CC BY
206
6. Недостатки содержания и внедрения документов сопровождения и организации работы с ними разрушают стиль команды.
В результате многочисленные недочеты документно-информационого сопровождения сильно снижают впечатления клиентов от явных достижений клиник: современных технологий, профессиональных умений стоматологов, привлекательных интерьеров, удобств парковки и близости метро.
Заключение
Попытки обратить внимание владельцев клиник и менеджеров на плохое
состояние минимума документного сопровождения обычно вызывают их бурную и даже агрессивную реакцию. Все это свидетельствует об ограниченности управленческой компетентности менеджеров и нежелании ломать устаревшие стереотипы.
Обычно менеджерам и докторам трудно доказать, что юрист оперирует законами, но не имеет представлений о показателях качества документов сопровождения, не владеет стилем, допускает грамматические ошибки и никогда не слышал о принципах кон-
траста и вектора, в соответствии с которыми действует персонал-команда.
В помощь коммерческим клиникам разработан комплект «Оформление взаимоотношений с пациентами от «входа» до «выхода», который соответствует новейшим юридическим требованиям, психологии восприятия, включает тексты всех документов, а также инструкции для персонала, показывающие, как работать с документами в стиле команды.
Поступила 30.09.2019 Принята в печать 24.04.2020
Адрес для корреспонденции
Кафедра психологии и медицинской деонтологии
Санкт-Петербургский институт стоматологии последипломного образования
пр. Металлистов, 58, Санкт-Петербург
195176, Российская Федерация
Тел.: +7 (921) 322-00-31
Бойко Виктор Васильевич, e-mail: vv_boy@rambler.ru, www.vboy.ru
Address for correspondence
Department of Psychology and Medical Deontology
St. Petersburg Institute of Dentistry Postgraduate Education
58, Metallistov Ave., St. Petersburg
195176, Russian Federation
Tel .: +7 (921) 322-00-31
Victor Boyko, e-mail: vv_boy@rambler.ru, www.vboy.ru
ПРИМЕНЕНИЕ IGY-ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ КАРИЕСА, ВЫЗВАННОГО STREPTOCOCCUS MUTANS
Каплин Владимир Сергеевич, Каплина Ольга Николаевна
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Российская Федерация
Vladimir Kaplin, Olga Kaplina State Research Center for Virology and Biotechnology Vector, Russian Federation Application of IgY-technology for prevention and treatment caries caused by Streptococcus mutans
Резюме. Стоматологический кариес - инфекционное заболевание, вызванное бактериями Streptococcus mutans. Было проведено много исследований по разработке методов и материалов для профилактики кариеса. Правда, использование пассивной иммунизации, когда специфические антитела и антиген активно удаляются из зоны поражения, являются наиболее безопасной и эффективной стратегией лечения. После иммунизации кур инактивированными бактериями S. mutans из желтков кур были выделены активные антитела (IgY) с высокими титрами как в ИФА, так и в реакции агглютинации, что говорит о высокой нейтрализующей активности полученных антител. Разработанная оригинальная методика позволяет получать высокоочищенные IgY-антитела с высокими титрами в промышленных масштабах. Эти антитела могут быть использованы при разработке средств защиты полости рта от S. mutans (зубные пасты, ополаскиватели для полости рта, таблетки для рассасывания), а также для диагностики. Ключевые слова: IgY-технологии, иммунотерапия, пассивная иммунизация, кариес, Streptococcus mutans.
Современная стоматология. — 2020. — №3. — С. 39—42. Summary. Dental caries is an infectious disease caused by bacteria Streptococcus mutans. A lot of research has been done to develop methods and materials for caries prevention. But the use of passive immunization, when specific antibodies are actively removed from the affected area, are the most safe and effective treatment strategy After the immunization of the hens with inactivated S. mutans, active antibodies (IgY) with high titers in both ELISA and agglutination test were isolated from the yolks of chickens, which indicates a high neutralizing activity of the obtained antibodies. The developed original technique allows to obtain highly purified IgY antibodies with high titers on an industrial scale. These antibodies can be used in the development of oral protection products from S. mutans (toothpastes, mouthwashes, resorption tablets), as well as for diagnosis.
Keywords: IgY-technologies, immunotherapy, passive immunization, caries, Streptococcus mutans. Sovremennaya stomatologiya. — 2020. — N3. — P. 39—42.
Кариес - заболевание, вызванное специфическим типом бактерий, живущих на слизистой оболочке ротовой полости. Эти бактерии продуцируют кислоту, которая разрушает зубную эмаль и приводит к образованию полостей на ее поверхности. Среди всех кариогенных стрептококков преобладающим является Streptococcus mutans.Эта бактерия является причиной возникновения кариеса в человеческой популяции, а поражения, вызванные S. mutans, достигли тревожных масштабов эпидемии в современном мире.
В глобальном масштабе распространенность кариеса зубов составляет 60-90% у школьников, а среди взрослого населения обнаруживается почти у 100% людей в большинстве стран. Расходы на оказание медицинской помощи при стоматологических заболеваниях составляют 5-10% в развитых странах. Из них зубной кариес и периодонтит являются двумя заболеваниями, вызывающими тревогу у медицинской общественности.
Для борьбы с кариесом зубов разработаны вакцины с применением различных поверхностных антигенов. Была испытана пассивная иммунизация с использованием мышиных моноклональных антител, коровьих антител из молозива и куриных желточных IgY-антител против S. mutans для лечения кариеса у людей [8].
Различные отчеты об иммуноглобулинах яичного желтка показывают, что IgY выступает в качестве перспективного альтернативного кандидата для профилактики бактериальных и вирусных инфекций [1, 2, 7].
Иммуноглобулин яичного желтка, наработанный против глюкозилтрансферазы, полностью защитил инфицированных S. mutans крыс от этого патогена [9]. В настоящее время известно, что IgY-антитела, специфичные к S. mutans, могут быть одним из материалов, предупреждающих развитие кариеса.
В ряде стран (Китай, Южная Корея, Япония) налажено производство зубных паст и жидкостей для ополаскивания полости рта, в состав которых входят IgY-антитела против S. mutans.
Цель исследования - разработать и оценить методику получения желточных куриных антител к S. mutans в качестве альтернативного и доступного подхода для диагностики и лечения кариеса зубов. Материалы и методы Экспериментальные животные В качестве экспериментальных животных использовались куры-несушки породы Леггорн белый местной птицефабрики в возрасте 4,5 месяцев в количестве 6 штук, весом 1,3-1,6 кг. Животные содержались в стандартных гигиенических условиях, в индивидуальных клетках с надлежащим питанием и водой.
Используемый микроорганизм и подготовка антигена
В работе использовали штамм S. mutans SS-1164 из собственной коллекции микроорганизмов института. Изо-лят культивировали на агаре. S. mutans переносили в асептических условиях из агара в 250 мл колбу, содержащую 150 мл стерильного бульона Тодда Хью-итта, и инкубировали при 37 °С в течение 24 часов. Бактериальные клетки собирали центрифугированием при 6000 об/мин в течение 15 минут. Осадок суспендировали в стерильном физиологическом растворе и снова центрифугировали. Эти клетки ресуспендировали в 5 мл стерильного физиологического раствора, содержащего 3% формалина, и выдерживали при 40 °С в течение ночи. Клетки дважды промывали в 0,9% забу-ференном фосфатами физиологическом растворе (PBS) для удаления формалина и диспергировали в PBS. Концентрацию инактивированных клеток доводили до 1х108 клеток/мл. Иммунизация кур и сбор яиц S. mutans (103 клеток/мл) диспергировали в PBS и вводили по 0,5 мл этого раствора с равным объемом полного адъюванта Фрейнда, внутримышечно, в грудную мышцу курицы в несколько точек. Последующие бустерные инъекции проводили с увеличением концентрации антигена (103- 106 клеток/мл) через 7 дней по тому же пути введения с неполным адъювантом Фрейнда. Яйца собирали с 0 дня до конца эксперимента и хранили при 4 °С.
Экспресс-вариант выделения IgY Для экспресс-оценки титров антител в желтках предлагается микровариант выделения IgY После тщательного перемешивания желтка в центрифужную пробирку на 2 мл вносили 0,9 мл PBS и 0,1 мл желтка. После перемешивания добавляли 0,2 мл хлороформа, встряхивали и инкубировали 2 часа при 4 °С. Центрифугировали на микро-центрифуге 15 минут при 8000 об/мин. и переносили над осадочную жидкость (около 1 мл) в центрифужную пробирку. К полученному объему добавляли 0,9 мл насыщенного раствора сульфата аммония и перемешивали. Центрифугировали в тех же условиях. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок растворяли в 1,0 мл PBS. Для расчета титра антител следует учитывать начальное разведение желтка, которое составляет 1:10. Этот способ занимает около 4 часов и дает быстрые ответ о титре антител в желтке. Выделение и очистка IgY Для выделения и очистки IgY-антител из желтков иммунизированных кур в полупромышленных масштабах применяли оригинальный способ. В 5 объемах дистиллированной воды растворяли 0,1% яблочного пектина и добавляли 1 объем желтков. После перемешивания раствор оставляли на 1 час при 4 °С. рН раствора доводили до 5,0 с помощью 1 М HCl и оставляли на ночь при 4 °С. После центрифугирования в течение 25 минут при 10000 g и 4 °С к надосадку добавляли NaCl до концентрации 8,8%. рН раствора доводили до 4,0 с помощью 1 М HCl и выдерживали при комнатной температуре 2 часа. Центрифугировали 20 минут при 4000 g и 4 °С. Надосадок отбрасывали, а осадок растворяли в PBS. Проводили диализ против PBS.
Титрование антител с помощью непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) Для работы использовались 96-лу-ночные планшеты (Greiner Bio-One3, Германия). К 10 мл 0,05 М карбонат би-карбонатного буфера рН 9,6, добавляли 20 мкл взвеси клеток S. mutans, инакти-вированные формалином (1х108 клеток/ мл). По 100 мкл этой взвеси помещали в лунки в стандартного микротитраци-
Таблица 1 Изменение титров антител в желтках кур, спустя 9, 30 и 45 дней после иммунизации
№ курицы Титр антител, определенный с помощью ИФА
9-й день после иммунизации 30-й день после иммунизации 45-й день после иммунизации
1 1 900 1:24.300 1:656.100
2 1 900 1:8.100 1:656.100
3 1 900 1:24.300 1:218.700
4 1 900 1:24.300 1:218.700
5 1 300 1:24.300 1:72.900
6 1 300 1:8.100 1:218.700
Таблица 2 Титры антител в желтках кур, спустя 45 дней после иммунизации в реакции агглютинации
№ курицы 1 2 3 4 5 6
Титр антител в реакции 1:128 1:256 1:64 1:128 1:64 1:64
агглютинации
онного планшета, где их инкубировали при 4 °С в течение ночи. Взвесь антигена удаляли, а в лунки вносили по 200 мкл PBS в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина для блокировки свободных сайтов связывания и инкубировали 2 часа при 37 °С. После блокировки каждую лунку трижды промывали 200 мкл PBS, содержащей 0,05% Tween 20 (PBS-T). В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора IgY-антител в PBS-T буфере с добавлением 1-процентного бычьего сывороточного альбумина (PBS-T-B). Инкубировали 2 часа в тех же условиях. Затем лунки трижды промывали 200 мкл PBS-T и вносили раствор конъюгата (кроличьи антитела против IgY курицы, ковалентно связанные с пероксидазой хрена фирмы Sigma-Aldrich), с разведением 1:3000 в буфере PBS-T-B по 100 мкл на лунку. Инкубация продолжалась 1 ч при 37 °С. Лунки трижды промывали 200 мкл PBS-T и вносили по 100 мкл раствор хромогена (TMB/H2O2, Genei Pvt Ltd, Bangalore), приготовленного на цитратно-фосфатном буфере рН 5,0. Инкубировали при комнатной температуре 30 минут в темноте. Добавляли по 50 мкл на лунку стоп раствора (2 М серной кислоты). Измерение оптической плотности в лунках проводили на микро планшетном фотометре Anthos 2010/2020 (Австрия) при длине волны 450 нм.
Титрование антител с помощью реакции агглютинации
Для работы использовались планшеты с «и»-лунками для иммунологических реакций (ОАО «Фирма Медполимер», Санкт-Петербург РФ). В лунки первого ряда вносили по 50 мкл стерильного физраствора с антителами против S. mutans с понижающейся концентрацией. В лунки второго ряда вносили по 50 мкл стерильного физраствора с IgY от неиммунизи-рованного животного с понижающейся концентрацией (контроль). Во все лунки добавляли по 50 мкл стерильной взвеси S. mutans с оптической плотностью 0,42 при 620 нм и инкубировали в течение ночи при 25 °С. После инкубации визуально определяли титр антител как самое высокое разведение IgY вызывающее агглютинацию по сравнению с контрольными лунками [4]. Электрофорез
Оценку чистоты IgY проводили с помощью электрофореза в 15-процентном SDS-полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Содержание белка оценивали путем анализа полос, полученных в результате электрофореза, с использованием компьютерной программы Gel-Pro analyzer, ver.3.1. Результаты и обсуждение Уровень антител в яичном желтке иммунизированных кур контролировали ежедневно, используя микро-вариант
выделения IgY из желтков иммунизированных кур и непрямой метод ИФА (табл. 1).
Специфические антитела в желтках яиц кур стали появляться с 9-го дня после первой иммунизации (1:300-900). Титр антител постепенно нарастал и достиг максимальных значений к 45-му дню (1:72.900-656.100). Далее титры желточных антител изменялись, но оставались в пределах 1:656.100-1:72.900, что можно объяснить наличием циркадных ритмов в желтках яиц кур. Период колебаний иммуноглобулинов в желтках кур составляет 7 суток [6].
Из желтков шести кур на 45-й день после иммунизации выделены специфические IgY Был проведен анализ специфичности желточных антител против S. mutans в реакции агглютинации (табл. 2).
Из представленных данных видно, что титры антител, полученные в ИФА, существенно отличаются от результатов, полученных в агглютинационном анализе. Это можно объяснить тем, что применение ферментной метки дает существенное усиление сигнала. Более того, не все антитела, выявленные в ИФА, являются агглютининами. Возможность выявления антител, вызывающих агглютинацию, прямую иммунологическую реакцию, является важной особенностью этого метода анализа. Таким образом, полученные от шести кур IgY-антитела являются не только антигенсвязывающими антителами, но и агглютинирующими и могут быть использованы при разработке средств защиты от кариеса.
Ранее нами был показан эффект ин-гибирования роста клеток S. mutans в жидкой среде в присутствии специфических IgY-антител, который наблюдался до концентраций 0,001 мг/мл [3]. Следовательно, полученные нами желточные антитела способны подавлять рост и развитие клеток S. mutans.
Чистоту полученных IgY-антител проверяли с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Тяжелые и легкие цепи IgY в денатурирующих условиях разделяются на два фрагмен-
Рис. Электрофореграмма очищенного IgY (слева) и маркерных белков (справа)
та с молекулярными массами около 65-68 kDa и 25 kDa. В электрофорезе были получены полосы с молекулярными массами, соответствующими тяжелой и легкой цепям IgY В районе 40 kDa отмечено присутствие примеси на уровне 3,66%, следовательно, чистота препарата составила 96,34% (рисунок).
Титры антител, выделенных из желтков иммунизированных нами кур за все время эксперимента, составили 1:72.900— 1:656.100. Эти результаты значительно выше, чем описанные другими авторами. Так, Sentila Rajan и соавт. [10], M.D. Dinesh и соавт. [41 получали специфические к S. mutans антитела с титром 1:10.000. C. Gandhimathi и соавт. [5] сообщили, что титр полученных ими антител был около 50.000. Следовательно, антитела, полученные в нашей лаборатории, имеют высокий титр и высокую протективную активность.
С 45-го дня после иммунизации был начат сбор иммунных яиц и выделение IgY из желтков. Желтки, полученные от всех животных, объединялись и подвергались обработке по полупромышленной методике. За три месяца от 6 кур было собрано 474 яйца, из которых было выделено 54,549 г IgY Известно, что в состав зубной детской пасты Китайской фирмы Тяньшы входят сорбитол (54%), кремнезем (23%), вода (8,86%), глицерин (5%), ПЕГ-12 (5%) и другие компоненты, а также IgY (0,002%). При объеме тю-
бика пасты 60 г потребуется 1,2 мг IgY Следовательно, из 54,549 г иммунных IgY можно изготовить 45457 тюбиков зубной пасты.
Заключение
Продемонстрирована возможность получения промышленных количеств активных IgY-антител против S. mutans, которые могут быть использованы в качестве субстанции при изготовлении зубной пасты, защитного геля, жидкости для полоскания рта, аэрозоля и гигиенических таблеток для рассасывания. В разработанной технологии использовались пищевые продукты: вода дистиллированная, желтки, выделенные из иммунизированных S. mutans кур, NaCl (поваренная соль) и яблочный пектин, следовательно, полученная субстанция не токсична и может быть использована при производстве гигиенических средств защиты зубов. Эта лабораторная методика является основой для разработки технического регламента, а после клинических испытаний может быть использована в производстве различных средств защиты при профилактике кариеса.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Каплин В.С., Каплина О.Н. // Медицинские новости. - 2017. - N3. - С.33-38. / Kaplin VS., Kaplina O.N. Meditsinskiyenovosti, 2017, no.3, pp.33-38. (in Russian)
2. Каплин В.С., Каплина О.Н. // Биотехнология. - 2017. - Т.33, №2. - С.29-40. / Kaplin VS., Kaplina O.N. Biotekhnologiya, 2017, vol.33, no.2, pp.29-40. (in Russian)
3. Плешкова О.Г., Леонов В.В., Арипов В.С., Каплин В.С., Каплина О.Н., Колосова Е.А., Щербаков Д.Н. // Международный форум. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва. - 2018. - С.259-260. / Pleshkova O.G., Leonov VV, Aripov VS., Kaplin VS., Kaplina O.N., Kolosova Ye. A., Shcherbakov D.N. Mezhdunarodnyy forum. Biotekhnologiya: sostoyaniyeiperspektivyrazvitiya [International Forum. Biotechnology: current state and development prospects]. Moskva, 2018, pp.259-260. (in Russian)
4. Dinesh M.D., Uma M.S., Anjali V.M., Michael A. International Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences, 2013, vol.5, no.2, pp.258-262.
5. Gandhimathi C., Michael A. Int JPharm Bio Sci, 2014, vol.5, no.2, pp.498-508.
6. He J.X., Thirumalai D., Schade R., Zhang XY Vet Immunol Immunopathol, 2014, vol.160, no.3-4, pp.266-272.
7. Juni Handajani, Dhinintya Hyta Narissi, Mufidana Azis, Aurita Siwi Rahmawati. Afr J Microbiol Res, 2016, vol.10, no.39, pp.1668-1674.
8. Koga T., Oho T, Shimazaki Y, Nakano Y Immunization against dental caries. Vaccine, 2002, vol.20, no.16, pp.2027-2044.
9. Kruger C., Pearson S.K., Kodama Y, Vacca Smith A., Bowen W.H., Hammarstrom L. Caries Res, 2004, vol.38, no.1, pp.9-14.
10. Sentila Rajan, Karthika S., Michael A., Gandhimathi С. Archives of Applied Science Research, 2011, vol.3, no.5, pp.404-412.
Конфликт интересов
Согласно заявлению авторов, конфликт интересов отсутствует.
Поступила 12.09.2019 Принята в печать 21.08.2020
Адрес для корреспонденции
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»
630559, Российская Федерация
р.п. Кольцово, Новосибирская область
www.vector.nsc.ru
Каплин Владимир Сергеевич, e-mail: kaplin_vs@vector.nsc.ru
Address for correspondence
State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" 630559, Russian Federation r.p. Koltsovo, Novosibirsk region www.vector.nsc.ru
Vladimir Kaplin, e-mail: kaplin_vs@vector.nsc.ru
