CC BY
12
Анестезиология и реаниматология 2019, №2, с. 67-74
https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201902167
Russian Journal of Anaesthesiology and Reanimatology
2019, №2, pp. 67-74 https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201902167
Применение левосимендана и фосфокреатина в целях коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда: экспериментальное исследование ex vivo
© Е.А. СЕНОКОСОВА1, С.С. КРУТИЦКИЙ1, Е.А. ВЕЛИКАНОВА1, А.В. ЦЕПОКИНА1, А.А. КУЗЬМИНА1, В.М. ТРЕТЬЯК2, С.В. ДЕНИСОВА2, О.В. ГРУЗДЕВА12, Л.В. АНТОНОВА1, Е.В. ГРИГОРЬЕВ12
'ФГБНУ «Научно-исследовательскии институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболевании», Кемерово, Россия; 2ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный медицинский университет» Минздрава России, Кемерово, Россия
Левосимендан и экзогенный фосфокреатин являются потенциально эффективными лекарственными препаратами, которые применяются с целью коррекции клеточной энергетической недостаточности, вызванной ишемией и реперфузией миокарда. Цель исследования — изучить фармакологические эффекты левосимендана и экзогенного фосфокреатина на модели глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца крысы в условиях 4-часового кардиоплегического ареста. Материал и методы. Перфузия изолированных сердец самцов крыс линии Wistar проводилась по методу Langendorff. Сформированы три группы исследования. В 1-ю опытную группу (ЛС) включены сердца крыс (n=7) с фармакологической поддержкой левосименданом, во 2-ю опытную группу — сердца крыс (n=7) с поддержкой экзогенным фосфокреатином (ЭФК), в контрольную группу — сердца крыс (n=7), на которые не оказывали дополнительное фармакологическое воздействие. В исходной точке, на 10-й и 30-й минутах реперфузионного периода производили регистрацию физиологических показателей изолированного сердца, флуоресценцию восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАДН), определяли выход в перфузионный раствор маркеров повреждения миокарда и продуктов оксидативного стресса. Статистический анализ проводили, применяя критерии Вилкоксона и Манна—Уитни (уровень значимости р<0,05).
Результаты. Скорость коронарного протока в исследуемые точки реперфузионного периода поддерживалась на исходном уровне только в группе ЛС — 12 (10,2; 15) мл/мин. Давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ), в группе ЛС на 10-й минуте достигло 136,5 (128; 139) мм рт.ст., к 30-й минуте снизилось до 77 (69; 81) мм рт.ст. В группе ЭФК на 10-й минуте ДРЛЖ достигло 103 (99; 110) мм рт.ст., к 30-й минуте снизилось до 71,5 (68; 75) мм рт.ст. и в каждой точке значения в опытных группах были статистически значимо выше (p<0,05) значений в контрольной группе: на 10-й минуте ДРЛЖ достигло 32,5 (29; 40) мм рт.ст., к 30-й минуте снизилось до 39 (36; 42) мм рт.ст. Ферментативная активность аспартатаминотрансферазы во всех исследуемых группах на 10-й и 30-й минутах реперфузии статистически значимо (p < 0,04) превысила исходный уровень, равный 1 (1; 1) Ед/л. Концентрация оксида азота (NO) в группе ЭФК на 10-й минуте реперфузионного периода статистически значимо (р=0,046) снизилась по сравнению с исходным уровнем и была равна 20,9 (11,8; 24,3) мкмоль/л и также статистически значимо (р=0,032) ниже значений контрольной группы — 21,3 (13; 30) мкмоль/л. Флуоресценция НАДН во всех исследуемых группах в реперфузионном периоде была статистически значимо ниже (p<0,03) по сравнению с исходным уровнем флуоресценции, равным 0,579 (0,404; 0,972) усл.ед. При добавлении в перфузионный раствор в периоде реперфузии левосимендана достигнуты вазодилатирующий и инотропный эффекты. При добавлении экзогенного фосфокреатина — мембраностабилизирующий эффект, обеспечено поддержание фосфотранспортной системы. Антиок-сидантный эффект обоих веществ не выражен. Функционирование ферментативного комплекса дыхательной цепи во всех исследуемых группах в равной степени нарушено.
Выводы. Левосимендан и экзогенный фосфокреатин способствуют постишемическому восстановлению ряда показателей ишемизированного миокарда. Требуется проведение дополнительных экспериментов с коррекцией дозы вышеуказанных препаратов или с их использованием совместно с антиоксидантом.
Ключевые слова: ишемия—реперфузия миокарда, левосимендан, экзогенный фосфокреатин.
Сенокосова Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-9430-937X Крутицкий С.С. — https://orcid.org/0000-0001-5378-7466 Великанова Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-1079-1956 Цепокина А.В. — https://orcid.org/0000-0002-4467-8732 Кузьмина А.А. — https://orcid.org/0000-0002-4807-7686 Третьяк В.М. — https://orcid.org/0000-0003-1135-9839 Денисова С.В. — https://orid.org/0000-0002-8290-0752 Груздева О.В. — https://orcid.org/0000-0002-7780-829X Антонова Л.В. — https://orcid.org/0000-0002-8874-0788 Григорьев Е.В. — https://orcid.org/0000-0002-3898-0740
Автор, ответственный за переписку: Сенокосова Е.А. — ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», 650002, Кемерово, Россия. e-mail: [email protected]
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Сенокосова Е.А., Крутицкий С.С., Великанова Е.А., Цепокина А.В., Кузьмина А.А., Третьяк В.М., Денисова С.В., Груздева О.В., Антонова Л.В., Григорьев Е.В. Применение левосимендана и фосфокреатина в целях коррекции ишемических и реперфузионных повреждений миокарда: экспериментальное исследование ex vivo. Анестезиология и реаниматология. 2019;2:67-74. https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201902167
РЕЗЮМЕ
Levosimendan and phosphocreatin administration for correction of myocardial ischemic — reperfusion injury: experimental research ex vivo
E.A. SENOKOSOVA1, S.S. KRUTITSKIY1, E.A. VELIKANOVA1, A.V. TSEPOKINA1, A.A. KUZMINA1, V.M. TRETYAK2, S.V. DENISOVA2, O.V. GRUZDEVA12, L.V. ANTONOVA1, E.V. GRIGORIEV12
'Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia; 2Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia
ABSTRACT
Background. Levosimendan and exogenous phosphocreatine are potentially effective drugs for correction of cellular energy deficiency caused by myocardial ischemia and reperfusion.
Aim — to analyze the effects of levosimendan and exogenous phosphocreatine by using of a model of global ischemia — reperfusion of an isolated rat's heart under 4-hour cardioplegia. Material and methods. Langendorff heart perfusion was applied in Wistar rats ($). There were 3 groups: LS group (n=7) — levosimendan administration in reperfusion period; EPC group (n=7) — exogenous phosphocreatine; control group (n=7) — pharmacological support was excluded. Physiological variables of an isolated heart, fluorescence of a reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), markers of myocardial injury and products of oxidative stress in perfusion solution were determined at baseline, after 10 and 30 min of reperfusion. Wilcoxon and Mann—Whitney tests (significance level p£0,05) were used for statistical analysis.
Results. Coronary blood flow velocity in reperfusion period was maintained at baseline only in the LS group (12.0 (10.2; 15.0) ml/min). In the LS group, left ventricular pressure after 10 min was 136.5 (128.0; 139.0) mm Hg and decreased up to 77.0 (69.0; 81.0) mm Hg after 30 min. In the EPC group the same values were 103.0 (99.0; 110.0) and 71.5 (68.0; 75.0) mmHg, respectively. These data were significantly higher than in the control group (32.5 (29.0; 40.0) and 39.0 (36.0; 42.0) mm Hg after 10 and 30 min, respectively). Aspartate aminotransferase activity after 10 and 30 min of reperfusion was significantly (p<0.04) higher than baseline values (1.0 (1.0; 1.0) U/l). In the EPC group, NO concentration after 10 min of reperfusion was significantly (p=0.046) lower compared with baseline values (20.9 (11.8; 24.3) ^mol/l) and those in the control group (21.3 (13.0; 30.0) ^mol/l, p=0.032). NADH fluorescence in reperfusion period was significantly lower (p<0.03) in comparison with baseline values (0.579 (0.404; 0.972) in all groups. Conclusion. Levosimendan and exogenous phosphocreatine contribute to post-ischemic recovery of some myocardial characteristics. It is necessary to conduct further researches with dose adjustment and additional administration of antioxidant.
Keywords: myocardial ischemia-reperfusion, levosimendan, exogenous phosphocreatine.
Senokosova E.A. — https://orcid.org/0000-0002-9430-937X Krutitskiy S.S. — https://orcid.org/0000-0001-5378-7466 Velikanova E.A. — https://orcid.org/0000-0002-1079-1956 Tsepokina A.V. — https://orcid.org/0000-0002-4467-8732 Kuzmina A.A. — https://orcid.org/0000-0002-4807-7686 Tretyak V.M. — https://orcid.org/0000-0003-1135-9839 Denisova S.V. — https://orcid.org/0000-0002-8290-0752 Gruzdeva O.V. — https://orcid.org/0000-0002-7780-829X Antonova L.V. — https://orcid.org/0000-0002-8874-0788 Grigoriev E.V. — https://orcid.org/0000-0002-3898-0740
Corresponding author: Senokosova E.A. — junior researcher at the laboratory of cell technologies Research Institute for Complex Issues of cardiovascular diseases. e-mail: [email protected]
TO CITE THIS ARTICLE:
Senokosova EA, Krutitskiy SS, Velikanova EA, Tsepokina AV, Kuzmina AA, Tretyak VM, Denisova SV, Gruzdeva OV, Antonova LV, Grigoriev EV. Levosimendan and phosphocreatin administration for correction of myocardial ischemic - reperfusion injury: experimental research ex vivo. Russian Journal of Anaesthesiology and Reanimatology = Anesteziologiya IReanimatologiya. 2019;2:67-74. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201902167
На сегодняшний день хирургия открытого сердца в условиях искусственного кровообращения является одним из основных способов лечения различных социально важных сердечно-сосудистых заболеваний. Одновременно сохраняется и высокая потребность в поддержке жизнеспособности донорских органов для последующей трансплантации, так как именно трансплантация является ведущим способом решения проблемы терминальной недостаточности сердца. В обоих случах миокард временно лишается системного коронарного кровотока и подвергается ишемии и реперфузии, что зача-
стую приводит к возникновению различных осложнений (послеоперационный станнинг, синдром малого сердечного выброса, постперфузионные нарушения ритма) [1]. В итоге патологические изменения в миокарде не только ухудшают послеоперационное восстановление, но и влияют на функционирование других органов в силу воздействия результирующего синдрома малого сердечного выброса на формирование гипоперфузионной полиорганной недостаточности [2]. В связи с изложенным тема кардиопротекции как вариант профилактики ишемиче-ского и реперфузионного повреждений миокарда весь-
ма актуальна. Рассматривая ее в ракурсе эксперимента, в первую очередь следует обратить внимание на спектр препаратов, способных обеспечить фармакологический вариант кардиопротекции, а также отметить специфику построения этапов моделирования ишемии и реперфузии в эксперименте.
Одним из последствий процесса ишемии органов, в том числе миокарда, является нарушение переноса электронов в дыхательной цепи и обусловленная этим невозможность реализации митохондриальным аппаратом важнейшей задачи — синтеза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ). Установлено, что митохондрии кардиомиоцитов продуцируют данную макроергическую молекулу аэробным путем в количестве, более чем в 15 раз превышающем массу сердца [3]. В условиях ишемии при переходе метаболического пути образования энергии на анаэробный гликолиз возникает дефицит АТФ с дальнейшим усугублением его синтеза в сочетании с нарушением работы ионных каналов [4, 5] и возможным индуцированием апоптоза кардиомиоцитов [6].
С позиции обоснования коррекции вероятной клеточной энергетической недостаточности представляется актуальным уточнение в процессе экспериментального исследования фармакологических эффектов таких препаратов, как левосимендан и экзогенный фосфокреатин.
Получено достаточное количество данных о левоси-мендане, который используют для лечения при острой сердечной декомпенсированной недостаточности; этот препарат оказывает инотропное, вазодилатирующее, кардиопротективное, а также антиоксидантное и противовоспалительное действие [7—11]. Кардиопротектив-ный эффект левосимендана проявляется в регулировании АТФ-чувствительных калиевых каналов митохондрий кардиомиоцитов, что приспосабливает ферментативные комплексы дыхательной цепи к потребности клеток в АТФ [12]. Известно, что на фоне сложности и многообразия клинических случаев левосимендан не всегда является действенным препаратом [13]. Для сравнения выбрано вещество, также влияющее на процессы энергетического баланса в ткани миокарда.
Проведенный F. Mingxing и соавт. [14] метаанализ результативности применения фосфокреатина для восстановления сердечной деятельности по сравнению со стандартным лечением включал 26 рандомизированных исследований с участием 1948 пациентов. Установлено, что при применении фосфокреатина снижалась частота ин-траоперационной инотропной поддержки, случаев аритмий, повышалось количество эпизодов спонтанного восстановления сердечного ритма после декомпрессии аорты. Фосфокреатин вызывает ряд эффектов в отношении ише-мизированного миокарда: устанавливает баланс потребления АТФ, стабилизирует клеточную мембрану, а также обладает антиоксидантными свойствами. Фосфокреатин является компонентом фосфотранспортной системы, играющей одну из ключевых ролей в обеспечении энергетических потребностей миокарда [15]. Фосфокреатин с участием креатинкиназы отдает фосфатные группы адено-зиндифосфату, в результате чего происходит образование АТФ в местах ее утилизации — это миофиламенты, сарко-плазматический ретикулум, клеточная мембрана и другие структуры [16]. Доказано, что фосфокреатин истощается одним из первых при развитии ишемии, поэтому восполнение его запасов представляется перспективным направлением в обеспечении миокарда энергией [17].
Таким образом, каждый из описанных выше препаратов оказывает достаточно мощное фармакологическое действие. Однако в мировой литературе не освещены вопросы использования указанных препаратов при проведении экспериментальной кардиоплегической ишемии миокарда. Напомним, это состояние является необходимым как при проведении ряда операций на открытом сердце, так и при доставке донорского органа к месту трансплантации.
Цель исследования — изучить фармакологические эффекты левосимендана и экзогенного фосфокреатина на модели глобальной ишемии и реперфузии изолированного сердца крысы в условиях 4-часового кардиопле-гического ареста.
Материал и методы
Эксперименты проведены с использованием здоровых взрослых самцов крыс линии Wistar (средняя масса 300+50 г). Животные содержались в стандартных условиях вивария без ограничения в пище и воде. Эксперименты и процедуры над лабораторными животными проведены в соответствии с правилами Европейской конвенции (Страсбург, 1986).
Группы сравнения
В 1-ю опытную группу (ЛС) включены сердца крыс (n=7) с фармакологической поддержкой левосименданом, во 2-ю опытную группу — сердца крыс (n=7) с поддержкой экзогенным фосфокреатином (ЭФК), в контрольную группу (n=7) — сердца крыс, на которые не оказывали дополнительное фармакологическое воздействие.
Перфузия по Langendorff
Животным проводили анестезию путем введения тио-пентала натрия (25 мг на 1 кг массы тела) внутрибрюшин-но. Посредством торакотомии вырезали сердце и немедленно погружали его в раствор Кребса—Хензеляйта (T=4 °С). Далее в аорту вводили канюлю и сердце подключали к системе перфузирования с подачей стандартного раствора Кребса—Хензеляйта, обогащенного смесью газов — 95% O2 и 5% CO2; рН 7,3—7,4; Т 37—38 °С, при постоянном давлении 80 см вод.ст.
Протокол перфузии
Адаптивная перфузия — 20 мин; кардиоплегия (20 мл/ч) охлажденным (4 °С) кардиоплегическим раствором Кусто-диол («Dr. F.KOHLER CHEMIE, GmbH», Германия) 8 мин; глобальная кардиоплегическая ишемия 240 мин; реперфу-зия 30 мин. Сердца группы ЛС в начальные 8 мин реперфузии перфузировали раствором Кребса—Хензеляйта, в который добавляли препарат с действующим веществом левосимендан симдакс («Orion Corporation», Финляндия). Пересчет начальной дозы препарата производили с учетом массы сердца, она составила 0,014 нг на 2+0,2 г массы сердца крысы. Сердца группы ЭФК перфузировали аналогично, добавляя в перфузионный раствор препарат с действующим веществом фосфокреатин неотон («Alfa Wassermann», Италия). Пересчет дозы производили аналогичным образом, она составила 5,7 нг на 2+0,2 г массы сердца крысы.
Исследуемые параметры
На исходной точке, на 10-й и 30-й минутах реперфузионного периода регистрировали скорость коронар-
ного протока (СКП, мл/мин), частоту сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин), давление, развиваемое левым желудочком (ДРЛЖ, мм рт.ст.), при помощи аппарата для физиологических исследований МР36 («Biopac Systems, Inc», США). Активность ферментов креатинфосфокина-зы — миокардиальной фракции (КФК-МБ, Ед/л), лак-татдегидрогеназы (ЛДГ, Ед/л), аспартатаминотрансфера-зы (АСТ, Ед/л) определяли методом ферментативной кинетики на автоматическом биохимическом анализаторе Konelab 30i («Thermo Fisher Sсientific», Финляндия). Концентрацию сердечного белка, связывающего жирные кислоты (сБСЖК, нг/мл), и тропонина I (Troponin I, пг/л) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием специальных наборов — «Hycult biotech», США и «CUSABIO BIOTECH Co., Ltd», КНР соответственно. Количественное содержание перекиси и оксида азота (NO2) установлено ИФА-исследованиями при помощи специальных наборов «Biomedica» (Австрия) и «Research & Diagnostics Systems, Inc.» (США).
Регистрация динамики флуоресценции одного из основных участников окислительного метаболизма — восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) осуществлена на комплексе многофункциональной лазерной диагностики ЛАКК-М («ООО НПП Лазма», Россия) в доишемическом периоде (исходная точка), на 10-й и 30-й минутах реперфузионного периода.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica 6.0. Наличие разницы в регистрируемых показателях определяли с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уит-ни и критерия Вилкоксона. Различия между группами принимали статистически значимыми при р<0,05. Применена поправка Бонферрони на множественные сравнения. Данные в разделе «Результаты» представлены как медиана Me (Q25; Q75) в виде графиков, а также в виде полученных
значений в исследуемом диапазоне или конкретной точке: доишемический уровень (Исх) и реперфузионный период 10—30-я минуты (РП 10'—30') или 10-я и 30-я минуты (РП 10' и РП 30').
Результаты
СКП в группе «ЛС» составила 13,2 (8,8; 16,7)—11,75 (8,6; 14,1) мл/мин и в 1,7 раза превысила исходные значения в контрольной группе — 7 (5,1; 12)—6,6 (5,5; 10) мл/мин и значения в группе ЭФК — 8 (6,2; 10,3)—7,3 (5,7; 10,5) мл/мин в реперфузионном периоде (рис. 1, а).
ЧСС в контрольной группе составила 297,5 (290; 303) уд/мин (^=0,02), в группе ЛС — 162,5 (155,5; 188) уд/мин ^=0,03) и на 10-й минуте реперфузионного периода статистически значимо отличалась от доишемических значений. Значения ЧСС в опытных группах имели статистически значимые различия с показателями контрольной группы в периоде экспериментальной реперфузии. ДРЛЖ в группах ЛС и ЭФК (см. рис. 1, в) соответственно достигло 10'— 30': 136,5 (128; 139) — 77 (69; 81) мм рт.ст. и 10'— 30': 103 (99; 110) — 71,5 (68; 75) мм рт.ст., что было статистически значимо выше ^<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе — 10'— 30': 32,5 (29; 40) — 39 (36; 42) мм рт.ст. в исследуемых точках возобновленной перфузии миокарда.
Выход АСТ в оттекаемый от сердца перфузионный раствор (рис. 2, а) во всех исследуемых группах на всех исследуемых точках в периоде реперфузии статистически значимо ^<0,04) превысил исходные значения, равные 1 (1; 1) Ед/л. В группе ЛС ферментативная активность ЛДГ (см. рис. 2, б) в миокардиальном оттоке увеличилась к конечной точке эксперимента. Уровень ферментативной активности КФК-МБ (см. рис. 2, в) в группе ЭФК на 10-й минуте реперфузии статистически значимо возрос ^=0,02)
мл/мин
20 -
16 -
12 -
4 -
0 -
СКП
Исх
РП10'
РП 30'
уд/мин 300
мм рт. ст. 160
Исх
РП10'
РП 30'
ЭФК ---▲ — ЛС
Рис. 1. Изменение параметров скорости коронарного протока (a), частоты сердечных сокращений (б), давления, развиваемого левым желудочком (в).
Исх — исходные значения; РП 10' — 10-я минута реперфузионного периода; РП 30' — 30-я минута реперфузионного периода;
* — p<0,05 относительно значений группы «Контроль» на РП 30'; ** — p<0,05 относительно значений группы ЛС на РП 10';
# — p<0,05 относительно значений группы ЛС и ЭФК. СКП — скорость коронарного протока; ЧСС — частота сердечных сокращений; ДЛРЖ — давление, развиваемое левым желудочком.
Fig. 1. Changes of blood flow velocity (a), heart rate (b) and LV pressure (c).
Исх — baseline values; РП 10' — 10 min of reperfusion period; РП 30' — 30 min of reperfusion period; * — p<0.05 in relation to control group values at РП 30'; ** — p<0.05 in relation to LS group values at РП 10'; # — p<0.05 in relation to values in LS and EPC groups. СКП — coronary blood flow; ЧСС — heart rate; ДЛРЖ — LV pressure.
по сравнению с исходной активностью фермента — 1 (1; 2) Ед/л.
Концентрация сБСЖК (рис. 3, а) в контрольной группе статистически значимо (p<0,04) превысила доишеми-ческий уровень, равный 1,1 (0,82; 2) нг/мл в каждой исследуемой точке в периоде реперфузии. При статистическом анализе данных по концентрации тропонина I (см. рис. 3, б) и концентрации органических перекисей (см. рис. 3, в) не установлено статистически значимых различий между как зависимыми, так и независимыми группами сравнения. Концентрация оксида азота (NO) (см. рис. 3, г) в группе ЭФК к 10-й минуте реперфузионного периода статистически значимо снизилась по сравнению с исходным уровнем — 20,9 (11,8; 24,3) мкмоль/л (р=0,046) и была также статистически значимо ниже значений в контрольной группе — 21,3 (13; 30) мкмоль/л; р=0,032.
Уровень флуоресценции НАДН (рис. 4) во всех исследуемых группах в каждой исследуемой точке реперфузионного периода был статистически значимо ниже (p<0,03) исходного — 0,579 (0,404; 0,972).
Обсуждение
Левосимендан влияет на открытие АТФ-чувствитель-ных калиевых каналов в мембране гладкомышечных клеток сосудистой стенки. Вследствие этого возникает гиперполяризация мембраны, которая приводит к расслаблению гладких мышц и вазодилатации [18, 19]. Наше исследование показало, что при добавлении в раствор Кребса—Хензеляйта левосимендана в дозе 0,014 нг на 2+0,2 г массы сердца крысы скорость коронарного протока на начальном этапе реперфузии увеличилась, и в отличие от других групп держалась на одном уровне, что говорит о проявленном вазодилатирующем эффекте данного препарата. Экзогенный фосфокреатин не оказал влияния на тонус коронар-
ных сосудов в постишемическом периоде: кривая СКП аналогична таковой в контрольной группе. Функциональное состояние миокарда в опытных группах после 4-часовой гипотермической ишемии было схожим. Как в группе ЛС, так и в группе ЭФК не зарегистрировано увеличение ЧСС на начальном периоде возобновленной перфузии, чего нельзя сказать о контрольной группе, в которой ЧСС на 10-й минуте реперфузии возросла в среднем на 100 уд/мин. Наивысший пик роста ДЛРЖ отмечен в группе ЛС на 10-й минуте реперфузии. Достигнут инотропный эффект [19] левосимендана: повысилась аффинность тропонина С к ионам кальция и стабилизировался тропонин С—кальциевый комплекс. При введении в состав перфузионного раствора экзогенного фосфокреатина также отмечено увеличение ДРЛЖ. В данном случае можно говорить о поддержании необходимого уровня фосфокреатина в клетке и сарколеммных пулах [20, 21]. Полученная энергия обеспечила должное сокращение миокарда. По данному разделу можно сделать вывод: реперфузионный период в группах с фармакологической поддержкой протекал менее осложненно по сравнению с контрольной группой.
Картина выброса внутриклеточных ферментов в каждой исследуемой группе имела свои особенности. Если говорить о левосимендане, то уровень активности АСТ, КФК-МБ не превышал доишемические значения и держался на низком уровне после длительного эпизода ишемии. Однако активность ЛДГ на 10-й минуте реперфузии была минимальной относительно других групп, но возросла к концу эксперимента. В присутствии левосимендана несколько снижен потенциал митохондрий к продукции энергии аэробным путем. Применение экзогенного фосфокреатина в целях защиты миокарда и постишемического восстановления в ряде экспериментальных моделей продемонстрировало свою эффективность, в том числе в уменьшении
МЕ/л ACT МЕ/л ЛДГ МЕ/л КФК-МБ
- контроль -■-ЭФК ---А— ЛС
Рис. 2. Динамика уровней маркеров повреждения миокарда — аспартатаминотрансферазы (a), лактатдегидрогеназы (б), миокардиальной фракции креатинфосфокиназы (в).
Исх — исходные значения; РП 10' — 10-я минута реперфузионного периода; РП 30' — 30-я минута реперфузионного периода;
* — p<0,05 относительно значений в контрольной группе, ЭФК и ЛС на РП 10' и РП 30'; # — р<0,05 относительно исходных значений. АСТ — аспартатаминотрансфераза; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; КФК-МБ — миокардиальная фракция креатинфосфокиназы.
Fig. 2. Dynamics of myocardial injury markers - aspartate aminotransferase (a), lactate dehydrogenase (b), myocardial fraction of creatine phosphokinase (c).
Исх — baseline values; Рп 10' — 10 min of reperfusion period; РП 30' — 30 min of reperfusion period; * — p<0.05 in relation to values in LS, EPC and control groups at РП 10' and РП 30'; # — p<0.05 compared with baseline values. АСТ — aspartate aminotransferase; ЛДГ — lactate dehydrogenase; КФК-МБ — myocardial fraction of creatine phosphokinase.
Рис. 3. Динамика уровней сердечного белка, связывающего жирные кислоты (а), тропонина I (б), органических перекисей (в), оксида азота (г).
Исх — исходные значения; РП 10' — 10-я минута реперфузионного периода; РП 30' — 30-я минута реперфузионного периода; * — p<0,05 относительно значений в контрольной группе на каждой точке РП; # — p<0,05 относительно исходных значений и значений в контрольной группе на РП 10'. сБСЖК — сердечный белок, связывающий жирные кислоты.
Fig. 3. Dynamics of heart-type fatty acid-binding protein (a), troponin I (b), organic peroxides (c), nitric oxide (d).
Исх — baseline values; РП 10' — 10 min of reperfusion period; РП 30' — 30 min of reperfusion period; * — p<0.05 in relation to control group values at each point of РП; # — p<0.05 in relation to baseline values and control group values at РП 10'. сБСЖК — heart-type fatty acid-binding protein.
выхода таких внутриклеточных ферментов, как КФК-МБ, ЛДГ, миелопероксидазы [22—24]. В нашем эксперименте получены неоднозначные результаты. На 10-й минуте реперфузии после введения экзогенного фосфокреа-тина установлен самый высокий уровень активности всех исследуемых ферментов, который к концу эксперимента снизился до уровня в других исследуемых группах. Доза препарата (5,7 нг на 2±0,2 г массы сердца) повлияла на некоторые метаболические изменения, но была недостаточной. Возможно, поэтому только к концу эксперимента сыграл свою роль мембраностабилизирующий эффект фосфо-креатина — произошло обеспечение электростатического взаимодействия между заряженными центрами молекулы фосфокреатина и заряженными головками фосфоли-пидов мембран [25], в результате чего закрылись дефекты фосфолипидного слоя, полученные в начале реперфузии. Контрольная группа отличилась относительно низкой ферментативной активностью ЛДГ и КФК-МБ, но все же неуклонный рост АСТ, который к 30-й минуте реперфузии превысил показатели в опытных группах, свидетель-
ствовал о постишемической деструкции сарколеммы кар-диомиоцитов.
Характер высвобождения внутриклеточного сБСЖК у всех групп был схож, однако в контрольной группе значения данного белка в реперфузионном периоде статистически значимо отличались от таковых в доишемическом периоде. Все-таки максимальные мембранные повреждения отмечены в контрольной группе. Рассматриваемые препараты в выбранных дозах оказали в разной степени стабилизирующий эффект на билипидный слой. Одновременно со стабилизацией клеточной мембраны левосимендан и экзогенный фосфокреатин в равной степени способствовали структурному сохранению сократительного аппарата миокарда. Образование органических перекисей в периоде реперфузии не превысило доишемический уровень при фармакохолодовой кардиоплегии без фармакологической поддержки. Оказанная же поддержка в обоих случаях увеличила образование органических перекисей при возобновленном доступе кислорода к ишемизированному органу к концу эксперимента.
Усл. ед НАДН
1,2 -|
1 -
Исх ' РП10' ' РПЗО'
- контроль -■-ЭФК ---А— ЛС
Рис. 4. Динамика флуоресценции НАДН.
Исх — исходные значения; РП 10' — 10-я минута реперфузионного периода; РП 30' — 30-я минута реперфузионного периода;
* — p<0,03 относительно значений в контрольной группе, в группах ЭФК и ЛС на РП 10' и РП 30'. НАДН — никотинамидаде-ниндинуклеотид.
Fig. 4. Dynamics of NADH fluorescence.
Исх — baseline values; РП 10' — 10 min of reperfusion period; РП 30' — 30 min of reperfusion period; * — p<0.03 in relation to control group values, in EPC and LS groups at РП 10' and РП 30'. НАДН — nicotinamide adenine dinucleotide.
NO является липофильной молекулой, имеющей непарный электрон, благодаря чему он беспрепятственно диффундирует через биологические мембраны и вступает в реакции с другими соединениями [26]. NO, связываясь с гуанилатциклазой, усиливает синтез циклического гуа-нозинмонофосфата. В клетке гладкой мускулатуры данное соединение снижает концентрацию кальция, что вызывает вазодилатацию [27, 28]. По итогам проведенных экспериментов получены некоторые противоречивые данные о концентрации эндогенного NO, вышедшего в миокар-диальный отток, и СКП. Так, если в контрольной группе продукция NO на протяжении всего периода реперфу-зии была равной исходным значениям, то СКП была минимальной. Ситуация с дополнительной фармакологической поддержкой левосименданом подтверждает наличие ва-зодилатирующего эффекта с поддержанием синтеза NO
[29]. При применении фосфокреатина СКП и продукция NO были наименьшими в исследуемых группах.
Неудовлетворительная оценка поставлена всем исследуемым группам при анализе данных, полученных методом лазерно-индуцированной флуоресценции. НАДН, накопленный во время ишемии, при возобновлении перфузии перешел в окисленную форму, что отразилось в уменьшении коэффициента флуоресценции на 10-й и 30-й минутах реперфузионного периода. Хотя минимальный рост флуоресценции и зафиксирован в опытных группах, все же электротранспортная цепь дыхательного аппарата кардио-миоцитов подверглась глубоким повреждениям.
Фармакохолодовая 4-часовая кардиоплегическая ишемия вызвала в изолированных сердцах тяжелые нарушения внутриклеточных процессов, в частности митохондриаль-ных. Фармакологическая поддержка такими агентами, как левосимендан и экзогенный фосфокреатин в дозах 0,014 и 5,7 нг на 2+0,2 г массы сердца крысы соответственно, в нашем экспериментальном исследовании вызвала в ишеми-зированном миокарде не весь перечень эффектов, которые получены при других видах экспериментальной ишемии и реперфузии.
Выводы
1. Левосимендан и экзогенный фосфокреатин способствовали постишемическому восстановлению физиологических показателей, стабилизации клеточной мембраны и сократительного комплекса ишемизированного миокарда.
2. Выявленные нарушения внутриклеточного метаболизма требуют пересмотреть выбор концентрации препаратов. С большей вероятностью можно говорить, что доза фосфокреатина в перфузионном растворе должна быть выше, так как его недостатком является быстрое дефосфори-лирование и распад как в кровотоке, так и тканях.
3. Другим вариантом усиления действия левосимендана и фосфокреатина может стать их комбинация с анти-оксидантом, который смог бы снизить образование активных форм кислорода.
Финансирование. Исследование не имело финансовой поддержки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Hausenloy DJ, Yellon DM. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target. Journal of Clinical Investigation. 2013;123(1):92-100. https://doi.org/10.1172/jci62874
2. Плотников Г.П., Шукевич Д.Л., Григорьев Е.В. Абдоминальные осложнения при операциях на сердце с искусственным кровообращением. Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. 2014;1:75-86.
Plotnikov GP, Shukevich DL, Grigoryev EV. Abdominal complication in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Kompleksnye problemy ser-dechno-sosudistyh zabolevanij. 2014;1:75-86. (In Russ.).
3. Schaper J, Meiser E, Stämmler G. Ultrastructural morphometric analysis of
myocardium from dogs, rats, hamsters, mice, and from human hearts. Circulation Research. 1985;56(3):377-391.
4. Jennings RB. Myocardial ischemia observations, definitions and speculations. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 1970;1:345-349.
5. Tani M, Neely JR. Role of intracellular Na+ in Ca++ overload and depressed revovery of ventricular function of pererfused ischemic rat hearts: possible of H+/Na+ exchange. Circulation Research. 1989;4(65):1045-1056.
6. Азова М.М., Благонравов М.Л., Фролов В.А. Влияние энергетического дефицита и окислительного стресса на апоптоз кардиомиоцитов и гипертрофию миокарда у спонтанно гипертензивных крыс. Кубанский научный медицинский вестник. 2012;4(133):158-161.
Azova MM, Blagonravov ML, Frolov VA. The effect of energy deficiency and oxidative stress on cardiomyocyte apoptosis and myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rats. Kubanskij nauchnyj medicinskij vest-nik. 2012;4(133):158-161. (In Russ.).
7. Papp Z, Édes I, Fruhwald S, De Hert SG, Salmenperä M, Leppikangas H, Mebazaa A, Landoni G, Grossini E, Caimmi P, Morelli A, Guarracino F, Schwinger RH, Meyer S, Algotsson L, Wikström BG, Jörgensen K, Filippa-tos G, Parissis JT, González MJ, Parkhomenko A, Yilmaz MB, Kivikko M, Pollesello P, Follath F. Levosimendan: Molecular mechanisms and clinical implications. Consensus of experts on the mechanisms of action of levosi-mendan. International Journal of Cardiology. 2012;159(2):82-87. https://doi.org/10.1016/j.ijcard.2011.07.022
8. Nieminen MS, Fruhwald S, Heunks LM, Suominen PK, Gordon AC, Kivik-ko M, Pollesello P. Levosimendan: current data, clinical use and future development. Heart, Lung and Vessels. 2013;5(4):227-245.
9. Torraco A, Carrozzo R, Piemonte F. Effects of levosimendan on mitochondrial function in patients with septic shock: A randomized trial Q10. Biochimie. 2014;102:166-173.
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2014.03.006
10. Alkan M, Qelik A, Bilge M, Kiraz HA, Kip G, Özer A, §ivgm V, Erdem Ö, Arslan M, KavutQu M. The effect of levosimendan on lung damage after myocardial ischemia reperfusion in rats in which experimental diabetes was induced. The Journal of Surgical Research. 2015;193(2):920-925. https://doi.org/10.1016/j.jss.2014.08.038
11. Krychtiuk KA, Watzke L, Kaun C, Buchberger E, Hofer-Warbinek R, De-myanets S, Pisoni J, Kastl SP, Rauscher S, Gröger M, Aliabadi A, Zuckermann A, Maurer G, de Martin R, Huber K, Wojta J, Speidl WS. Levosimendan exerts anti-inflammatory effects on cardiac myocytes and endothelial cells in vitro. Journal of Thrombosis andHaemostasis. 2015;113(1):350-362. https://doi.org/10.1160/TH14-06-0549
12. Рыбка М.М., Лобачева Г.В. Левосимендан. Первые 10 лет в клинической практике. Анестезиология и реаниматология. 2015;60(5):80-84. Rybka MM, Lobacheva GV. Levosimendan — the first 10 years in clinical practice. Anesteziologiya i reanimatologiya. 2015;60(5):80-84. (In Russ.).
13. Улиткина О.Н., Филипповская Ж.С., Терешина А.А., Гребенчи-ков О.А., Черпаков Р.А., Бабокин В.Е., Овезов А.М., Лихванцев В.В. Левосимендан в интенсивной терапии сердечной недостаточности при протезировании клапанов сердца. Альманах клинической медицины. 2015;38:142-148.
Ulitkina ON, Filippovskaya ZS, Tereshina AA, Grebenchikov OA, Cherpa-kov RA, Babokin VE, Ovezov AM, Likhvantsev VV. Levosimendan for intensive therapy of heart failure in heart valve prosthetics. Almanah kliniches-koy meditsiny. 2015;38:142-148. (In Russ.). https://doi.org/10.18786/2072-0505-2015-38-142-148
14. Mingxing F, Landoni G, Zangrillo A, Monaco F, Lomivorotov VV, Hui C, Novikov M, Nepomniashchikh V, Fominskiy E. Phosphocreatine in cardiac surgery patients: a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia. 2018;32(2):762-770. https://doi.org/10.1053/j.jvca.2017.07.024
15. Wyss M, Kaddurah-Daouk R. Creatine and creatinine metabolism. Physiological Reviews. 2000;80(3):1107-1112. https://doi.org/10.1152/physrev.2000.80.3.1107
16. Reimer KA, Jennings RB. Myocardial ischemia, hypoxia, and infarction. In: Fozzard HA, Haber E, Jennings RB, Katz AM, Morgan HE, eds. The heart and cardiovascular system. New York: Raven Press, 1986;1133-1201.
17. Jennings RB, Murry CE, Steenbergen C, Reimer KA. Development of cell injury in sustained acute ischemia. Circulation. 1990;82(3):112-124.
18. Erdei N, Papp Z, Pollesello P, Edes I, Bagi Z. The levosimendan metabolite OR-1896 elicits vasodilation by activating the K(ATP) and BK(Ca) channels in rat isolated arterioles. British Journal of Pharmacology. 2006;148(5):696-702. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0706781
19. Pataricza J, Krassoi I, Höhn J, Kun A, Papp JG. Functional role of potassium channels in the vasodilating mechanism of levosimendan in porcine isolated coronary artery. Cardiovascular Drugs and Therapy. 2003;17(2):115-121.
20. Sharov VG, Saks VA, Kupriyanov VV, Lakomkin VL, Kapelko VI, Steinschneider AYa, Javadov SA. Protection of ischemic myocardium by exogenous phosphocreatine. I. Morphologic and phosphorus 31-nuclear magnetic resonance studies. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 1987;94(5):749-761.
21. Hasenfuss G, Pieske B, Kretschmann B, Holubarsch C, Alpert NR, Just H. Effects of calcium sensitizers on intracellular calcium handling and myocar-dial energetics. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 1995;26(1):45-51.
22.
23.
24.
25
Zhanga W, Zhanga Н, Xing Y. Protective effects of phosphocreatine administered post-treatment combined with ischemic post-conditioning on rat hearts with myocardial ischemia/reperfusion injury. Journal of Clinical Medicine Research. 2015;7(4):242-247.
Di Gregorio G, De Sanctis F, Di Napoli P, Rulli A, Gallina S, Dini FL, Trevi GP, Barsotti A. Myocardium-protective effects of phosphocreatine in experimental ischemia-reperfusion. Cardiologia. 1992;37(2):135-140. Жернакова Н.И., Ромащенко О.В., Горбач Т.В., Зверева В.А., Константинов С.Л., Плетнев С.Ю., Байбакова Ю.А., Румбешт В.В. Клинико-экспериментальное исследование эффективности фосфокреатина при ишемии миокарда. Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. 2012;16(135):176-181. Zhernakova NI, Romashchenko OV, Gorbach TV, Zvereva VA, Konstanti-nov SL, Pletnev SYu, Baybakova YuA, Rumbesht VV. Clinical and experimental study of the efficiency of phosphocreatine in acute myocardial ischemia. Nauchnye vedomosti Belgorodskogo gosudarstvennogo universiteta. Seri-ya: Meditsina. Farmatsiya. 2012;16(135):176-181. (In Russ.).
Strumia E, Pelliccia F, D'Ambrosio G. Creatine phosphate: pharmacological and clinical perspectives. Advances in Therapy. 2012;29(2):99-123. https://doi.org/10.1007/s12325-011-0091-4
26. Зеленин К.Н. Оксид азота (II): новые возможности давно известной молекулы. Соросовский образовательный журнал. 1997;10:105-110. Zelenin KN. Nitric oxide (II): new features of a long-known molecule. So-rosovskij obrazovatelnyjzhurnal. 1997;10:105-110. (In Russ.).
27. Moncada S, Higgs EA. The L-arginine-nitric oxide pathway. The New England Journal of Medicine. 1993;329(27):2002-2012. https://doi.org/10.1056/NEJM199312303292706
28. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Роль оксида азота в развитии и предупреждении дисфункции эндотелия. Вестник Витебского государственного медицинского университета. 2003;2(2):5-17.
Manukhina EB, Malyshev IYu. Role of nitric oxide in the development and prevention of endothelial dysfunction. Vestnik Vitebskogo gosudarstvennogo medicinskogo universiteta. 2003;2(2):5-17. (In Russ.).
29. Grossini E, Molinari C, Caimmi PP, Uberti F, Vacca G. Levosimendan induces NO production through p38 MAPK, ERK and Akt in porcine coronary endothelial cells: role for mitochondrial K(ATP) channel. British Journal oof Pharmacology. 2009;156(2):250-261.
https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2008.00024.x
Поступила 27.09.18 Received 27.09.18
Принята к печати 18.02.19 Accepted 18.02.19
