CC BY
261
з
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
Д. Ю. Блохин, Л. В. Карпова, Н. К. Власенкова, А. А. Соколовская
СТАНОВЛЕНИЕ ФЕНОТИПА МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК МОЖЕТ ОПРЕДЕЛЯТЬСЯ ИЗМЕНЕНИЕМ СВОЙСТВ ИХ МИТОХОНДРИЙ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Полученная нами в предыдущих исследованиях клональная Т-лимфобластная клеточная линия Jurkat/A4 (Патент РФ № 2267532) обладает фенотипом множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), не связанной с гиперактивностью АВС-транспортеров. Не удается вызвать активации программы гибели этих клеток (апоптоз) никакими воздействиями, включая: применение противоопухолевых препаратов, рентгеновское облучение, окислительный стресс, депривацию ростовых факторов, воздействие цитокинов семейства TNF. Многократная эскалация дозы цитотоксического воздействия приводит к клеточной гибели по механизму некроза.
Иммунофенотип клеток Jurkat/A4 весьма сходен с набором поверхностных маркеров чувствительных к химиотерапевтическим препаратам клеток родительской линии Jurkat: клетки обеих линий одинаково экспрессируют маркеры дифференцировки, пролиферации и гистосовместимости CD3+/CD4+/CD7+/CD8-/CD38+/CD25-/CD71+/HLA-ABC+/HLA-DR-. Как было показано ранее, клетки линии Jurkat/A4 негативны по поверхностной экспрессии рецептора CD95, однако транскрипционная активность соответствующего гена в них сохранена. Нами обнаружено, что длительное культивирование Jurkat/A4 в среде без агонистических МКА анти-CD95 (агент селекции, использованный для получения данной линии клеток) приводит к восстановлению поверхностной экспрессии рецептора, но не отменяет приобретенного фенотипа МЛУ. Обнаружились кардинальные различия клеток 2 линий по экспрессии молекул адгезии ICAM-3 (CD50): 100 % клеток родительской линии экспрессируют данный антиген, а на поверхности клеток Jurkat/A4 он не обнаруживается.
Реэкспрессия рецептора CD95 на поверхности клеток Jurkat/A4 не сопровождается восстановлением сигнального пути апоптоза при стимуляции агонистическими МКА анти-CD95: их применение не приводит к активации каспазы-3, так же, как использование противоопухолевого антибиотика блеомицина. Одновременно каждое из этих воздействий через 6-9 ч активирует каспазу-3 в клетках родительской линии, максимум активности фермента наблюдается к 12 ч инкубации, повышенная активность сохраняется до 24 ч.
Известно, что в клетках II типа, к которым относится линия Jurkat, в рецептор-опосредованный сигнальный путь апоптоза вовлечен каскад активации митохондриального пути: каспаза-8 ^ Bid ^ tBid ^ митохондрии, который индуцирует падение трансмембранного потенциала митохондрий, сопровождающееся выходом в цитозоль про-апоптогенных факторов цитохрома с, Apaf-1 и AIF. Лекарственно-индуцированный апоптоз в большинстве случаев связан с митохондриальным сигнальным путем. Для детекции изменения трансмембранного потенциала митохондрий мы использовали флюоресцентный зонд JC-1, молекулы которого под воздействием высокого потенциала митохондриальных (но не плазматических) мембран склонны к димеризации, сопровождающейся сдвигом максимума флюоресценции из зеленой в красную зону спектра; падение потенциала митохондрий препятствует этому сдвигу. Обнаружено, что в отличие от митохондрий клеток Jurkat инкубация клеток Jurkat/A4 с винкристином, гидроксимочевиной или циклогексимидом не приводит к падению трансмембранного потенциала митохондрий, а цито-зар, метотрексат и блеомицин индуцируют даже гиперполяризацию митохондриальных мембран.
Вероятно, до сих пор не установленная причина мультирезистент-ного фенотипа клеток Jurkat/A4 связана с особыми свойствами их митохондриального аппарата - подобная идея уже обсуждалась в единичных научных публикациях. Дальнейшие исследования свойств
и структуры митохондрий клеток Jurkat/A4 могут пролить свет на один из молекулярных механизмов становления фенотипа МЛУ клеток злокачественных опухолей.
Д. Ю. Блохин1, Д. С. Баранов1, Н. К. Власенкова1,
А. Д. Михайлов2, А. А. Соколовская1,2 РОЛЬ ЛИПИДНЫХ МИКРОДОМЕНОВ КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЫ В ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РЕЦЕПТОРОВ СМЕРТИ CD95/FAS/APO-1
]ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2Центр биотехнологии Университета г. Турку, Финляндия
Введение. Структура плазматической мембраны клеток эукариот, организованная в форме липидного бислоя, не однородна по составу: в среде полужидкой липидной фазы имеются обособленные участки -липидные микродомены, рафты (от англ. raft - плот), отличающиеся от окружения по плавучей плотности и липидной композиции. Рафты представляют собой динамические ансамбли сфинголипидов, обогащенные холестерином, локально «цементирующим» фрагмент липидного бислоя, в связи с чем латеральная подвижность его внешнего и внутреннего листков относительно друг друга существенно ограничена. Со стороны цитозоля микродомены взаимодействуют с сократимыми элементами цитоскелета, чем обусловлена их способность сохраняться в составе клеточных остатков после мягкой солюбилизации мембран детергентами. Таким образом, рафты являются своеобразными подвижными трансмембранными платформами, способными к целенаправленным перемещениям по клеточной поверхности. С рафтами ассоциированы многие трансмембранные рецепторы, причем такая ассоциация может носить конститутивный или функциональный характер: в 1-м случае рецептор встроен в рафт (или рафт образован вокруг трансмембранного белка) постоянно, во 2-м
- транслокация рецептора или его отдельных компонентов в состав микродомена происходит после связывания со своим лигандом или перекрестной корецепции. Показано, что такая ассоциация необходима для проявления функциональной активности многих трансмембранных рецепторов: разрушение существующих микродоменов экстракцией холестерина из плазматической мембраны пре-дынкубацией клеток с метил-P-цикл о декстрином (MpCD), нистатином или филипином лишает рецепторы способности к возбуждению. И, напротив, искусственная стимуляция образования липидных микродоменов применением ET-18-OCH3 или церамидов симулирует генерацию специфического сигнала рецептора даже в отсутствие лиганда.
Цель исследования. Изучить роль липидных микродоменов в развитии CD95/Fas/APO-1-индуцированной гибели опухолевых клеток.
Материалы и методы. Линии опухолевых клеток Н-9, MCF-7 (I типа) и Jurkat (II типа), агонистические МКА анти-CD95 (клон IPO-4, не модифицированные или меченные флуорофором Cy3), DIC-конфокальная микроскопия, проточная цитометрия.
Результаты. Через 2-10 мин после начала инкубации клеток Н-9 (I типа) с МКА IPO-4/Cy3 микроскопически наблюдается кластеризация антигена CD95, его латеральный дрейф к одному из клеточных полюсов (кэппинг), а к 30 мин инкубации - интернализация рецептора, сопровождающаяся блэббингом клеточной стенки (эффекторная фаза апоптоза). Инкубация клеток Jurkat (II типа) с МКА IPO-4/Cy3 на протяжении до 60 мин обнаруживает диффузное мембранное окрашивание без развития кэппинга и интернализации.
Экстракция мембранных липидов обработкой клеток Тритоном Х-100 сохраняет CD95 в составе остатков клеток MCF-7 и сопровождается существенной потерей (до 70 %) антигена остатками клеток Jur-kat. Предынкубация интактных клеток с МКА не изменяет результата, рассчитанного по смещению модуля флюоресценции в цитомет-рическом анализе.
Предынкубация клеток MCF-7 с MpCD уменьшает долю гипо-диплоидной субпопуляции после CD95/Fas/APO-1-опосредованной индукции апоптоза (МКА IPO-4, 250 нг/мл, 24 ч),
но не влияет на долю гиподиплоидных клеток Jurkat после аналогичной стимуляции.
Выводы. CD95/Fas/APO-1-рецептор клеток Jurkat (II тип) конститутивно не ассоциирован с липидными микродоменами мембраны и не требует такой ассоциации для реализации своей активности. Напротив, клетки MCF-7 показывают высокую степень ассоциации CD95/Fas/APO-1-рецептора с липидными микродоменами, а в случае разрушения данной связи теряют чувствительность к индукторам CD95-опосредованного апоптоза.
Т. А. Богуш, А. Б. Равчеева, Е. А. Богуш, Т. А. Красноперова, Е. О. Игнатова, Г. Ю. Чемерис, Р. Ю. Раманаускайте,
Н. О. Вихлянцева, Т. Н. Заботина, З. Г. Кадагидзе НОВЫЙ МАРКЕР РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ТАМОКСИФЕНУ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ СТАТУСОМ ЭСТРОГЕНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Несмотря на стремительное развитие гормональной терапии, тамоксифен (ТАМ), один из наиболее «старых» препаратов, по-прежнему занимает лидирующую позицию в лечении рака молочной железы (РМЖ) с положительным статусом эстрогеновых рецепторов (ЭР). Ограничением эффективности ТАМ является врожденная и индуцированная резистентность, одной из причин которой считается изменение ЭР в опухоли. Определенная роль принадлежит опухолевым маркерам, в том числе Her2/neu. Однако, анализируя данные литературы, мы пришли к заключению, что по крайней мере еще одной из причин, снижающей эффективность ТАМ, может быть его конкурентное (по отношению к эстрогеновым рецепторам) взаимодействие с АВС-транспортерами, ассоциированными с множественной лекарственной резистентностью опухолей.
Материалы и методы. Гипотеза проверена на клетках эритроидно-го лейкоза человека К562, экспрессирующих АВС-транспортеры - Pgp и MRP, а также на клетках, полученных из хирургического биопсийного материала РМЖ. Взаимодействие ТАМ с Pgp и MRP оценивали методом проточной цитофлюориметрии по изменению флюоресценции клеток после инкубации с мышиными моноклональными антителами, прямо меченными фикоэритрином. Для выделения области специфической флюоресценции клетки параллельно инкубировали с изотипиче-скими антителами, меченными тем же флюорохромом.
Результаты. В модельной системе и, что наиболее важно, при исследовании РМЖ продемонстрировано зависимое от дозы взаимодействие ТАМ с Pgp и MRP. Это указывает на конкуренцию между Pgp, MRP и ЭР за связывание с ТАМ и свидетельствует об уменьшении активной внутриклеточной концентрации ТАМ, взаимодействующего с ЭР, то есть о снижении эффективности ТАМ при лечении РМЖ с экспрессией Pgp и/или MRP.
Выводы. Pgp и MRP являются неблагоприятными прогностическими маркерами эффективности ТАМ при лечении РМЖ с положительным статусом ЭР. При этом очевидно, что чем больше в клетке выявляется этих транспортных белков, тем больше должна быть их прогностическая значимость для предсказания резистентности к ТАМ. Важно подчеркнуть, что речь не идет о прогнозировании механизма лекарственной резистентности, ассоциированной с выбросом препаратов из клеток при участии АВС-транспортеров, представителями которых являются Pgp и MRP. Мы обсуждаем принципиально новый путь снижения эффективности ТАМ, который обусловлен внутриклеточной «инактивацией» ТАМ при его конкурентном связывании с Pgp и/или MRP.
Поддержано Грантом РФФИ (№ 07-04-00082-а
И. В. Буравцова, А. К. Голенков, Е. В. Катаева, Г. А. Дудина, Л. Л. Высоцкая, К. В. Седов
ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ
Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского, Москва
Введение. В настоящее время существуют данные, что при развитии гемобластозов происходит активация ангиогенеза. К числу важных факторов, регулирующих этот процесс в опухолях, относятся
факторы роста эндотелия сосудов - УЕО№, которые осуществляют свое действие на клетки благодаря взаимодействию со своими рецепторами - УЕОГКя.
Цель исследования. Изучение уровня экспрессии генов и их рецепторов у больных множественной миеломой (ММ) и сопоставление полученных данных с клиническими характеристиками.
Материалы и методы. В работе методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) была исследована экс-перессия факторов УЕОГЛ, УЕОГС и УЕОГО и их рецепторов УЕОГК.1, УЕОГК2, УЕОГКЗ. В результате исследования получены 54 образца аспирата костного мозга от 41 пациента с множественной миеломой в возрасте от 46 до 70 лет. Из аспирата получали фракцию плазматических клеток с помощью градиентного центрифугирования с фиколом, из которых выделялась суммарная РНК. После обработки сум.РНК выполнялась ПЦР со специфическими праймерами.
Результаты. На настоящий момент проанализирована экспрессия всех факторов УЕОГ и их рецепторов УЕОГКз у 16 пациентов с ММ. Из этих данных видно, что УЕОГ-А высоко экспрессирован у большинства пациентов. Гены УЕОГ-С и УЕОГ-В экспрессированы в меньшем количестве. Однако выявлена повышенная частота экспрессии УЕОГ-П: при исследовании экспрессии УЕОГК оказалось, что экспрессия УЕОГК-2 , основного рецептора УЕОГ-А, отсутствует, а экспрессия рецепторов УЕОГК-1, УЕОГК-З обнаружена во всех исследованных образцах. Показано, что УЕОГ-А активен у большинства больных, но экспрессия основного рецептора УЕОГ-А -УЕОГК-2, следовательно, аутокринная регуляция плазматических клеток этим фактором маловероятна. Но, тем не менее, учитывая высокий уровень экспрессии УЕОГ-А, можно предположить, что этот фактор способен стимулировать пролиферацию клеток эндотелия опосредованно. Впервые получены данные о различиях экспрессии УЕОГ-А и повышенной экспрессии УЕОГ-В. Возможно, УЕОГ-В является одним из аутокринных регуляторов, так как его рецептор УЕОГК-З высоко экспрессирован.
Выводы. Таким образом ММ является одним из видов гемобла-стозов, при котором активность ангиогенеза служит важным прогностическим фактором.
В. Э. Гурцевич
ОНКОГЕННЫЕ ВИРУСЫ ЧЕЛОВЕКА: ОПАСНОСТЬ РЕАЛЬНАЯ И МНИМАЯ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
О причастности вирусов к возникновению опухоли впервые сообщил американский исследователь Пэйтон Раус, доказавший в 1907 г. вирусную природу куриной саркомы. Позже опухоли вирусного происхождения были обнаружены у различных представителей животного мира, включая ископаемых. Появились и различные теории, объясняющие механизм действия онкогенных вирусов. Одна из таких теорий, послужившая основой для современных представлений о механизме вирусного канцерогенеза, была высказана еще в 1945 г. отечественным ученым Л. А. Зильбером. Она постулировала внедрение генетического материала вируса в генетический аппарат клетки, в результате чего нормальная клетка превращалась в злокачественную. Среди первооткрывателей онкогенных вирусов у животных следует назвать и нашего соотечественника профессора Н. П. Мазуренко. На мышиной модели им впервые была показана способность инфекционных вирусов активировать латентно персистирующий у этих животных вирус лейкоза мышей.
В настоящее время доказано, что среди опухолей человека примерно 15-20 % составляют опухоли вирусного происхождения. Одним из наиболее ярких представителей вирусов, вызывающих такие опухоли, является герпесвирус Эпштейна-Барр (ВЭБ). С ним связано возникновение как некоторых доброкачественных, так и злокачественных новообразований, таких, как лимфома Беркитта, лим-фома Ходжкина, неходжкинские лимфомы, рак носоглотки, определенные формы рака желудка и др. Доказано, что механизм ВЭБ-ассоциированного канцерогенеза обусловлен функционированием генов латентной инфекции вируса. Белки, кодируемые этими генами, способны оказывать модифицирующее действие на сигнальные пути клетки. Наибольший вклад в трансформирующее действие вируса вносит латентный мембранный белок LMP1 (кодируемый одноименным геном, LM.P1), признанный в настоящее время в ка-
честве вирусного онкогена. Другими не менее яркими представителями онкогенных вирусов человека являются папилломавирусы (ППВ)16-го и 18-го типов, вызывающие рак шейки матки. Установлено, что трансформирующими потенциями у этих вирусов обладают, как и у ВЭБ, гены латентной инфекции, в основном Е6 и Е7, в меньшей степени Е5. Каждый из этих генов вносит свой вклад в нарушение сигнальных путей в инфицированной клетке, выражающийся в усилении ее пролиферативной активности и накоплении в ней генетических изменений. Механизм действия этих генов сводится к угнетению функционирования клеточных генов р53 и рЯЬ, контролирующих процессы пролиферации и апоптоза мутировавших клеток. В докладе будут представлены возможные сценарии возникновения новообразований, ассоциированных с ВЭБ и ППВ 16/18 типов, факторы, способствующие проявлению их онкогенных потенций, а также современные представления о профилактике и лечении этих новообразований.
С. В. Дидук, К. В. Смирнова, Н. А. Шалгинских СИКВЕНСНЫЙ АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА ЬИР1 ВИРУСА ЭПШТЕЙНА-БАРР У БОЛЬНЫХ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ В РОССИИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Герпесвирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) - этиологический агент ряда новообразований человека, в том числе доброкачественных и злокачественных. Один из белков латентной инфекции ВЭБ, латентный мембранный белок 1 (ЬМР1), кодируемый одноименным геном ЬЫР1, признан вирусным белком-онкогеном. Молекулярный анализ LM.P1 различного клинического и географического происхождения позволил обнаружить варианты гена с разными типами мутаций, способных привести к изменению его биологической активности.
Задача исследования. Поскольку информация о штаммовых различиях LMP1 ВЭБ, персистирующих в России, отсутствует, были проведены сиквенирование и сиквенсный анализ образцов LMP1, амплифицированных из биологического материала российских больных различными лимфопролиферативными ВЭБ-ассоциированными заболеваниями и здоровых лиц. При этом представлялось важным выявить среди часто встречающихся аминокислотных замен мутации, критические для возникновения изучаемой патологии.
Материалы и методы. Опухолевый биопсийный материал, а также образцы крови и слюны (частично) от одних и тех же больных ЛХ и НХЛ; а также образцы крови от больных ИМ и доноров крови. Из собранного клинического материала выделяли ДНК, проводили амплификацию и сиквенирование фрагментов гена LMP1 ВЭБ.
Результаты. 1) практически полностью отсутствуют варианты, имеющие замены аминокислот в ^терминальной цитоплазматической области и в первых трансмембранных доменах молекулы LMP1; 2) полностью отсутствует мутация G212S (замена глицина на серин в 212 положении); 3) случаи Сао-подобной делеции 30 п.н. в СТАЯ-2-домене С-концевой области LМР1 являются спорадическими, редко выявляемыми; 4) во всех образцах LMP1 присутствует мутация F106Y (фенилаланин на тирозин), кроме двух случаев, отнесенных к классическому прототипу LМРl-95-8.
Выводы. Таким образом, варианты LMP1 российского происхождения, представляют собой смешанную гетерогенную группу, среди которых встречаются как ранее охарактеризованные, так и предположительно новые генетические варианты. В то же время специфическая ассоциация между определенными российскими вариантами LMP1 и конкретными нозологическими формами болезни (ИМ, ЛХ и НХЛ) нами не обнаружена.
Работа осуществлялась при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант № 04-0448249а.
Е. Л. Кадырова
ЭКСПРЕССИЯ КЛЕТОЧНЫХ АПОПТОТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ БОЛЬНЫХ САРКОМОЙ КАПОШИ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Экспериментальные исследования саркомы Капоши (СК) способствуют улучшению терапии этого васкулярного онкологического заболевания вирусного происхождения.
Задача исследования. Изучить экспрессию ряда клеточных апоп-тотических белков в опухолевой ткани больных СК разных клинических стадий.
Материалы и методы. Изучено 25 образцов опухолевой ткани от 17 ВИЧ-негативных больных СК, в 64 % случаев ассоциированных с HHV-8: 1-я группа содержала 13 образцов от больных СК начальной стадии (пятна, бляшки); 2-я группа - 12 образцов от больных СК продвинутой стадии (узлы, узелки и опухоль). В качестве контроля были изучены 9 образцов ткани от больных с различными эндотелиальными патологиями доброкачественной природы (3-я группа). Экспрессию и локализацию белков исследовали методом ИГХ на 4-5 мм формалин-фиксированных парафиновых срезах. Использованы следующие моно- и поликлональные антитела к CD95/FASR (IC0160; РОНЦ); Bcl-2, FasL, p53, Ki67/KiS5, Bax (DAKO Corp.).
Результаты. ИГХ-исследования показали, что с прогрессией СК: 1) экспрессия всех тестированных нами клеточных апоптотических маркеров значительно варьирует в опухолевых образцах, возможно, отражая прежде всего иммунный статус пациента, его генетические особенности и стадию/подстадию развития злокачественного процесса; 2) экспрессия изучаемых белков в эндотелиальных и веретеновидных клетках уменьшается примерно вдвое. В то же время пролиферативный индекс во 2-й группе возрастает в 1,5 раза; 3) при анализе всех тканевых структур только для 2 апоптотических маркеров разных сигнальных путей (bcl2, FASR), а также индекса пролиферации Ki67 мы наблюдали изменение степени экспрессии.
Выводы. Полученные данные позволяют предположить, что наиболее важным для оценки агрессивности патологического процесса при СК является анализ экспрессии 3 маркеров: анти-апоптотического белка bcl-2, про-апоптотического клеточного антигена FASR (CD95) и ядерного показателя пролиферации клеток Ki67. Последний маркер, как было показано ранее другими исследователями для ряда опухолей, связан с общей выживаемостью пациентов. Выявление экспрессии клеточных апоптотиче-ских белков, особенно bcl-2 и FASR, на таких тканевых структурах, как эпидермис, строма, кератиноциты, волосяные сосочки, железистые структуры и др., возможно, отражает их паракринное воздействие на веретеновидные клетки, что способствует прогрессии СК.
А. В. Лихтенштейн
ГЕНОДИАГНОСТИКА РАКА: ПРОБЛЕМЫ, ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Генодиагностика злокачественных новообразований - новое направление, возникшее на стыке экспериментальной и клинической онкологии: достижения фундаментальных исследований трансформируются в решение важных практических задач. Теоретической предпосылкой генодиагностики рака является то обстоятельство, что канцерогенез есть результат последовательного накопления в соматических клетках организма мутаций нескольких (от 4 до 12) функционально важных генов, участвующих в клеточной пролиферации, апоптозе и репарации ДНК. Повреждение их тем или иным способом ведет к «асоциальному» поведению клетки и формированию опухолевого очага. Таким образом, обнаружение в различных биологических средах организма измененных нуклеотидных последовательностей этих генов (т.е., ДНК-маркеров) - свидетельство присутствия в нем трансформированных клеток. Важное отличие опухолевых ДНК-маркеров от известных и широко используемых в клинике маркерных белков (альфа-фетопротеин и др.) - онкоспецифичность (т.е., непосредственная, причинно-следственная, а не косвенная связь с канцерогенезом) и универсальность (нет опухолевой клетки без того или иного генетического дефекта). Поиск ДНК-маркеров опухолевого роста служит разным целям: диагностике, мониторингу (оценка эффективности лечения, своевременное обнаружение рецидивов и метастазов) и скринингу (выявление процесса на доклинической его стадии, формирование групп риска). Рассматриваются теоретические предпосылки этого направления, его перспективы и требующие решения проблемы.
Н. Н. Мазуренко
МУТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ В ДИАГНОСТИКЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Злокачественные новообразования являются результатом генетических и эпигенетических изменений, нарушающих регуляцию деления и дифференцировки клетки и приводящих к возникновению клеточного клона со способностью к независимой пролиферации, инвазии и метастазированию. Открыты десятки генов, мутации в которых определяют генетическую предрасположенность к различным онкологическим заболеваниям. Особое место занимают онкогены, мутации которых приводят к таким круциальным изменениям в системе передачи сигналов, что их определение является строгим и достаточным маркером диагностики и прогноза онкологического заболевания. В качестве примера будут рассмотрены результаты исследования мутаций у больных стромаль-ными опухолями желудочно-кишечного тракта, для которых характерна корреляция между типом и локализацией мутации в генах К1Т и РВОГК-а и морфологической характеристикой опухоли, ее локализацией, клиническим течением и ответом на тар-гетную терапию. Результаты молекулярных исследования стро-мальных опухолей свидетельствуют о том, что они составляют группу близкородственных новообразований. Аналогичная зависимость существует между присутствием и локализацией мутации в гене ЕОГК и гистологическими, клиническими характеристиками и результатами лечения немелкоклеточного рака легкого. Можно надеяться, что в ближайшие годы молекулярногенетический анализ войдет в практику клинических онкологических учреждений.
Т. А. Раевская, Л. В. Татьяненко, С. А. Гончарова, Н. П. Коновалова
ОДИН ИЗ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ 1ЧО-ДОНОРОВ НА ЛЕКАРСТВЕННУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОПУХОЛЕЙ - ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИЮ ТРАНСПОРТНЫХ МЕМБРАНОСВЯЗАННЫХ ФЕРМЕНТОВ
Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка
Введение. Оксид азота (N0) участвует в регуляции многочисленных процессов жизнедеятельности, имеет отношение к различным патологиям, в том числе к опухолевому росту, ангиогенезу, метаста-зированию, противоопухолевому иммунитету. Установлен факт участия N0 в регуляции внутриклеточной концентрации ионов Са2+. Изучению взаимосвязи оксида азота и лекарственной резистентности посвящено лишь небольшое число исследований. Так, в клетках с фенотипом множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) в ряде случаев наблюдается повышенное содержание ионов Са2+. Ранее нами было показано, что доноры оксида азота в эксперименте отдаляют развитие лекарственной устойчивости лейкоза Р388 мышей к циклофосфану, а также значительно повышают чувствительность МЛУ-опухолей к низким неэффективным дозам традиционных противоопухолевых препаратов. Мы предположили, что одной из причин наблюдаемого нами модулирующего действия доноров оксида азота на МЛУ могут являться изменения концентрации ионов кальция, связанные в том числе с функционированием транспортных мембраносвязанных ферментов, одним из которых является Са2+-зависимая М§2+-активируемая АТФаза.
Материалы и методы. Определение активности Са2+-АТФазы проводили на Са2+-АТФазе саркоплазматического ретикулума, выделенного из мышц кролика, а также из опухолевых клеток лейкоза РЗ88 мышей. Исследовали гидролитическую (ГФ) и транспортную (ТФ) функции Са2+-АТФазы. В качестве донора N0 использовали 3,3-бис(нитроксиметил)оксетан (NM0). ГФ фермента определяли по удельной скорости образования неорганического фосфата. Трансмембранный перенос ионов Са2+ определяли по удельной скорости переноса этих ионов, активность Са2+-АТФазы - по кинетике изменения рН среды, активность фермента рассчитывали из угла наклона кинетической кривой. О скорости изменения концентрации ионов Са2+ судили по времени их полного поглощения везикулами сарко-плазматического ретикулума, что ведет к прекращению реакции гидролиза АТФ.
Результаты. Изучение влияния NMO на активный транспорт ионов кальция в мышечных клетках показало, что наблюдается торможение ТФ фермента, при этом зависимость от концентрации не выражена. NMO подавляет также гидролитическую функцию Ca2+-АТФазы: при высокой концентрации NMO (10-4 М) происходит существенное торможение ГФ (на 33 %), а с уменьшением концентрации NMO эффект торможения снижается.
В опухолевых клетках под действием NMO также наблюдается значительное торможение транспорта ионов Ca2+: на 37 % при большой концентрации NMO, а при понижении концентрации донора NO торможение ТФ Ca2+ -АТФазы несколько снижается.
Торможение ГФ фермента в опухолевых клетках убывает с уменьшением концентрации NMO.
Выводы. Полученные данные свидетельствуют о том, что в присутствии донора оксида азота NMO происходит торможение гидролиза АТФ и транспорта Ca2+. Возможно, наблюдаемое влияние донора NO на функционирование Ca2+-АТФазы является причиной, вызывающей изменение внутри- и внеклеточного баланса ионов кальция, что может быть одним из механизмов модулирующего действия NMO на лекарственную устойчивость опухолей.
А. В. Смирнова, М. И. Лукашина, К. Д. Никитин, И. Н. Михайлова, Л. Ю. Арустумян, Е. В. Огородникова,
Л. В. Демидов, А. Ю. Барышников ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ ЭКСПРЕССИИ МОЛЕКУЛ HLA I И II КЛАССОВ В АКТИВАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ.
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Успехи иммунологии и молекулярной биологии дают основание рассматривать иммунотерапию как один из перспективных методов лечения злокачественных новообразований. Так, в качестве одного из методов иммунотерапии меланомы были предложены вакцины на основе опухолевых клеток. Ранее в нашем центре были получены линии клеток меланомы человека, различающиеся по экспрессии на их поверхности молекул HLA I и II классов.
Цель исследования. Изучение потенциальной иммуногенности клеток линии меланомы кожи, различающихся по экспрессии HLA I и II классов.
Материалы и методы. В реакции в качестве клеток-респондеров использовали МПК здоровых доноров в количестве 5х106 клеток в лунке, а в качестве клеток-стимуляторов - опухолевые клетки в количестве 2,5х105. Опухолевые клетки обрабатывали митомицином С. МПК и опухолевые клетки совместно культивировали 5 сут. Отрицательным контролем служили клетки-респондеры, культивируемые в тех же условиях без опухолевых клеток. Иммуногенность оценивалась в смешанной опухолево-лимфоцитарной реакции по изменению экспрессии поверхностных маркеров активации (CD25, CD71, CD95, HLA-DR).
Результаты. Было установлено достоверное увеличение уровня экспрессии маркера CD71rn МПК при культивировании с опухолевыми клетками c фенотипом HLA I+/II+ или HLA I+/II- по сравнению с контролем. CD25 достоверно увеличивался вне зависимости от экспрессии HLA-антигенов на опухолевых клетках. Имеется тенденция к увеличению экспрессии HLA-DR на клетках-респондерах, культивировавшихся с линией, несущей оба класса молекул HLA.
Выводы. На основании полученных результатов можно предположить, что наиболее высокая иммуногенность характерна для клеточной линии меланомы с фенотипом HLAI+/II+. Для дальнейшего уточнения механизмов активации противоопухолевого ответа требуются дополнительные исследования.
Е. В. Степанова
ХАРАКТЕРИСТИКА АНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА IN VIVO
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Ангиогенез - формирование новых микрососудов из уже существующих в ткани капилляров. Экспериментальные исследования in vivo, иммуногистохимические и биохимические исследования различных опухолей человека, проведенные в том числе и нами, неод-
нократно демонстрировали зависимость роста опухоли и метаста-зирования от ангиогенной активности первичного очага. Однако было обнаружено, что ангиогенез - не единственный способ кровоснабжения опухоли. В некоторых случаях опухолевые клетки способны сами, без участия эндотелиальных клеток формировать каналы, по которым течет кровь (т.н. васкулярная мимикрия). Мы наблюдали признаки васкулогенной мимикрии как в опухолях человека (меланомы кожи, саркомы мягких тканей), так и на экспериментальных моделях опухолей in vivo (SK-BR-3, SKOV-3 и др.).
В большинстве случаев разработка новых методов лекарственной терапии злокачественных опухолей, в том числе антиангиогенной, затруднена из-за отсутствия адекватных экспериментальных моделей для оценки эффективности препаратов направленного действия. Используемые на сегодняшний день опухолевые модели характеризуются небольшим количеством стромального компонента опухоли и соответственно сниженным ангиогенезом, что затрудняет оценку эффективности препаратов, блокирующих взаимодействие опухолевых и эндотелиальных клеток.
Интерес к изучению веществ, обладающих антиангиогенной активностью, способствовал разработке новых экспериментальных моделей in vivo, способных разграничить противоопухолевый и антиангиоген-ный эффект препарата. В общем случае анализ количества CD31- и/или CD34-положительных сосудов в ткани контрольной и опытных групп поможет оценить антиангиогенный эффект тестируемого препарата в «традиционных» экспериментах по изучению in vivo противоопухолевой активности препарата на трансплантируемых мышам опухолях.
Использование адекватных моделей опухолей для тестирования противоопухолевой активности препаратов in vivo позволит эффективно оценивать вклад антиангиогенного компонента в общий механизм противоопухолевого действия препарата.
Е. В. Степанова, Э. Ш. Соломко, А. Ю. Барышников ОЦЕНКА АНТИАНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
Молекулярно-биологические достижения в экспериментальной онкологии позволили создать новую стратегию лечения злокачественных новообразований: антиангиогенную терапию (ААТ). Она направлена на блокирование образования новых микрососудов в опухоли, препятствуя ее дальнейшему росту и прогрессии. Одной из особенностей анти-ангиогенной терапии является ее цитостатический эффект. В большинстве исследований показано, что использование такой терапии приводит к задержке роста опухоли, а не к ее регрессии.
Особенности противоопухолевого действия антиангиогенной терапии потребовали развития новой методологии проведения скрининга веществ на способность блокировать ангиогенез. Среди обязательных методов скрининга in vitro таких веществ - изучение цито-токсического и антипролиферационного действия, влияния на миграцию и формирование капилляроподобных структур на культуре эндотелиальных клеток. Антиангиогенное действие препарата подтверждается методами in vivo: тесте Майлса и по блокированию ангиогенеза в имплантанте Матригеля. При изучении противоопухолевой активности на трансплантированных мышам опухолях необходимо проводить анализ количества CD31- и/или CD34-положительных сосудов в ткани контрольной и опытных групп. Только комплексное изучение in vitro и in vivo позволит адекватно оценить антиангиогенный эффект препарата.
В Российском онкологическом научном центре изучается анти-ангиогенная активность различных фракций, выделенных из экстрактов растений. В качестве культуры эндотелиальных клеток была использована клеточная линия SVEC-4-10, полученная из эндотел иальных клеток мыши, трансформированная вирусом SV-40. Исследования позволили выделить несколько фракций растений, обладающих антиангиогенной активностью в некоторых антиан-гиогенных тестах.
Н. М. Сураева, А. В. Самойлов, А. Ю. Барышников ТРАНСФЕКЦИЯ IN VITRO ГОНАДНЫХ КЛЕТОК КУР БАКТЕРИАЛЬНЫМ ГЕНОМ Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ
ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
В последние годы наиболее интенсивно развиваются методы трансгенеза с использованием технологии получения долгосрочной культуры половых эмбриональных клеток.
В качестве потенциальных клеток-мишеней для внедрения чужеродной ДНК в половую линию кур могут быть использованы первичные половые клетки (ППК) из гонад на 25-27 стадии развития зародыша.
С целью разработки оптимальных параметров трансфекции первичных премордиальных клеток (ППК) была получена первичная культура гонадных клеток. При плотности популяции клеток 80-50 тыс на лунку 96-луночной плашки формировался монослой стро-мальных клеток в течение 3 сут, а при плотности 10-20 тыс. на лунку
- в течение 10 сут.
Трансфекцию культуры гонадных клеток плазмидой с геном бактериальной Р-галактозидазы проводили с помощью липофектанта ОТ-56 в течение 3 ч и после отмывки клеток культивировали в течение суток. Затем после окраски раствором Х-§а1 оценивали эффективность трансфекции культуры. Самый высокий уровень трансфекции (25-30 %) наблюдался при концентрации гена 0,2-0,5 мкг на 200 мкл среды. Увеличение или уменьшение концентрации липофектанта в 2-3 раза по сравнению с предложенным фирмой-изготовителем количеством не влияло на уровень трансфекции. При культивировании клеток в течение 10 сут уровень трансфекции не снижался, и ППК сохраняли одну из основных своих характеристик - наличие гранул гликогена, которые были выявлены с помощью ШИК-реакции.
Экспрессия чужеродного гена была обнаружена после инъекции 2,5-дневным эмбрионам суспензии культивируемых трансфециро-ванных гонадных клеток в гонадах 6-дневных химерных эмбрионов в виде окрашенных кластеров клеток.
Таким образом, была показана возможность получения химерных зародышей птицы, экспрессириющих чужеродный ген, после трансфекции культивируемых ППК из гонад куриц.
М. Л. Филиппенко1, А. Ф. Лазарев2, В. Д. Петрова2,
Е. В. Пешковский1 ,О. В. Мишукова1, Т. В. Синкина2,
И. А. Селезнёва2, Ю. Н. Димитриади2,Н. А. Зарубина2,
С .А. Терехова2
ОТСУТСТВИЕ АССОЦИАЦИИ МЕЖДУ ПОЛИМОРФИЗМОМ ^О1 И РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У ПОПУЛЯЦИИ ЖЕНЩИН СИБИРИ
1 Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск
2Алтайский филиал ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Барнаул
Введение. NQ01-2-электронная хиноноксидоредуктаза - фермент 2 фазы биотрансформации ксенобиотиков. Это ФАД-связанный белок образует гомодимеры и превращает хинон в гидрохинон. Такая ферментная активность предотвращает одноэлектронное восстановление хинона, которое приводит к образованию свободных радикалов. Мутации в гене NQ01, связанные с поздней дискинезией, увеличивают риск гематотоксичности при воздействии бензола и восприимчивость к различным формам рака. Генетический полиморфизм NQ01 - это замена С (цитиди-на) на Т (тимидин) в основании пары 609 экзона 6, который кодирует замещение пролина серином в белке NQ01. Эта мутация приводит к потере активности NQ01. Ранее докладывалось, что дикие типы NQ01 увеличивают риск аденокарцином легкого среди мужчин-курильщиков на Тайване. Ассоциация P187S - полиморфизма с развитием рака молочной железы была обнаружена в исследованиях 2 независимых популяций (Тироль, Австрия; Прага, Чехия) (Меп/е1 е! а1., 2004).
Задача исследования. Установить, влияет ли полиморфизм в гене NQ01 на риск развития рака молочной железы в популяции женщин Сибири.
Материалы и методы. Исследование проводилось методом «случай - контроль»: случай - 203 больных раком молочной железы, контроль - 182 пациентки без онкологической патологии. Генотипирование для определения полиморфизма гена NQ01 проводилось с использованием РСЯ-амплификации с набором праймеров 5’-ACGCTAGCTCTGAACTGATTCTCT-3’ и 5’_TTTTCTCCTCATCCTGTACCTCT-3\ РСК-амплифицированные
соединения растворялись с HinfI и анализировались с помощью электрофореза на 2,5%-ном агарозном геле.
Результаты. У лиц с генотипом CC по сравнению с имеющими генотип ТТ относительный риск (хи2=0,04, р=0,84) составил 1,116 (0,376-3,311).
Выводы. Таким образом, полученные результаты показывают, что полиморфизм P187S в гене NQO1 не влияет на риск развития рака молочной железы в популяции женщин Сибири.
А. А. Фильченков1, М. П. Завелевич1, Л. М. Куява1,
Н. М. Храновская2
АКТИВАЦИЯ КАСПАЗЫ-3
И УСИЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА BAX
БЕЗ МАССОВОЙ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА
В КЛЕТКАХ ХРОНИЧЕСКОГО
МИЕЛОЛЕЙКОЗА
ПРИ ДЕЙСТВИИ КВЕРЦЕТИНА
1Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии НAН Украины, Киев 2Институт онкологии AМН Украины, Киев
Введение. Среди многочисленных агентов, способных индуцировать апоптоз и/или дифференцировку клеток лейкозов, особенное внимание в последнее время привлекают различные агенты природного происхождения, в том числе полифенолы. В отличие от противоопухолевых химиопрепаратов, они относительно нетоксичны в диапазоне концентраций, при которых вызывают дифферен-цировку или апоптоз. Внутриклеточные мишени действия этих соединений на геномном и протеомном уровнях только начинают выясняться.
Цель исследования. Изучение уровня экспрессии активных форм каспаз-3, -8, -9 и проапоптотического белка Bax, а также анализ апопто-за и дифференцировки в клетках линии К-562 при действии кверцетина.
Материалы и методы. Исследования проводили на линии К-562 перевиваемых клеток хронического миелолейкоза человека. Уровень апоптоза и распределение клеток по фазам клеточного цикла определяли с помощью проточной цитометрии клеток, окрашенных йодистым пропидием. Экспрессию исследуемых белков анализировали методом проточной цитометрии и вестерн-блоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител. Дифференцировку клеток оценивали морфологически и по количеству бензидин-положительных клеток.
Результаты. Культивирование клеток К-562 с кверцетином в концентрации до 40 мкмоль/л не вызывало массового апоптоза (не выше 10 %). При этом отмечалось значительное увеличение клеток в G2/M фазе клеточного цикла (до 40 %). Одновременно было отмечено 20%-ное увеличение количества бензидин-положительных клеток, начиная с 3-х суток культивирования с препаратом. При действии кверцетина отмечено появление активной формы каспазы-3, которое не сопровождалось активацией каспазы-9 или -8. При этом наблюдается значительное увеличение количества клеток, экспрессирующих Bax (на 35 %).
Выводы. Таким образом, действие кверцетина на клетки К-562 сопровождается появлением активной формы каспазы-3 и увеличением экспрессии Вах без массовой индукции апоптоза и при отсутствии появления активных форм каспаз-9 и -8. Полученные данные указывают
на возможность модуляции полифенолами дифференцировки клеток К-562 воздействием на компоненты эффекторного звена апоптоза.
Е. В. Хорошева1, Г. К. Герасимова1, О. Л. Калия2 ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПОРТА ТЕРАФТАЛА В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ
}ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Москва
Введение. Терафтал (ТФ) (4,5-октакарбоксифталоцианин кобальта) синтезирован в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и в настоящее время проходит 2-ю фазу клинических испытаний в составе каталитической системы ТФ+аскорбиновая кислота в качестве нового средства для лечения злокачественных опухолей. Высокая молекулярная масса (1077,4) и сложная планарная структура ТФ создают трудности для его проникновения в клетку. Ранее мы показали, что в течение первых 30 мин инкубации ТФ поверхностно связывается с плазматической мембраной опухолевых клеток, не проникая в ее липидный бислой. Через 2-3 ч инкубации ТФ обнаруживается внутри клеток в основном во фракции лизосом и пероксисом. Мы предположили, что ТФ после связывания с мембраной транспортируется внутрь клетки в мембранном пузырьке, так как известно, что транспорт крупных молекул внутрь клетки происходит посредством эндоцитоза.
Цель исследования. Установление механизма транспорта ТФ в опухолевые клетки.
Материалы и методы. В работе использовали культуру опухолевых клеток эритролейкоза человека К562. Процесс поступления ТФ в клетку изучали с использованием гидрофобного флюоресцентного зонда ТМА-DPH (2х10'6М) - маркера поверхности плазматической мембраны в живых клетках. При эндоцитозе площадь поверхностной мембраны уменьшается, что приводит к снижению интенсивности флюоресценции (1а) зонда. Кинетику процесса оценивали по изменению на протяжении 3,5 ч инкубации клеток с ТФ (10'8-10'6 М). Измерение 1а проводили на спектрофлюориметре НіїасМ F4010 при Ех=350 пт и Ет=430 пт. Коэффициент поляризации зонда вычисляли для Хтах= 430 нм.
Результаты. Установлено, что значение коэффициента поляризации зонда в процессе инкубации клеток с препаратом ТФ не меняется, т.е. ТФ не встраивается в липидный бислой плазматической мембраны и не влияет на микроокружение зонда. В то же время в процессе инкубации с ТФ отмечается постепенное падение 1а зонда, что свидетельствует об уменьшении площади клеточной мембраны, характерное для процесса эндоцитоза. В контрольных пробах (без ТФ) 1я не уменьшается. При концентрации ТФ 10'8М падение 1я происходит в 2 раза интенсивнее, чем при более высокой концентрации препарата (10'6М): на 40 % и 20 % соответственно.
Выводы. Снижение 1а встроившегося в клеточную мембрану зонда при введении ТФ в среду инкубации опухолевых клеток свидетельствует о том, поступление ТФ в клетку происходит путем эндо-цитоза, и при низкой концентрации ТФ (10'8М) этот процесс происходит более интенсивно.
Работа выполнена в рамках НТП «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» 2004-2006 гг.
