CC BY
55
Применение иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии ф для определения содержания
иммуноглобулинов классов А и M в препаратах нормального иммуноглобулина человека для внутривенного введения
о.
Q Лаптева Л.К.,1 Казьянин А.В.,2 Зубкова Н.В.,3 Николаева A.M.,3
Анастасиев fi.fi./ Ai.Ai. Калашникова3
1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранени РФ, Москва Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения РФ, Пермь
Федеральное Государственное унитарное предприятие «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Министерства здравоохранения РФ, Москва
Enzyme immunoassay and radial immunodiffusion for the determination of immunoglobulin A- and M-classes in normal human immunoglobulin preparations for intravenous administration
Lapteva L.K.,1 Kazyanin A. V.,2 Zubkova N. V.,3 Nikolaeva A.M.,3 Anastasiev V. V.,3 Kalashnikova M.M.3
1Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
2Federal Budgetary Educational Institution of the Higher Professional Education «Perm State Pharmaceutical Academy» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Perm 3Federal State Unitary Enterprise « Scientific Production Association «Microgen» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Методы иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии применены для определения остаточного содержания иммуноглобулинов классов A (IgA) и M (IgM) в препаратах нормального (поливалентного) иммуноглобулина человека для внутривенного введения. Полученные результаты продемонстрировали, что валидация методов с использованием диагностических наборов является обязательной. Показано, что отечественные препараты иммуноглобулинов по содержанию примесей IgA соответствуют зарубежным аналогам. В нормативной документации на препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения рекомендовано установить норму предельно допустимого содержания IgA. Ключевые слова: классы иммуноглобулинов, методы контроля, иммуноферментный анализ, радиальная иммунодиффузия.
Библиографическое описание: Лаптева Л. К., Казьянин А.В., Зубкова Н.В., Николаева A.M., Анастасиев В. В. Применение методов иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии
ID
ПРЕПАРАТЫ
Для корреспонденции:
Лаптева Л.К. - главный эксперт Управления экспертизы аллергенов, цитокинов и других иммуномодуляторов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Адрес: ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, 121002, Москва, Сивцев Вражек, 41, e-mail: Lapteva@regmed.ru
Статья поступила 16.07.12 г., принята к печати 01.11.12 г.
Основным компонентом препаратов нормального (поливалентного) иммуноглобулина человека является иммунологически активная фракция иммуноглобулина С (1дС), составляющая в лекарственных формах для внутривенного введения более 98% от общего содержания белка [1, 2]. Количество примесей иммуноглобулинов классов А (1дА) и М (1дМ) в отечественных препаратах не нормируется, хотя известно, что повышенное их содержание может негативно влиять на клиническую переносимость иммуноглобулинов и вызывать побочные эффекты при внутривенном введении препаратов. У пациентов с дефицитом 1дА могут образовываться антитела к этому иммуноглобулину, вызывая анафилактические реакции при высокой дозе внутривенного введения препарата. Концентрацию 1дА и 1дМ важно также учитывать при расчете скорости введения 1дС. Поэтому в зарубежных препаратах примеси 1дА, а иногда и 1дМ декларируются, а максимальное их содержание указывается на упаковке [3-5].
Целью настоящего исследования было определить методами ИФА и РИД остаточное содержание 1дА и 1дМ в отечественных препаратах иммуноглобулина человека для внутривенного введения и сравнить полученные результаты сданными зарубежных производителей.
Материалы и методы
Объектом исследования были препараты нормального иммуноглобулина человека для внутривенного введения, полученные на Нижегородском филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России: «Иммуно-
глобулин человека нормальный для внутривенного введения жидкий» (ФСП 4201001316-01), Имбиоглобулин (ФСП 4205044266-04), а также Имбиоглобулин, дополнительно вирусинактивированный сольвент-детергент-ной смесью (ЛС-000177-171011) или каприлатом натрия (экспериментально-производственные серии).
В качестве контроля использовали иммуноглобулин человека для внутривенного введения Октагам («Окта-фарма», Австрия) с известным максимальным содержанием IgA и стандартный образец предприятия (СОП), аттестованный по содержанию IgG, IgA и IgM с использованием Международного стандарта (ВОЗ 67/086, WHO international biological reference preparation Human serum immunoglobulin G, A and M (IgG, IgA and IgM) lyophilized, 100 IU IgG, 100 IU IgA and 100 IU IgM/ampoule).
Концентрацию IgA и IgM определяли методом ИФА с использованием коммерческих иммуноферментных наборов «IgA общий-ИФА-БЕСТ», «IgM общий-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) и «Serazym Human IgA», «Serazym Human IgM» (Seramun Diagnostica GmbH, Германия) и методом РИД с использованием диагностических наборов «Моно-РИД-GAM» (филиал ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России, Нижний Новгород).
Результаты и обсуждение
Технология производства препаратов нормального иммуноглобулина человека для внутривенного введения основана на методе спиртового фракционирования по Кону и его модификациях. Она обеспечивает эффек-
€
тивную очистку препарата от примесей, в том числе 1дА и 1дМ. Введение дополнительных технологических стадий, необходимых для улучшения переносимости при внутривенном введении, фармакодинамических характеристик и повышения вирусной безопасности препаратов, позволяет улучшить степень очистки 1д6 [6].
Сегодня на рынке присутствуют три поколения внутривенных иммуноглобулинов. Первые препараты были получены с использованием гидролитических ферментов. Несмотря на то что ферментативный гидролиз на-
рушает структуру 1д6, традиционно эту технологию до настоящего времени используют большинство отечественных производителей. Препараты иммуноглобулинов второго поколения имеют нативную структуру 1дС с сохраненными эффекторными функциями. Препараты третьего поколения являются высокоочищенными белками и их производство включают дополнительные стадии инактивации и элиминации вирусов [7]. Промышленное производство препаратов третьего поколения в России находится на стадии внедрения.
Таблица 1. Аналитические характеристики диагностических наборов для определения 1дА и 1дМ методами ИФА и РИД
Наименование диагностического набора Предел обнаружения в исследуемом образце, мг/мл Фактор разведения, п Предел обнаружения с учетом разведения, мг/мл
«Serazym Human IgA» - 5000 0,100
«Serazym Human IgM» - 2500 0,050
«IgA общий-ИФА-БЕСТ» 0,000021 1000 0,021
«IgM общий-ИФА-БЕСТ» 0,000032 1000 0,032
«Моно-РИД-GAM» 1дА - 0,100
IgM - 0,200 отсутствует -
Таблица 2. Содержание 1дА в препаратах внутривенного иммуноглобулина и СОП
№ п/п Наименование препарата Содержание IgA, мг/мл
«Serazym Human IgA» «IgA общий-ИФА-Бест» «Моно-РИД-GAM»
n М ±ш п М ±ш п М ±ш
1 Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения - - 12 0,34+0,07 16 0,50+0,22
2 Имбиоглобулин 5 0,13+0,06 9 0,24+0,09 7 0,17+0,06
3 Имбиглобулин СД-обработанный 8 менее 0,1 9 0,17+0,07 12 0,12+0,01
4 Имбиоглобулин, обработанный каприлатом натрия 4 менее 0,1 4 0,1+0,08 6 0,13+0,06
5 Октагам 3 менее 0,1 3 менее 0,1 3 не выявлен
б СОП 1дА 2,27 мг/мл б 2,87+0,55 5 3,0+0,62 3 2,21+0,25
Таблица 3. Содержание 1дМ в препаратах внутривенного иммуноглобулина и СОП
№ п/п Наименование препарата Содержание IgA, мг/мл
«Serazym Human IgA» «IgA общий-ИФА-Бест» «Моно-РИД-GAM»
n М ±ш п М ±ш п М ±ш
1 Иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения 3 менее 0,05 16 0,14+0,04 17 0,23+0,05
2 Имбиоглобулин 4 0,08+0,02 10 0,14+0,01 17 0,21+0,02
3 Имбиглобулин СД-обработанный 4 0,15+0,11 16 0,23+0,08 17 0,28+0,08
4 Имбиоглобулин, обработанный каприлатом натрия 2 менее 0,05 4 0,13+0,14 6 менее 0,2
5 Октагам 2 менее 0,05 3 0,08+0,04 2 -
6 СОП 1дМ 1,22 мг/мл 6 1,32+0,21 5 2,01+0,65 3 1,26+0,15
ID
ПРЕПАРАТЫ
С целью оценки влияния технологического процесса на эффективность очистки 1дО от примесей 1дА и 1дМ были исследованы отечественные препараты иммуноглобулинов трех поколений: иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения, полученный по классической технологии и обработанный пепсином, Имбиоглобулин, представляющий собой раствор нативного 1дО, а также Имбиоглобулин, дополнительно инактивированный сольвент-детергентной смесью или каприлатом натрия. Технологическая схема получения исследуемых препаратов представлена на рис. 1.
Вышеуказанные препараты иммуноглобулинов, а также Октагам и СОП исследовали методами ИФА и РИД на содержание 1дА и 1дМ. Аналитические характеристики диагностических наборов, используемых для реализации методов, предствапены в табл. 1. Следует
отметить, что при проведении ИФА для снижения неспецифических взаимодействий необходимо предварительное разведение исследуемых образцов, что снижает реальную чувствительность метода.
Результаты определения содержания 1дА предства-лены в табл. 2, 1дМ - в табл. 3. Показано, что данные, полученные с использованием разных методов и даже диагностических наборов, отличаются. При выполнении исследований с использованием диагностических наборов производства «Вектор-Бест», был выявлен большой разброс аналитических данных, а результаты содержания 1дА и 1дМ в СОП отклонялись от номинального значения более чем на 20%, что в соответствии с рекомендациями ВОЗ считается недопустимым. Поэтому, несмотря на высокий уровень аналитической чувствительности наборов «1дА общий-ИФА-Бест», по-
Таблица 4. Содержание 1дА и 1дМ в коммерческих препаратах нормального иммуноглобулина человека для внутривенного введения [4, 7,9-11]
№ п/п Наименование препарата Производитель Форма выпуска Содержание 1дА, мг/мл Содер жание 1дМ, мг/мл Дополнительные стадии инактивации и элиминации виру
1 Эндобулин «Бакстер», США, Австрия Лиофилизат. Раствор 5% <0,05 - СД:ТБФ/
2 Гаммагард С/Д «Бакстер», Австрия Лиоилизат. Раствор 5% и 10% <0,003 следы СД: ТБФ/окто-ксинол9/твин 80; УФ, ИОХ
3 Октагам «Октафарма», Австрия Жидкий 5% 0,2 0,1 СД: ТБФ/Тритон Х-100; ИОХ, УФ
4 Интратект «Биотест-Фарма», Германия Жидкий 5% <2 - КК, СД: ТБФ/Тритон
5 Интраглобин Жидкий 5% <2,5 - Р-ППЛ, 35 нм НФ, УФ,ДФ
6 ИГВена «Кедрион», Италия Жидкий 5% 0,1 - СД: ТБФ/натрия холат, ПЦ, УФ
7 Гамимун «Талекрис Биотера-пьютикс», США Жидкий 5 и 10% следы 0,03 СД: ТБФ/натрия холат; ПЦ, УФ,ДФ
8 Гамунекс Жидкий 10% 0,046 0,002 КН, ГФ, хроматография
9 Флебогамма «Грифолс», Испания Жидкий 5% <0,05 следы ПЭГ, ИОХ, рН4.0, СД, пастеризация, НФ
10 Ал ьфаглобин «Альфа Терапью-тикс», США Жидкий 5% < 0,008 <0,011 ИОХ, пастеризация, ПЭГ
11 Сандо-глобулин «Новартис», Швейцария Лиофилизат. Раствор 3, б, 9, 12% 0,72 следы Пепсин, рН4,0, фильтрация
12 Ивигам «Иммуно», США Лиофилизат. Раствор 5% <0,01 - ПЭГ, трипсин
Примечание.
ПЦ - преципитация; ГФ - глубинная фильтрация; ДФ - диафильтрация; УФ - ультрафильтрация; НФ - нанофильтрация; ПЭГ - полиэтиленгликоль; СД - сольвент-детергентная обработка; ТБФ - трибутилфосфат; р-ППЛ - р-пропиолактон; КК - каприловая кислота; КН - каприлат натрия; ИОХ - ионообменная хроматография; ПСТ - пастеризация при 60°С
СЕ
Рис. 1. Технологическая схема получения препаратов нормального иммуноглобулина человека для внутривенного введения
ПРЕПАРАТЫ
лученные результаты были признаны некорректными.
В то же время, результаты определения IgA, полученные методом РИД, при чувствительности, сравнимой с ИФА на наборах «Serazym Human IgA», были воспроизводимыми и имели хорошую корреляцию. Эти данные подтвердили возможность использования диагностических наборов «Моно-РИД-GAIVI» и «Serazym Human IgA» для определения концентрации IgA в препаратах иммуноглобулина.
Анализ данных, полученных при определении содержания IgM, показал, что метод РИД не пригоден для исследования препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, поскольку диаметры колец преципитации при низких концентрациях IgM очень малы и их трудно измерить корректно. Кроме того, в процессе производства пентамерная структура IgM может быть нарушена. Как следствие, это может привести к искажению результатов, потому что мономерный IgM диффундирует в геле быстрее [8]. В связи с этим, результаты, полученные на диагностических наборах «Serazym Human IgM», представляются нам достоверными, при этом чувствительность этих наборов в 4 раза выше, чем в РИД, что более приемлемо для исследования следовых количеств белка.
Таким образом, полученные результаты подтверждают, что современная технология получения препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, в том числе с дополнительной вирусинактивирующей обработкой, обеспечивает эффективную очистку от примесей 1дА и 1дМ. Так, содержание 1дА в Имбиоглобулине, в том числе, обработанном сольвент-детергентом или каприлатом натрия, было достоверно ниже, чем во внутривенном иммуноглобулине, полученном стандартным методом с использованием гидролитических ферментов.
Сравнив полученные результаты с данными литературы (табл. 4), можно сделать вывод, что уровень очистки отечественных препаратов нормального иммуноглобулина человека для внутривенного введения от примесей 1дА соответствует зарубежным аналогам. Поэтому в нормативной документации на эти препараты рекомендовано установить норму предельно допустимого содержания 1дА. Для определения концентрации последнего рекомендовано использовать методы РИД или ИФА при условии, что диагностические наборы, используемые для реализации любого из этих методов, вапидированы. Исследования по содержанию 1дМ в препаратах иммуноглобулинов необходимо продолжить.
Литература:
1. Mollnes Т.Е., Hagasen К., De Carolis С., et at. High-dose intravenous immunoglobulin treatment activates complement in vivo // Scandinavian J. Immunol. 1998. V. 48(3). P. 312-317.
2. RadosevichM., BurnoufT. Intravenous immunoglobulin G: trends in production methods, quality control and quality assurance //Vox Sanguinis. 2010. V. 98(1). P. 12-28.
3. Misbah S.A., Chapel H.M. Adverse effects of intravenous immunoglobulin//Drug Saf. 1993. V.9(4). P. 254-62.
4. Sheard J. P. IgA content of immunoglobulin preparation was overstated//BMJ. 1996. V. 30(313). P. 1400.
5. Feldmeyer L., Benden C., Haile S., et at. Not all intravenous immunoglobulin preparations are equally well tolerated // Acta Derm Venereol. 2010. V. 90. P. 494-497.
6. Burnouf T. Modern plasma fractionation // Transfus Med Rev. 2007. V. 21(2). P. 101-117.
7. Лолор Г., Фишер Т., Адельман Д. Клиническая иммунология и аллергология (пер. с англ.). М.:Практика, 2000. 390 с.
8. Endobulin S/D®. Регистрационное удостоверение № 015568/01. Иммуноглобулин G человеческий нормальный для внутривенного введения (http:// www. biomedservice.ru/price/goods/1/8309).
9. Octapharma AG (http://www.octapharma.com).
10. http://www. mytransfusion. com.au/
11. http://www.drugs.com/
G
