CC BY
134
УДК 577.24
Решение
«жизнь-или-смерть»
в системе CD95:
основные про-и антиапоптозные модуляторы
И. Лаврик#, П. Краммер Отдел Иммуногенетики, Немецкий Центр Исследований Рака, Гейдельберг, Германия # e-mail: i.lavrik@dkfz-heidelberg.de
РЕФЕРАТ Апоптоз (программируемая клеточная смерть) является неотъемлемым свойством многоклеточных организмов. Существует два основных сигнальных пути инициации апоптоза: т.н. внешний, передаваемый через рецепторы смерти (death receptors, DR), и внутренний (митохондриальный). CD95 (Fas/APO-1) является одним из рецепторов смерти. Данный обзор посвящен механизмам передачи сигнала апоптоза через CD95 (Fas/APO-1) и свойствам ключевых белков апоптоза, содержащих эффекторный домен смерти (Death Effector Domain, DED): про-апоптотического белка прокаспазы-8 и анти-апоптотического белка (c-FLIP). Нарушение передачи сигнала апоптоза характерно для многих болезней, в т. ч. и для аутоимунных заболеваний, а также для рака и СПИДа, поэтому изучение апоптоза имеет важнейшее значение для борьбы с этими заболеваниями.
ВВЕДЕНИЕ
Передача сигнала через CD95.
Белок CD95 (называемый также APO-1, Fas, fas antigen, TNFRSF6 и APT1) является представителем семейства рецепторов смерти, которое, в свою очередь, входит в состав суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей [1]. Цитоплазматическая часть рецепторов смерти содержит т. н. домены смерти (Death Domain, DD) [2, 3]. Домен смерти - это структурный мотив длиной около 80-100 аминокислотных остатков, который играет важную роль в передаче сигнала апоптоза. Домен смерти вместе с эффекторным доменом смерти (DED) и доменом активации и рекрутирования каспазы (CARD, caspase recruitment domain) по структурным характеристикам объединяют в суперсемейство домена смерти. Каждый их этих мотивов способен участвовать в т. н. гомотипических или однотипных белок-белковых взаимодействиях. При гомотипическом или однотипном взаимодействии домен смерти взаимодействует с другим доменом смерти (соответственно, CARD c CARD;
DD c DD) за счет шести антипараллельных а-спиральных участков, которые входят в состав этих структурных мотивов.
Инициация апоптоза через рецептор CD95 происходит при связывании CD95 лиганда, CD95L (CDl78) [4] или агонистических антител, таких как анти-АРО-l [5], с рецептором. При этом на клеточной мембране происходит формирование рецепторного комплекса, называемого сигнальным комплексом, индуцирующего клеточную смерть (death-inducing signaling complex, DISC) [6]. DISC состоит из рецепторов, которые, вероятно, образуют олигомерные структуры, белка-адаптера FADD/MORTl (Fas-Associated Death Domain, Fas-ассоциированный домен смерти), про-каспазы-8 (FLICE, MACH, Mch5), прокаспазы-lO и белка с-FLIP (cellular FLICE inhibitory proteins, клеточные белки-ингибиторы FLICE) (рис. 1) [7-9]. Все белок-белковые взаимодействия в комплексе DISC основаны на гомотипических контактах. Белок-адаптер FADD связывается с рецептором CD95 за счет взаимодействий между доменами смер-
ч
4ІІп
Caapase-вПО
Г;! : | Dvdlh DOrndm ГоЕ’ОІ Death ЕПмїог Оогтчіа
Рис.1. Сигнальный комплекс, индуцирующий клеточную смерть (death-inducing signaling complex, DISC). DISC состоит из CD95 (изображено желтым), белка-адаптера FADD/MORT1 (Fas-Associated Death Domain, Fas-ассоциированный домен смерти) (изображено светло-голубым), про-каспазы-8/10 (изображено зеленым) и белка с-FLIP (cellular FLICE inhibitory proteins, клеточные белки-ингибиторы FLICE) (изображено фиолетовым). Домен смерти (DD) показан красным, эффекторный домен смерти (DED) показан светло-желтым
ти. Поскольку FADD также содержит эффекторный домен смерти, DED, именно за счет взаимодействий этого домена с DED доменами прокаспазы-8, прокаспазы-10 и с-FLIP происходит связывание в рецепторный комплекс DISC данных белков. После связывания в рецепторный комплекс прокаспаза-8 подвергается аутопротелитической активации с образованием активной формы каспазы-8. На следующих этапах апоптоза каспаза-8 расщепляет эффек-торные каспазы-3, -6 и -7. При этом происходит активация каспаз-3, -6 и -7. За этим следует расщепление субстратов каспаз, которые представляют собой сотни клеточных белков, необходимых для нормального функционирования клетки. Их разрушение приводит к гибели клетки.
Белки комплекса DISC, содержащие эффекторный домен смерти, DED, играют центральную роль в регуляции апоптоза. Активация прокаспазы-8 в комплексе DISC завершается образованием активного гетеротетрамера каспазы-8, который инициирует апоптоз. Белок с-FLIP при связывании в комплекс DISC имеет противоположную функцию, а именно, он ингибирует активацию каспазы-8 в комплексе DISC, и, таким образом, ингибирует инициацию апоптоза. Таким образом, соотношение между двумя DED-белками, прокаспазой-8 и с-FLIP в комплексе DISC определяет решение «жизнь/смерть». Далее мы подробно остановимся на механизмах про- и антиапоптотического действия DED-белков прокаспазы-8 и с-FLIP.
прокаспаза-8-про-апоптотический белок КОМПЛЕКСА DISC: ПРЕДСТАВИТЕЛь СЕМЕйСТВА КАСПАЭ
Прокаспаза-8 (FLICE, MACH, Mch5) принадлежит к семейству каспаз [7, 10]. Каспазы (caspases, от англ. cystei-nyl aspartate specific proteases) - семейство цистеиновых
аспартат-специфичных протеаз, экспрессируются в клетке как неактивные зимогены, содержащие три основных участка: N-концевой домен (продомен) варьирующей длины, большую субъединицу (р20) и малую субъединицу (р10). Каспазы активируются в результате протеолитического расщепления после остатков аспартата, которые находятся между продоменом и малой и большой субъединицей (рис. 2)
[11]. Образующаяся активная каспаза представляет собой гетеротетрамер, состоящий из двух больших (~20 ^a) и двух малых субъединиц (~10 ^a), р102-р202. Субстратами каспаз являются многие белки, которые вовлечены в апоптоз и воспалительные процессы. По структурно-функциональным характеристикам выделят три группы каспаз (рис. 3) [11]. Каспазы с большим продоменом называют инициаторными и делят на две группы: каспазы, инициирующие процессы воспаления (группа I), и каспазы, инициирующие апоптоз (группа II). К третьей группе (группа III) относят каспазы с коротким продоменом (20-30 аминокислотных остатков), которые получили название эффекторных каспаз.
Прокаспазы обычно присутствуют в клетке как неактивные зимогены, однако при запуске апоптоза они подвергаются протеолизу, за которым следует их активация
[12]. Эффекторные каспазы активируются другими каспа-зами. Инициаторные прокаспазы активируются при взаимодействии нескольких инициаторных прокаспаз в т. н. инициаторных белковых комплексах. Все инициаторные каспазы содержат домен из суперсемейства домена смерти: DED или CARD. Благодаря наличию такого домена каспазы связываются в соответствующий инициаторный белковый комплекс. Прокаспазы-8 и -10 характеризуется наличием двух DED, следующих друг за другом, а про-каспазы-1, -2, -4, -5, -9, -11 и -12 содержат CARD домен (рис. 3). Именно за счет гомотипических взаимодействий между CARD или DED доменами прокаспазы связываются в инициаторные комплексы, в которых происходит их активация.
Прокаспаза-8 активируется в комплексе DISC [13]. Установлено, что в комплексе DISC присутствуют две изоформы прокаспазы-8 (прокаспаза-8а и прокаспаза-8Ь) [14]. Эти две
Рис. 2. Cхема активации прокаспазы. Расщепление прокаспазы после остатков аспартата приводит к образованию активной каспазы, представляющей гетеротетрамер р^-р202. Показаны остатки, участвующие в формировании активного центра
изоформы очень близки по структуре: оба белка содержат два следующих друг за другом DED домена, а также каталитические субъединицы р18 и р10 (рис. 4). Прокаспаза-8а содержит дополнительный фрагмент (2 ^a (15 а.о.)), который образуется в результате трансляции экзона 9. Данный фрагмент располагается между вторым DED и большой субъединицей. Две изоформы отличаются на 2 ^a по молекулярному весу: прокаспаза-8а - это приблизительно 55 ^a (р55), а прокаспаза-8Ь - это 53 кДa (р53). Показано, что для активации прокаспазы-8 необходима пространственная сближенность и определенная взаимная ориентация между молекулами прокаспазы-8 в комплексе DISC, что способствует аутокаталитической активации прокаспа-зы-8 [15]. При этом комплекс DISC служит своеобразной платформой, которая позволяет создать условия для пространственной сближенности для молекул прокаспазы-8. Данная модель активации прокаспазы-8 получила название «индуцированной близости». Ряд экспериментальных данных показывает необходимость олигомеризации прока-спазы-8 для активации в рецепторном комплексе, что подтверждает модель «индуцированной близости». [16]. Более того, было показано, что активация прокаспазы-8 происходит при образовании димеров, состоящих из двух молекул прокаспазы-8 [17]. Расщепление прокаспазы-8 в комплексе DISC происходит в два этапа (рис. 4) [14, 18]. На первом этапе, расщепление после аспартата (положение 374) приводит к образованию двух продуктов расщепления: р43/р41 и р12. На втором этапе расщепление происходит по позициям 216 и 384, что приводит к появлению продомена р26/р24, большой р18 и малой субъединиц р10. В результате образуется активный гетеротетрамер каспазы-8, р102-р182, который и запускает апоптоз [19].
c-flip-анти-апоптотический белок КОМПЛЕКСА DISC: ИНГИБИТОР ПРОКАСПАзы-8
Белок с-FLIP (cellular FLICE inhibitory proteins, клеточные белки-ингибиторы FLICE), известный также как FLAME-1/I-FLICE/CASPER/CASH/MRIT/CLARP/Usurpin,
£іф-1 і
ІЧЕ*НІ. ЙН. ПО Січ» * ОСІ^-Я YV*
L'rtp-1 і ітілмі
Си»-11
Ємр-1»
Сг«и> її
Слі.р-3 ІЙН-1)
С-»+р4 IFUCC МАСИ. №*б|
|Ю£ U44, МсЛ Щ
С*і#1іі,МсМ|
Group III
С*чі 3 |Y§nm. Ш|Х»РМ1|
С.*р4 іЬкпГд
Сшр-Г 0СМЛН РА=ЛЛ £kJ*+lJ
і 1 CARD
DEO
, ч^З# с-шум МММ
шшл игл! плLi!с Eifc-j-J
Рис. 4. Схема двух этапов протеолиза прокаспазы-8. Прокаспаза-8а/Ь показана зеленым, эффекторный домен смерти (DED) показан светло-желтым
является ингибитором апоптоза, запускаемого через рецепторы смерти [9, 20-24]. К настоящему моменту известно пять белков с-FLIP (рис. 5): три изоформы и два продукта расщепления. Три изоформы с-FLIP включают:
' (S, short, короткая)
с-FLIP^^L, long, длинная), c-FLIP,
Рис. 3. Три группы каспаз. Группа I: каспазы, инициирующие процессы воспаления. Группа II: каспазы, инициирующие апоптоз. Группа III: эффекторные каспазы. Показаны: эффекторный домен смерти (DED), домен активации и рекрутирования каспазы (CARD), а также большая субъединица (р20) и малая субъединица (р10)
и c-FLIPRaji (Raji, раджи) (рис. 5). Все три изоформы содержат эффекторный домен смерти, DED, за счет которого они связываются в комплекс DISC. При этом короткие изоформы c-FLIPS и c-FLIPR ингибируют активацию про-каспазы-8 в комплексе DISC, что приводит к ингибированию апоптоза. Длинная изоформа ^FLIPl способна играть как про-, так и антиапоптотическую функцию в комплексе DISC. При низких концентрациях ^FLIPl катализирует активацию прокаспазы-8, исполняя, таким образом, про-апоптотическую роль, а при высоких концентрациях блокирует апоптоз, как и антиапоптотические белки c-FLIPS и c-FLIPR [25, 26]. Проапоптотическая роль ^FLIPl согласуется с данными, полученными при исследовании мышей с применением технологии генетического нокаута, которые показали, что мыши в отсутствие гена c-FLIP погибают через 11 дней эмбрионального развития [27].
Также было охарактеризовано два продукта расщепления белков c-FLIP: p43-FLIP и p22-FLIP [9, 24]. Показано, что p43-FLIP является продуктом протеолитического расщепления изоформы c-FLIPl. Образование p43-FLIP происходит в комплексе DISC в результате каталитического расщепления прокаспазой-8 по остатку аспартата 376 белка c-FLIPl. Показано, что p22-FLIP является продуктом протеолитического расщепления всех трех изоформ: c-FLIPl, c-FLIPs и c-FLIPRno остатку аспартата 196. р22-FLIP образуется в цитозоле при действии прокаспазы-8, независимо от индукции рецепторов смерти и образования комплекса DISC. Кроме того, было установлено, что р22-FLIP способен активировать фактор транскрипции NF-xB, который, в свою очередь, регулирует транскрипцию ряда анти-апоптотических генов, ингибирующих апоптоз. Активация происходит на уровне IKK комплекса при связывании p22-FLIP с комплексом IKK, при этом детальный механизм действия белка p22-FLIP в комплексе IKK пока является объектом исследований.
ded-содержащие белки как регуляторы жизни и смерти
DED-содержащие белки прокаспаза-8 и с-FLIP регулируют инициацию апоптоза, а также NF-kB [6]. В комплексе DISC, образованном на клеточной мембране, взаимодействия между DED-содержащими белками регулируют инициацию апоптоза: прокаспаза-8 активируется и запускает апоптоз. Белки c-FLIP блокируют активацию прокаспазы-8 и тем самым ингибируют апоптоз (рис. 6, левая часть). Единственное исключение составляет длинная изоформа с-FLIP^ которая, как уже упоминалось, может инициировать апоптоз в маленьких концентрациях. Таким образом, в комплексе DISC белок прокаспаза-8 имеет проапоптотическую функцию, а белок с-FLIP - антиапоптотическую.
В цитозоле, интересным образом, взаимодействия между DED-содержащими белками регулируют инициацию другого сигнального пути, а именно, NF-kB. При этом, в отличие от комплекса DISC, в цитозоле прокаспаза-8 обладает антиапоптотической функцией. Как же это происходит? Недавно было установлено, что прокаспаза-8 в цитозоле даже в отсутствие сигнала апоптоза расщепляет с-FLIP до фрагмента р22-FLIP, который, как было упомянуто выше, способен индуцировать NF-kB (рис. 6, правая часть). Прокаспаза-8 при этом не подвергается процессингу, который происходит в комплексе DISC, а использует свою т. н. прокаспазную, или проэнзиматическую, активность, которая отличается от каталитической активности активного гетеротетрамера активной каспазы. Вероятно, что расщепление с-FLIP до фрагмента р22-FLIP происходит при образовании гетеродимерного комплекса
Рис. 5. Схема белков с-FLIP. Показаны три изоформы белка с-FLIP и два продукта расщепления. Эффекторный домен смерти (DED) показан светложелтым. Остатки аспартата, расщепление по которым приводит к образованию p43-FLIP и p22-FLIP, выделены красным цветом
Рис. 6. DED-содержащие белки прокаспаза-8 и с-FLIP в цитозоле и в комплексе DISC. с-FLIP блокирует активацию прокаспазы в комплексе DISC (правая сторона). В цитозоле происходит образование гетеродимерного комплекса между белками: прокаспаза-8 и с-FLIP (левая сторона) приводящее к образованию p22-FLIP, который, в свою очередь, активирует фактор транскрипции NF-kB, который активирует транскрипцию ряда антиапоптотических генов, ингибирующих апоптоз
между белками: прокаспаза-8 и с-FLIP. При этом уровни экспрессии в клетке белков прокаспазы-8 и с-FLIP определяет количество фрагмента р22-FLIP и, соответственно, уровень индукции NF-kB, который, в свою очередь, регулирует транскрипцию ряда антиапоптотических генов, ингибирующих апоптоз.
Таким образом, соотношения между DED-содержащими белками в клетке являются ключевым фактором определяющим уровень устойчивости к апоптозу, и, таким образом, баланс между «жизнью» и «смертью». При этом важное значение для принятия этого решения между «жизнью» и «смертью» имеет внутриклеточная локализация DED-содержащих белков. В комплексе DISC прокаспаза-8 имеет только проапоптотическую функцию, а белок с-FLIP ингибирует ее активацию, в то время как в цитозоле белок с-FLIP, используя каталитическую активность прокаспа-зы-8, расщепляется до фрагмента р22-FLIP и активирует NF-kB (рис. 6). Таким образом, в цитозоле оба белка прока-спаза-8 и с-FLIP имеют антиапоптотическую активность. Дальнейшее изучение различных взаимодействий между DED-содержащими белками в цитозоле и в комплексе DISC, приводящих к индукции различных сигнальных путей, является задачей будущих исследований.
Список литературы
1. Krammer, P. H. (2000) Nature 407, 789-95
2. Tartaglia, L. A., Ayres, T. M., Wong, G. H., and Goeddel, D. V. (1993) Cell 74, 845-853
3. Weber, C. H. and Vincenz, C. (2001) Trends Biochem Sci 26, 475-81
4. Suda, T., Takahashi, T., Golstein, P., and Nagata, S. (1993) Cell 75, 1169-78
5. Trauth, B. C., Klas, C., Peters, A. M., Matzku, S., Moller, P., Falk, W., Debatin, K. M., and Krammer, P. H. (1989) Science 245, 301-5
6. Krammer, P. H., Arnold, R., and Lavrik, I. N. (2007) Nat.Rev.Immunol. 7, 532-542
7. Muzio, M., Chinnaiyan, A. M., Kischkel, F. C., O'Rourke, K., Shevchenko, A., Ni, J., Scaffidi, C., Bretz, J. D., Zhang, M., Gentz, R., Mann, M., Krammer, P. H., Peter, M. E., and Dixit, V. M. (1996) Cell 85, 817-27
8. Sprick, M., Rieser, E., Stahl, H., Grosse-Wilde, A., Weigand, M., and Walczak, H. (2002) Embo J 21, 4520-4530
9. Scaffidi, C., Schmitz, I., Krammer, P. H., and Peter, M. E. (1999) J Biol Chem 274, 1541-8
10. Salvesen, G. S. (2002) Cell Death Differ 9, 3-5
11. Fuentes-Prior, P. and Salvesen, G. S. (2004) Biochem.J. 384, 201-232
12. Nicholson, D. W. (1999) Cell Death and Differentiation 6, 1028-1042
13. Medema, J. P., Scaffidi, C., Kischkel, F. C., Shevchenko, A., Mann, M., Krammer, P. H., and Peter, M. E. (1997) Embo J 16, 2794-804
14. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., and Peter, M. E. (1997) J Biol Chem 272, 26953-8
15. Salvesen, G. S. and Dixit, V. M. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96, 10964-7
16. Boatright, K. M., Renatus, M., Scott, F. L., Sperandio, S., Shin, H., Pedersen, I. M., Ricci, J.
E., Edris, W. A., Sutherlin, D. P, Green, D. R., and Salvesen, G. S. (2003) Mol Cell 11, 529-41
17. Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., and Yang, X. (2003) Embo J 22, 4132-42
18. Golks, A., Brenner, D., Schmitz, I., Watzl, C., Krueger, A., Krammer, P. H., and Lavrik, I. N. (2006) Cell Death.Differ. 13, 489-498
19. Lavrik, I., Krueger, A., Schmitz, I., Baumann, S., Weyd, H., Krammer, P. H., and Kirchhoff, S. (2003) Cell Death Differ 10, 144-5
20. Thome, M., Schneider, P., Hofmann, K., Fickenscher, H., Meinl, E., Neipel, F., Mattmann, C., Burns, K., Bodmer, J. L., Schroter, M., Scaffidi, C., Krammer, P. H.,
Peter, M. E., and Tschopp, J. (1997) Nature 386, 517-21
21. Budd, R. C., Yeh, W. C., and Tschopp, J. (2006) Nature Reviews Immunology 6, 196-204
22. Krueger, A., Baumann, S., Krammer, P. H., and Kirchhoff, S. (2001) Mol Cell Biol 21, 8247-54
23. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., and Lavrik, I. N. (2005) J.Biol. Chem. 280, 14507-14513
24. Golks, A., Brenner, D., Krammer, P. H., and Lavrik, I. N. (2006) Journal of Experimental Medicine 203, 1295-1305
25. Chang, D. W., Xing, Z., Pan, Y., Algeciras-Schimnich, A., Barnhart, B. C., Yaish-Ohad, S., Peter, M. E., and Yang, X. (2002) Embo J 21, 3704-3714
26. Micheau, O., Thome, M., Schneider, P., Holler, N., Tschopp, J., Nicholson, D. W., Briand, C., and Grutter, M. G. (2002) J Biol Chem 277, 45162-71
27. Yeh, W. C., Itie, A., Elia, A. J., Ng, M., Shu, H. B., Wakeham, A., Mirtsos, C., Suzuki, N., Bonnard, M., Goeddel, D. V., and Mak, T. W. (2000) Immunity 12, 633-42
