а существующий полиморфизм соответствующих генов в значительной мере определяет индивидуальную переносимость больным лекарственного лечения.
УСТРАНЕНИЕ ВОЗНИКШИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ
Описанные выше механизмы защиты направлены на предотвращение самого факта взаимодействия лекарственного средства со своими внутриклеточными мишенями. Однако, если такое взаимодействие все-таки произошло и клетка получила опасные для дальнейшего существования повреждения биомакромолекул (нуклеиновых кислот и белков), стратегия защиты изменяется: полученное повреждение должно быть устранено.
Восстановление поврежденных биомакромолекул осуществляет несколько ферментных систем, участвующих в эксцизионной репарации ДНК, удалении спаренных и поврежденных оснований, лигировании разрывов ДНК, рефолдинге (ренатурации) и убиквитинзависимой деградации в протеасомах денатурированных белковых молекул. Кроме систем репарации ДНК в этом процессе участвуют стресс-индуцируемые белки теплового шока HSPs (от англ. heat shock proteins) и убиквитин-протеин лигазы. Последние направляют на утилизацию те белковые молекулы, повреждения в которых оказались неустранимыми. Таким образом реализуется принцип: если поврежденную структуру не удается восстановить, ее следует полностью ликвидировать. Ниже мы вернемся к этому принципу, но уже на качественно другом уровне организации живых систем. МЛУ, обусловленная повышенным уровнем активности репаративных процессов, относится в основном к препаратам алкилирующего действия и сходным по механизмам первичного повреждения комплексным соединениям платины. Считают, что перечень химиотерапевтических препаратов, устойчивость к которым определяется повышенной функцией репарации биомакромолекул, значительно меньше, чем список агентов, активно выбрасывающихся из клетки посредством АВС- и LRP/ MVP-транспортеров.2
СМЕНА МОЛЕКУЛЯРНОЙ МИШЕНИ
В дополнение к описанному обнаружено, что устойчивость к отдельным группам противоопухолевых химиотерапевтических средств может быть обусловлена изменением свойств их молекулярной мишени (в частности, топоизомераз I и II при развитии резистентности к эпиподофиллотоксинам, митоксантрону, камптотецину, антрациклиновым антибиотикам) или использованием клеткой альтернативных метаболических путей биосинтеза жизненно необходимых субстратов, идущих в обход пораженной молекулярной мишени: переключение акцента с тимидилатсинтетазной реакции образования дТМФ из дУМФ, активность которой ингибирует 5-фторурацил (синтез de novo), на «спасательный» путь фосфорилирования тимидина (TdR) в дТМФ тимидин-киназой при развитии резистентности к фторпиримидинам.6 Резистентность подобного типа, скорее всего, является следствием селективной смены клеточной популяции, при которой клетки, экспрессирующие соответствующие «непоражаемые» мишени либо вовсе обходящиеся без таких мишеней, получают преимущество в выживании. При этом
часть клеточной популяции погибает, уступая место субпопуляции клеток, неуязвимых для используемого лекарства. Резистентность такого типа чаще всего развивается к так называемым таргетным препаратам, имеющим одну определенную молекулярную мишень.
АКТИВАЦИЯ ПРОГРАММЫ ГИБЕЛИ КЛЕТОК ПРИ НЕИСПРАВИМЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ
Что же в итоге вызывает гибель части популяции? Ответ на этот вопрос получен лишь в последнее десятилетие ушедшего века. Ранее полагали, что противоопухолевые лекарственные средства вызывают в клетках несовместимые с жизнью повреждения. Эту картину действительно можно наблюдать в клеточных культурах при использовании концентраций лекарств, в десятки раз превышающих терапевтические. Масштабные исследования феномена программированной гибели клеток (ПГК), часто обозначаемого термином «апоптоз» (хотя апоптоз является лишь одним из морфологических проявлений реализации программы), пролили свет на представления о механизмах действия противоопухолевых препаратов. Оказалось, что подавляющее большинство этих веществ, начиная от средств «первой волны» (эмбихин, мел-фалан, 5-фторурацил, метотрексат, нитрозометилмочевина) до наиболее современных (гемзар, флудара, паклитаксел, гливек, ритуксимаб), а также перспективные лекарственные средства, еще не вошедшие в клиническую практику (ET-18-OCH3, PS-341, L-744832, TRAIL, TNF-a и др.), активируют внутриклеточную программу собственной гибели,7 заложенную в каждой клетке и предназначенную для самоликвидации при возникновении потенциально опасных для потомства повреждений, в первую очередь — генетических. Активация ПГК в этих условиях — дальнейшая реализация упоминавшегося выше принципа: если поврежденную структуру не удается восстановить, ее следует полностью ликвидировать.
ПГК выполняет в многоклеточном организме две основные функции: регуляторную и санитарную. Первая является противовесом клеточному делению, уравновешивая процессы размножения и элиминации клеток. Активируясь в тех клетках, необходимость в которых в данный момент отпала, ПГК обеспечивает их удаление: инволюция эмбриональных тканей, апоптоз зрелых лимфоцитов в период реконвалес-ценции после перенесенного инфекционного заболевания, разрушение старых и нежизнеспособных клеток. Санитарная функция ПГК обеспечивает удаление опасных для организма клеток: получивших соматические мутации, вступивших на ошибочный путь дифференцировки, вышедших за пределы гомологичной ткани, инфицированных некоторыми вирусами. Соответственно своей функции активация ПГК может происходить как от внеклеточных сигналов, так и от многочисленных внутриклеточных триггеров. Внешними сигналами могут являться цитокины семейства «лигандов смерти» (FasL, TRAIL, TNF-a), а также недостаток необходимых ростовых факторов, нарушение межклеточных контактов и др. Внутриклеточными событиями, запускающими ПГК, являются неустранимые повреждения ДНК, невозможность завершения начатого цикла деления, окислительный стресс, разрушение цитоскелета и другие повреждения, сопровождающие в т. ч. применение противоопухолевых лекарственных средств.
Несмотря на разнообразие активирующих ПГК причин, первично воспринятые разными сенсорами сигналы в итоге активируют один и тот же универсальный суицидный механизм — семейство «казнящих» ферментов (каспазы-3, -6 и -7),8 которые атакуют ключевые субстраты, последовательно разрушая хроматин и цитоскелет (рис. 1).
www.medprint.ru
169
Д. Ю. Блохин
О
КЛЮЧЕВЫЕ СУБСТРАТЫ: ламины А и В, фодрин, катенин, цитокератин, гистон Н1, ICAD, PARP, NF kB, PKC и др.
АПОПТОЗ
Рис. 1. Активация программы гибели клетки от внешних и внутренних стимулов. Все сигналы включают ферментные каскады, в результате которых активируются «казнящие» каспазы-3, -6 и -7, а из митохондрий в цитозоль выходят эффекторы апоптоза:
1 — после связывания лиганда с поверхностным «рецептором смерти» (на рисунке показаны рецептор Fas и его лиганд FasL) происходит агрегация рецепторов, его внутриклеточный домен через адаптер FADD связывает профермент прокаспазу-8, что приводит к аутопротеолитической активации последнего; два гетеродимера объединяются в активную форму каспазы-8; 2 — каспаза-8 расщепляет прокаспазу-3 с образованием активной ка-спазы-3; 3 — повреждения молекулы ДНК активируют ДНК-зависимые протеинкиназы, которые фосфорилируют неактивный белок р53, превращая его в фактор транскрипции проапоптозных генов, например Вах, белковый продукт которого связывается с антиапоптогенными белками Bcl-2 и Bcl-XL, открывая тем самым гигантские поры в наружной мембране митохондрий; 4 — из межмембранного пространства митохондрий через гигантские поры в цитозоль выходят апоптогенные факторы AIF, SMAC/DIABLO, эндонуклеаза G и цитохром с, который образует пространственный комплекс с цитозольным белком Apaf-1 и прокаспазой-9 — апоптосому (апоптозный шаперон); 5 — прокаспаза-9 в составе апоптосомы самоактивируется с образованием каспазы-9, которая трансактивирует каспазу-3; 6 — каспаза-8 может расщеплять цитозольный белок Bid, превращая его в активный «обрубок» t-Bid, который, подобно Bax, может встраиваться в наружную мембрану митохондрий, образуя в ней гигантские поры; 7 — гранзимы, попавшие в клетку в качестве «смертельной инъекции» клетки-киллера, прямо активируют каспазу-3; 8 — экзогенные или эндогенные активные формы кислорода окисляют митохондриальный белок-транспортер ААА, превращая его в трансмембранный канал, сквозь который в цитозоль поступают проапоптогенные факторы (цитохром с, AIF, SMAC и эндонуклеаза G)
170
Клиническая онкогематология
Лекарственная устойчивость опухолевых клеток
В финале ПГК клетка распадается на окруженные мембраной фрагменты — апоптозные тела, поглощаемые соседними клетками и тканевыми макрофагами в качестве питательного и пластического субстрата.
Все необходимые для осуществления ПГК компоненты, представляющие собой белковые продукты нескольких десятков генов, объединенных понятием «генной сети апоптоза», конститутивно присутствуют в нормальных клетках. Вне апоптогенных стимулов они находятся в латентном состоянии и могут в течение длительного времени не востребо-ваться клеткой, но на протяжении всей ее жизни суицидный аппарат готов к использованию. Активация ПГК происходит на посттрансляционном уровне даже в условиях подавления транскрипции генов и белкового синтеза. Сигналом к активации ПГК может служить любое потенциально опасное для дальнейшей жизнедеятельности клетки повреждение, однако такой сигнал не подлежит немедленному исполнению: учитывая необратимость «фатального решения», он подвергается всестороннему анализу на соответствие другим сигналам, постоянно получаемым клеткой как из внешней среды, так и от внутриклеточных сенсоров. Активации ПГК противостоит система выживания, вследствие чего процесс «принятия решения» находится в прямой зависимости от баланса сигналов «смерти»/«выживания». Таким образом, задачей циторедуктивной терапии опухолей является смещение существующего в опухолевой клетке равновесия путем активации сигналов смерти (повреждение молекулы ДНК — алкилирующие препараты, комплексные соединения платины, ионизирующее излучение; ингибирование топоизомераз — этопозид, митаксантрон, антрациклиновые антибиотики) либо, напротив, ослабления сигналов выживания (ингибирование протеинкиназ — стауроспорин, ребеккамицин, гливек). Подробный анализ участия ПГК в механизмах циторедуктивной терапии опухолей опубликован ранее.9
Последовательность событий, происходящих в пораженной цитотоксическими соединениями делящейся клетке, может быть представлена следующей общей схемой:
индукция первичных повреждений биомакромолекул и органелл ^ стрессовая реакция (адаптационный синдром) ^ временная остановка деления ^ активация систем выживания в агрессивных условиях, репарация повреждений (что означает БОЛЬШОЙ ВОПРОС: какой именно из возможных сценариев будет реализован клеткой?).
Значение этого БОЛЬШОГО ВОПРОСА зависит от многих причин, в первую очередь от успеха репаративных процессов и полноценности системы контроля за состоянием собственного генома:
• либо клетка, восстановив повреждения, продолжит
репродуктивный цикл;
• либо произойдет необратимая (по крайней мере, длительная) остановка ее деления;
• либо будет активирована ПГК с ее закономерным финалом.
Остановка клеточного деления, репарация повреждений, а в случае ее незавершенности гибель клетки характерны для нормальных тканей, с чем связана побочная токсичность противоопухолевой терапии. Этот механизм обеспечивает постоянство генома организма, предотвращая тиражирование клеток с генетическими дефектами. Та же последовательность событий происходит в опухолевых клетках, сохраняющих чувствительность к химиотерапевтическим средствам и ионизирующему облучению, а любое нарушение или затруднение выполнения ПГК ведет к снижению их лекарственной чувствительности.10 Это еще один путь к при-
обретению клеткой фенотипа МЛУ Его принципиальным отличием от описанных выше является не предотвращение молекулярных поломок или ликвидация их последствий, а игнорирование самого факта существования таких повреждений — в сценарном плане БОЛЬШОГО ВОПРОСА появляется новый вариант: продолжение деления клетки вне зависимости от наличия в геноме ошибок. Со стратегической позиции это путь в никуда: сохраненные повреждения закрепляются в геноме, накапливаясь из поколения в поколение; потомки таких клеток стремительно «теряют свое лицо», происходит клональное расщепление популяции, приближается генетическая катастрофа, когда сумма накопленных ошибок станет несовместимой с дальнейшей жизнедеятельностью. Но ведь тактическая задача — пережить токсическую атаку — успешно решена! Схематично МЛУ разных типов показана на рис. 2 (цит. по11).
Рис. 2. Механизмы лекарственной устойчивости малигнизированных клеток (по11 с изменениями):
1 — поступление препарата в клетку; 2 — трансмембранные АВС-транспортеры Рgp, MRP и BCRP выводят препарат из клетки; 3 — сек-вестрирование препарата в нуклеопротеидных везикулах при участии LRP/MVP; 4 — внутриклеточная инактивация препаратов системами глутатиона и цитохромов Р450; 5 — изменение мишени препарата предотвращает его повреждающее действие; 6 — блокирование остановки клеточного цикла и активации ПГК
ПОСЛЕДСТВИЯ НЕОБРАТИМОЙ УТРАТЫ КЛЕТКАМИ ПРОГРАММЫ ГИБЕЛИ
Как любой сложно организованный процесс, выполняемый последовательным взаимодействием множества участников, ПГК потенциально подвержена необратимым поломкам. Их причинами могут быть мутационный процесс или эпигенетические факторы, приводящие к дефициту ключевых исполнительных механизмов ПГК, гиперэкспрессии или гиперфункции факторов системы выживания, дезорганизации сигнальных путей гибели/выживания и многих других причин, природу которых в каждом конкретном случае можно знать или не знать — биологические последствия от этого не изменятся: клетка с поломанной или утраченной программой гибели должна необратимо прекратить адекватно реагировать на наличие в ней опасных повреждений. Применительно к консервативным методам лечения онкологических больных это означает становление фенотипа экстремальной МЛУ к подавляющему большинству (если ни ко всем) известных сегодня противоопухолевых лекарственных средств и ионизирующему излучению. Клетка с подобным фенотипом в условиях проводимой химио- или лучевой терапии получает неоспоримые преимущества в выживании, и ее потомки будут определять общий вектор и темп опухолевой прогрессии — от плохого к худшему и с ускорением.
Весомый аргумент в пользу приведенной концепции нам удалось найти в лабораторных условиях. Полученный
www.medprint.ru
171
Д. Ю. Блохин
результат явился по сути случайной находкой, но позволил сделать далеко идущие выводы.
СЕЛЕКЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ ПОПУЛЯЦИИ В УСЛОВИЯХ FAS-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА
Исходным материалом в работе послужили клетки линии Jurkat Т-лимфобластного лейкоза человека, растущие в виде суспензионной культуры в полной питательной среде и умеренно экспрессирующие Fas-рецептор. В качестве агента клеточной селекции использованы агонистические моноклональные антитела (МКА) к внеклеточному домену «рецептора смерти» Fas (клон IPO-4, изотип IgM, любезно предоставлены профессором С. П. Сидоренко, Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р Е. Кавецкого НАН Украины, Киев). Ранее было продемонстрировано, что МКА IPO-4, связываясь с рецептором Fas, эффективно индуцируют апоптоз Fas-позитивных клеток-мишеней.12 Применяя эти МКА в качестве агента селективного давления на популяцию, можно было ожидать либо деплеции антиген-позитивной субпопуляции и приобретения выжившей популяцией клеток антиген-негативного фенотипа, либо сохранения антиген-позитивного фенотипа «дикого типа» с утратой функциональной активности рецептора.
Такой прием ранее уже применялся другими авторами, однако полученные ими результаты даже при использовании одинаковых исходных клеточных линий не повторялись между собой. Так, одни авторы получили клональную сублинию клеток Jurkat, сохранившую Fas-позитивный фенотип, но негативную по экспрессии прокаспазы-8, в результате — резистентную к Fas-индуцированному апоптозу;13 другими был получен трансформант, имеющий Fas-негативный фенотип.14 В обоих случаях FasL-резистентные клетки сохраняли чувствительность к противоопухолевым цитостатикам и ионизирующему излучению. Наша попытка Fas-негативной селекции принесла иные результаты.15
Культуру Jurkat «дикого типа» выращивали в среде с различной концентрацией МКА IPO-4 в течение суток. Через 24 ч инкубации с МКА в лунках А1 и А2 (1000 и 500 нг/ мл МКА) практически все клетки погибли, в лунках А3 и А4 (250 и 125 нг/мл МКА) сохранилась популяция выживших клеток (около 30 и 50 % соответственно). В остальных лунках доля погибших и погибающих клеток уменьшалась пропорционально понижению концентрации МКА. Клетки из лунок А3 и А4 пересеяли в свежую питательную среду без МКА для восстановления их устойчивого роста. В течение 20 дней культивирования рост клеток из лунки А4 восстановился, и в дальнейшей работе использовали именно эту культуру (далее — A4). Культуру A4 вновь инкубировали 24 ч в среде с МКА IPO-4, повысив их концентрацию вдвое (250 нг/мл); далее — 3 нед. в среде без антител. Третий и четвертый циклы селекции выполнены аналогично, но концентрация МКА в среде составляла 500 нг/мл.16
Результатом проведенной селекции явился клон клеток A4, обладающий стабильным ростом в суспензионной культуре, морфологически и иммунофенотипически (CD3 + /CD4 + /CD7 + /CD8-/CD25-/CD38+/CD71 +/ HLA-ABC+/HLA-DR-) сходный с клетками родительской линии Jurkat. Исключение составили рецептор Fas (CD95) и молекулы адгезии и межклеточного взаимодействия CD50/ICAM-3, экспрессированные на клетках Jurkat и отсутствующие на поверхности клеток А4. Стабильно воспроизводящимся свойством клеток A4 явился повышенный уровень связывания интактными клетками Аннексина-V — признак, характерный для апоптоза и обусловленный
инверсией асимметричного липидного бислоя мембраны с экстернализацией фосфатидилсерина. Однако никаких других признаков апоптоза клетки А4 не проявляли. В полной питательной среде кинетика роста обеих линий сходна, но клетки А4 более устойчивы к снижению содержания в ростовой среде эмбриональной сыворотки.
РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ИНДУКТОРАМ АПОПТОЗА ФЕНОТИП КЛЕТОК А4
Отсутствие на клетках А4 экспрессии поверхностного «рецептора смерти» Fas должно предопределять их резистентность к апоптогенному действию лиганда FasL и МКА IPO-4. Вместе с тем полученный клон в полной мере сохранил присущую родительской линии экспрессию «рецепторов смерти» DR5 (рецептор семейства APO-2 для TRAIL) и TNFR1 (рецептор для цитокина TNF-a). Однако применение каждого из трех «лигандов смерти» не выявило никаких признаков апоптоза клеток А4.16 Анализ клеточных популяций проводили методом проточной цитометрии с использованием двойного прижизненного окрашивания клеток Аннексином-V-FITC и пропидия йодидом (PI) для выявления ранних признаков апоптоза;17 обработкой пермеабилизован-ных клеток FITC-меченными МКА к каспазе-3 для детекции начала эффекторной фазы апоптоза; анализом гиподиплоидной субпопуляции погибающих клеток в составе общей популяции17 — во всех случаях не было обнаружено признаков индуцированной цитокинами гибели клеток А4, в то время как каждый из этих лигандов активировал программу гибели клеток «дикого типа». Таким образом, резистентность клеток А4 к рецептор-опосредованному апоптозу обусловлена не отсутствием рецепции сигнала, а ниже стоящими в каскаде сигнальных реакций звеньями передачи апоптогенного стимула.
Поскольку апоптогенные сигнальные каскады от внешних и внутренних стимулов конвергируют на уровне активации «казнящих» каспаз-3, -6 и -7 с использованием общего исполнительного механизма,18 далее нами в качестве апоптогенного стимула использованы агенты и воздействия, запускающие сигнальный каскад от внутриклеточных триггеров, а именно: цитотоксические противоопухолевые лекарственные средства разных классов (адриамицин, это-позид, цисплатин, циклоплатам, метотрексат, блеомицин, цитозар, гидроксимочевина, винкристин, стауроспорин), индукторы окислительного клеточного стресса (перекись водорода, викасол), депривация ростовыми факторами среды, рентгеновское излучение и УФ-свет. Во всех случаях доля клеток с признаками индуцированного апоптоза в популяции клона А4 оказывалась достоверно и значимо (в 2—10 раз) ниже соответствующей доли апоптотически погибающих от тех же воздействий клеток Jurkat «дикого типа». Аналогично воздействию TRAIL, блеомицин не вызывает активацию каспазы-3 в клетках А4, тогда как в клетках Jurkat активность этого ключевого «исполнителя приговора» достигает максимума через 6—9 ч инкубации, повышаясь в 20 раз от фоновых значений и сохраняясь на уровне 10-кратного повышения через 24 ч инкубации (кинетическое исследование с использованием флюорогенного субстрата каспазы-3 Ac-DEVD-AMC).19
КЛЕТОЧНЫЙ КЛОН ПРИОБРЕЛ БЕССМЕРТИЕ
Из всех приведенных выше результатов следует, что апоп-тогенные стимулы самой различной природы, активирующие программу клеточной гибели опухолевых клеток Jurkat, не вызывают апоптоз клеток клона А4. Означает ли этот факт,
172
Клиническая онкогематология
Лекарственная устойчивость опухолевых клеток
что клетки А4 бессмертны? Разумеется, нет. Гибель клеток А4 наблюдается при их переносе в условия, далеко выходящие за пределы физиологической нормы и прямого физического разрушения, когда нанесенные повреждения становятся несовместимыми с жизнью. Подтверждение этому было найдено в прямом цитотоксическом тесте: клетки Jurkat и А4 инкубировали в среде, содержащей дробно повышающиеся в широком диапазоне концентрации противоопухолевых лекарственных средств и неспецифических клеточных ядов. Жизнеспособность клеток оценивали стандартным МТТ-тестом по способности восстанавливать метилтетразолий в окрашенный формазан — реакции, свойственной только живым клеткам. По соотношению количества живых клеток в экспериментальных условиях и в интактном контроле рассчитаны половинные ингибирующие концентрации (IC50) для клеток обеих линий (табл. 1).
Таблица 1. Расчетное значение IC50 некоторых противоопухолевых препаратов и токсинов для клеток линий Jurkat и А4 in vitro (n = 3-7; p < 0,05)
Препарат IC50, мкмоль/л
Jurkat A4
Доксорубицин 0,8 ± 0,2 > 100
Этопозид 3,5 ± 1,2 150 ± 50
Цисплатин 3,0 ± 1,0 150 ± 50
Винкристин 5 ± 1 > 100
Метотрексат 20 ± 5 > 500
Иринотекан 10 ± 4 100 ± 20
Идарубицин 0,1 ± 0,03 4,5 ± 1,5
Циклогексимид 0,3 ± 0,15 > 100
Гликозид индолокарбазола ЛХС-1006 0,8 ± 0,3 10,2 ± 1,5
Бисбензимид Н33342 6,5 ± 2,2 24 ± 4,5
Как видно из данных табл. 1, IC50 всех испытанных препаратов для клеток А4 на 1—2 порядка превышает таковую для родительской линии Jurkat.
Наименьшей разницей в концентрациях IC50 (10-кратная резистентность клеток А4) обладает ингибитор топоизомеразы I иринотекан и гликозид индолокарбазола ЛХС-1006 — синтезированный в лаборатории химического синтеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН структурный аналог ребеккамицина и стауроспорина, обладающий мощной ингибирующей активностью в отношении циклинзависимой киназы (Cdk1) и протеинкиназ С.20 В то же время при использовании доксорубицина, винкристина, метотрексата и циклогексимида нам не удалось реально достичь концентрации цитотоксина in vitro, вдвое снижающей биомассу живых клеток А4 в нашей постановке эксперимента. Из приведенных результатов с абсолютной очевидностью следует, что резистентность клеток линии А4 к разнообразным индукторам апоптоза полностью соответствует их фенотипу МЛУ, причем спектр лекарственных препаратов оказывается значительно шире того арсенала соединений, устойчивость к которым обусловлена повышением активности систем обратного транспорта лекарственных веществ и системы внутриклеточной детоксикации ксенобиотиков.11
СУДЬБА ПОТОМКОВ КЛЕТОК ОБЕИХ ЛИНИЙ, ПЕРЕЖИВШИХ ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АТАКУ
Клетки обеих линий в течение 2 сут выращивали в среде с ци-сплатином, адриамицином или этопозидом в концентрациях IC50, оказывающих равный биологический эффект — гибель половины соответствующей популяции, т. е. в 30—100 раз более высокой для клеток А4. Морфологический и цитометрический анализ клеточных популяций, переживших цитотоксическую атаку, показал, что клетки Jurkat погибают в
основном по механизму апоптоза: наблюдается характерная конденсация хроматина, блеббинг клеточной стенки, вакуолизация цитоплазмы, распад ядра на фрагменты, формирование апоптозных тел. Развитию апоптоза предшествует остановка клеточного цикла в одной из его сверочных точек, что выражается накоплением клеток в фазе G1 (цисплатин) или G2 (адриамицин, этопозид) (рис. 3).
Клетки А4 проявляют преимущественно некротический морфотип клеточной гибели: набухание цитоплазмы и ядра, разрыв ядерной и клеточной стенки. Наступлению гибели не предшествует накопление клеток в одной из фаз клеточного цикла, что свидетельствует об отсутствии временной остановки их деления.
Различной оказалась судьба потомков выживших в этих условиях клеток обеих линий: после посева в полную питательную среду популяция Jurkat морфологически и кинетически восстанавливается после 22 сут культивирования, хотя в культуре и наблюдается повышенный уровень гибнущих клеток. Репопуляция потомков А4 даже спустя 3 нед. культивирования сопровождается значительной гетерогенностью клеток по их форме и размеру, массированной клеточной гибелью в отсутствие внешних повреждающих факторов, что следует расценивать как образование абсолютно летальных повреждений в процессе предшествующих гибели делений. В радиобиологии такой феномен известен под названием репродуктивной гибели. Такова цена осуществления нового сценария БОЛЬШОГО ВОПРОСА.
Резюмируя изложенное выше, следует отметить, что формирование фенотипа МЛУ, связанного с устойчивостью к индукции апоптоза, не наделяет устойчивые клетки бессмертием, но позволяет им сохранить жизнеспособность в агрессивной внешней среде, если уровень такой агрессии не превосходит разумные физиологические нормы. Если же мощное токсическое воздействие вызывает в такой клетке сумму повреждений, несовместимую с жизнью, наступает клеточная гибель с проявлением некротического морфотипа.21 Потомки переживших генотоксический стресс резистентных клеток в процессе репопуляции культуры длительное время подвержены клеточной гибели, которую следует расценивать как репродуктивную, являющуюся следствием сохранения в геноме потенциально летальных повреждений, в норме подлежащих репарации (при возможности) или элиминации несущих нерепарируемые повреждения клеток.
ЧТО ИЗ ЭТОГО СЛЕДУЕТ
Известно, что клетки линии Jurkat, послужившие в качестве исходного «родительского» материала в настоящем исследовании, не экспрессируют белок р53, вследствие чего их геном достаточно лабилен и склонен к накоплению дополнительных мутаций (мутаторный фенотип).22 Вероятно, клетки А4, отобранные из общей популяции в результате Fas-опосредованной селекции, представляют собой клон спонтанно мутировавшей клетки «дикого типа», утратившей в результате такой мутации программу собственной гибели. Природа мутации (или нескольких мутаций) не установлена, но очевидны фенотипические признаки, наделяющие эти клетки адаптивными преимуществами — способностью сохранять жизнеспособность при субнекротических повреждениях. Утрата клетками А4 программы клеточной гибели приводит к двум последствиям:
• она дает возможность сохранять жизнеспособность в агрессивной среде обитания в присутствии таких высоких концентраций противоопухолевых лекарств, которые не достижимы в условиях организма, а следова-
www.medprint.ru
173
Д. Ю. Блохин
О
ГМ
О Т—
100
A
М
........ mi
101 102
FL2-Height
104
о
гм
B
М
Рис. 3. Цитометрический анализ культуры клеток Jurkat в интактном контроле (А) и после их инкубации с этопозидом (В), цисплатином (С) и доксорубицином (D). Окраска PI на содержание в клетках ДНК.17 Положение первого пика на оси интенсивности флюоресценции FL2 соответствует диплоидному набору ДНК (неделящиеся клетки G0 и делящиеся в фазе G1 цикла — красный маркер), второго пика — ее удвоенное количество (клетки в фазе G2 и митотические — зеленый маркер). Под маркером М регистрируются сигналы от клеток, содержание ДНК в которых меньше диплоидного, — гиподиплоидные клетки в состоянии апоптоза и апоптозные тела разрушенных клеток
тельно — формировать опухолевую ткань, абсолютно рефрактерную к лекарственному лечению;
• игнорирование возникающих в процессе такого лечения потенциально летальных генетических повреждений приводит к репродуктивной гибели той части потомков переживших генотоксическую атаку клеток, у которых эти повреждения в результате клеточного деления стали абсолютно летальными.
ОСНОВАНИЯ ДЛЯ ПЕССИМИЗМА
Суммируя современные представления о природе развития и молекулярных механизмах осуществления лекарственной устойчивости опухолей, следует отметить, что резистентный фенотип опухолевых клеток может формироваться в результате нескольких независимых событий, а также их сочетаний. Активация систем обратного транспорта ксенобиотиков носит адаптационно-приспособительный характер, активность систем внутриклеточной дезактивации лекарств в значительной мере обусловлена генетическими предпосылками и гистогенетическим происхождением опухолевой ткани, смена молекулярной мишени связана с селекцией популяции опухолевых клеток. Во всех этих случаях сохраняется хотя бы теоретическая возможность преодоления лекарственной резистентности: использование модификаторов проницаемости клеточной мембраны, ингибиторов АВС-транспортеров, липосомных лекарственных форм, повышение применяемой дозы или продолжительности инфузии препаратов в ряде случаев позволяют рассчитывать на клинический эффект. В конце концов, замена оказавшихся неэффективными лекарств на препараты второй и третьей линий химиотерапии могут привести к положительному результату.
Становление фенотипа МЛУ, связанного с репрессией или полной утратой опухолевыми клетками ПГК, практически не оставляет вариантов для выбора: достигнуть реактивации программы становится невозможным. На этом этапе прогрессии опухоли современные возможности консервативного лечения можно считать исчерпанными. Трудно рассчитывать и на скорый успех предполагающихся к использованию средств генной терапии опухолей, на которые в последнее десятилетие возлагаются большие надежды. Наиболее частой причиной репрессии ПГК в опухолевых клетках принято считать инактивацию белка р53 — белкового продукта опухолевого супрессора ТР53, именуемого «стражем генома» и осуществляющего остановку деления поврежденной клетки, активацию репарации ДНК и клеточной гибели при невозможности последней, а также снижение экспрессии проапоптогенных факторов Bax и Bad или гиперэкспрессию антиапоптогенных Bcl-2, Bcl-XL и IAPs. Однако полученный нами клон А4, так же как родительские клетки Jurkat, вовсе лишен белка р53 (что не мешает клеткам «дикого типа» адекватно реагировать на проводимую терапию), экспрессирует равное c «родителями» количество проапоптогенных белков Bax и Bad, а экспрессия Bcl-2 и Bcl-XL в них даже снижена.19
Поскольку клон А4 сформировался спонтанно, следует предположить, что опухолевые клетки с подобными свойствами (с утратой ПГК) могут возникать на разных этапах опухолевой прогрессии у онкологических больных как в процессе их лечения, так и независимо от него. В любом случае имеющийся арсенал специфических противоопухолевых средств оказывается бессильным перед таким клоном. Причина этого видится нам в существующей до настоящего времени методологии отбора новых потенциально противоопухолевых лекарственных средств с использованием клеток-мишеней, сохраняющих способность к программированной
174
Клиническая онкогематология
Лекарственная устойчивость опухолевых клеток
гибели. В результате такого скрининга отбираются наиболее эффективные индукторы апоптоза, не представляющие реальной опасности для опухолевых клеток, ставших не способными к последнему.
Мы полагаем, что линия А4, а также подобные ей могут оказаться полезными моделями для поиска принципиально новых противоопухолевых средств, действие которых не ограничится активацией ПГК. Одним из перспективных направлений на этом пути представляется использование приобретенного такими клетками качества игнорировать лавину возникающих генетических изменений, которые, накапливаясь в их геномах, неминуемо должны привести к генетической катастрофе, делающей их потомков нежизнеспособными. Окажется ли такое предположение верным, покажут результаты будущих исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. Блохин Д. Ю, Иванов П. К., Мечетнер Е. Б. Адресная химиотерапия онкологических больных. Рос. биотер. журн. 2007; 6(1): 89.
2. Ставровская А. А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Биохимия 2000; 65(1): 112-26.
3. Чехун В. Ф., Шишова Ю. В. Современные взгляды на механизмы формирования лекарственной устойчивости опухолей. Онкология 2000; 2(1-2): 11-5.
4. Ставровская А. А. Механизмы лекарственной устойчивости опухолевых клеток. В кн.: Канцерогенез. Д. Г. Заридзе (ред.). М.: Медицина, 2004; 558-74.
5. Штиль А. А. Развитие множественной лекарственной устойчивости как срочный ответ клетки на экзогенные воздействия. Биол. мембраны 2003; 20(3): 236-43.
6. Герасимова Г. К., Блохин Д. Ю., Яворская Н. П. Особенности действия 5-фторурацила на клетки рака яичников и меланомы человека. Эксп. онкол. 1983; 5(1): 57-61.
7. Kaufmann S. H., Earnshaw W. C. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. Exp. Cell Res. 2000; 256: 42-9.
8. Hengartner M. O. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000; 407(6805): 770-6.
9. Блохин Д. Ю. Программированная гибель клеток в механизмах циторедуктивной терапии опухолевых заболеваний. В кн.: Клиническая онкогематология. М. А. Волкова (ред.). М.: Медицина, 2007; 200-16.
10. Zhivotovsky B., Orrenius S. Defects in the apoptotic machinery of cancer cells: role in drug resistance. Sem. Cancer Biol. 2003; 13: 125-34.
11. Ставровская А. А. Резистентность больных гемобластозами к лекарственной терапии: молекулярные механизмы и проблемы преодоления множественной лекарственной устойчивости. В кн.: Клиническая онкогематология. М. А. Волкова (ред.). М.: Медицина, 2007; 246-56.
12. Полосухина Е. P., Заботина Т. Н., Шишкин Ю. В. и др. Исследование экспрессии антигена Fas(APO-1/CD95) с помощью проточной цитометрии и моноклональных антител IPO-4. Эксп. онкол. 1997; 19: 206-11.
13. Kawahara A., Ohsawa Y, Matsumura H. et al. Caspase-independent cell killing by Fas-associated protein with death domain. J. Cell. Biol. 1998; 143: 1353-60.
14. Friesen C., Herr I., Krammer P. H., Debatin K.-M. Involvement of the CD95 (APO-1/Fas) receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukemia cells. Nature Med. 1996; 2: 574-7.
15. Соколовская А. А, Заботина Т. Н., Блохин Д. Ю. и др. CD95-дефицитные клетки сублинии Jurkat/A4, устойчивые к лекарственноиндуцированному апоптозу. Эксп. онкол. 2001; 23(3): 174-80.
16. Блохин Д. Ю., Соколовская А. А, Михайлов А. Д., Эрикссон Й. Е. CD95-индуцированный апоптоз и мультирезистентный фенотип Т-лимфобластных клеток человека. Рос. биотер. журн. 2003; 2(3): 37-46.
17. Соколовская А. А, Заботина Т. Н., Московцев А. А. и др. Характеристика методов регистрации апоптоза и их использование в экспериментальной и клинической онкологии. Рос. биотер. журн. 2003; 2(3): 53-60.
18. Zamzami N., Kroemer G. The mitochondrion in apoptosis: how Pandora»s box opens. Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 2001; 2: 67-71.
19. Блохин Д. Ю., Соколовская А. А, Власенкова Н. К. и др. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток, резистентных к апоптозу. Вестн. РАМН 2007; 10: 41-5.
20. Мельник С. Я. Синтез и изучение гликозидов, производных бисин-дола и родственных индоло2,3^карбазолов. В кн.: Экспериментальная онкология на рубеже веков. М. И. Давыдов, А. Ю. Барышников (ред.). М.: ГУ РОНЦ РАМН, 2003; 281-93.
21. Блохин Д. Ю. Фенотип множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, обусловленный нарушением программы клеточной гибели. Вестн. РАМН 2004; 12: 16-20.
22. Чумаков П. М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия 2000; 65(1): 34-47.
www.medprint.ru
175
