CC BY
24
ЛАБОРАТОРНЫЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ LABORATORY AND EXPERIMENTAL STUDIES
DOI: 10.21294/1814-4861-2021-20-6-41-54 УДК: 618.19-006.6:577.21
Для цитирования: Сметанникова Н.А., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Поздняков П.И., Дубинин Е.В., Карпов А.Б., Вихлянов И.В., Никитин М.К., Солдатова С.М., Нетесова Н.А. Применение GLAD-ПЦР-анализа для изучения метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке молочной железы. Сибирский онкологический журнал. 2021; 20(6): 41-54. - doi: 10.21294/1814-4861-2021-20-6-41-54
For citation: Smetannikova N.A., AbdurashitovM.A., AkishevA.G., PozdnyakovP.I., Dubinin E.V., KarpovA.B., Vihlyanov I.V., Nikitin M.K., Soldatova S.M., Netesova N.A. GLAD-PCR assay of DNA methylation sites in regulatory regions of some tumor-suppressor genes in breast cancer. Siberian Journal of Oncology. 2021; 20(6): 41-54. - doi: 10.21294/18144861-2021-20-6-41-54
применение glad-пцр-анализа для изучения метилирования днк в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке молочной железы
Н.А. Сметанникова1, М.А. Абдурашитов2, А.Г. Акишев2, П.И. Поздняков1, Е.В. Дубинин3, А.Б. Карпов45, И.В. Вихлянов6, М.К. Никитин6, С.М. Солдатова7, Н.А. Нетесова1
ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» Роспотребнадзора, г Новосибирск, Россия1
Россия, 630559, Новосибирская область, р.п. Кольцово. E-mail: smetannikova@vector.nsc.ru1
ООО «СибЭнзайм», г. Новосибирск, Россия2
Россия, 630117, г Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2/122
ООО «ЭпиДжин», г Новосибирск, Россия3
Россия, 630090, г Новосибирск, ул. Инженерная, 183
ФГУП «Северский биофизический научный центр» ФМБА России, г. Северск, Россия4 Россия, 636039, г Северск, Коммунистический пр-т, 874 ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Томск, Россия5 Россия, 634050, г Томск, ул. Московский тракт, 25
КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер», г. Барнаул, Россия6 Россия, 656045, г Барнаул, ул. Змеиногорский тракт, 110к6
ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр» ФМБА России, г. Северск, Россия7 Россия, 636000, г Северск, ул. Мира, 47
Аннотация
Аберрантное метилирование ДНК на начальных стадиях канцерогенеза приводит к инактивации ряда генов и показано для многих онкологических заболеваний. Ранее с помощью метода С1_АО-ПЦР анализа нами были выявлены аберрантно метилированные сайты R(5mC)GY, которые могут рассматриваться как эпигенетические маркеры при диагностике колоректального рака, рака легкого и рака желудка. При раке молочной железы, по литературным данным, наблюдается метилирование регуляторных участков генов ALX4, BMP2, CCND2, CDH13, CDX1, FOXA1, GALR1, GATA5, GREM1, Н1С1, НМХ2, НБ3БТ2, НОХС10, 1САМ5, LAMA1, RARB, RASSF1A, RUNX3, RXRG, RYR2, SFRP2, БОХ17, TERT и ZNF613. В настоящей работе было проведено определение аберрантно метилированных сайтов RCGY в регуляторных участках данных генов в препаратах ДНК из тканей рака молочной железы. Анализ образцов ДНК из операционного материала опухолей (п=30) и морфологически неизмененных тканей молочной железы (п=22) показал высокую диагностическую эффективность панели маркеров, включающей сайты R(5mC)GY в составе генов CCND2, ВМР2, GALR1, SOX17, НМХ2 и HS3ST2\ суммарные показатели чувствительности и специфичности составляют 90,0 и 100,0 % соответственно.
Ключевые слова: рак молочной железы, гены-онкосупрессоры, метилирование ДНК, СЬАР-ПЦР-анализ.
Сметанникова Наталья Анатольевна, smetannikova@vector.nsc.ru СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ. 2021; 20(6): 41-54
glad-pcr assay of dna methylation sites in regulatory regions of some tumor-suppressor
genes in breast cancer
N.A. smetannikova1, M.A. Abdurashitov2, A.G. Akishev2, p.l. pozdnyakov1, E.V. Dubinin3, A.B. Karpov45, l.V. Vihlyanov6, M.K. Nikitin6, s.M. soldatova7, N.A. Netesova1
State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», Koltsovo, Russia1
630559, Novosibirsk region, Koltsovo, Russia1
SibEnzyme Ltd, Novosibirsk, Russia2
2/12, Ac. Timakov Street, 630117, Novosibirsk, Russia2
EpiGene Ltd, Novosibirsk, Russia3
18, Inzhenernaya Street, 630090, Novosibirsk, Russia3
Seversk Biophysical Research Centre, Seversk, Russia4
87, Kommunistitcheskiy Ave., 636039, Seversk, Russia4
Siberian State Medical University, Tomsk, Russia5
2, Moskovskiy Trakt, 634050, Tomsk, Russia5
Altai Regional Oncology Center, Barnaul, Russia6
110k, Zmeinogorskiy Trakt, 656045, Barnaul, Russia6
Siberian Federal Research and Clinical Centre, Seversk, Russia7
4, Mira Street, 636000, Seversk, Russia7
Abstract
Hypermethylation of the RCGY sites is shown for many cancer diseases. Such aberrant methylation, suppressing the gene activity, occurs at early stages of carcinogenesis. Recently, using GLAD-PCR assay, we have detected aberrantly methylated RCGY sites, which can be considered to be epigenetic markers of colorectal, lung, and gastric cancers. In breast cancer, methylation of the regulatory regions of ALX4, BMP2, CCND2, CDH13, CDX1, FOXA1, GALR1, GATA5, GREM1, HIC1, HMX2, HS3ST2, HOXCIO, ICAM5, LAMA1, RARB, RASSF1A, RUNX3, RXRG, RYR2, SFRP2, SOX17, TERT, and ZNF613 tumor-suppressor genes is reported. In the present work, we determined aberrantly methylated RCGY sites in the regulatory regions of these genes in DNA preparations from breast cancer tissues. The study of DNA samples from 30 tumor and 22 normal mammary tissue samples demonstrates a high diagnostic potential of selected R(5mC)GY sites in regulatory regions of CCND2, BMP2, GALR1, SOX17, HMX2, and HS3ST2 genes with total index of sensitivity and specificity for R(5mC)GY detection in tumor DNA 90.0 % and 100.0 %, respectively.
Key words: breast cancer, tumor-suppressor genes, DNA methylation, GLAD-pcR assay.
Введение
В 2020 г. рак молочной железы (РМЖ) стал наиболее распространенным злокачественным новообразованием во всем мире: ~2,3 млн выявленных случаев составили 11,7 % от всех впервые зарегистрированных случаев рака. По числу летальных исходов (более 685 тыс.) РМЖ вышел на пятое место в структуре общей смертности от онкологических заболеваний [1]. Основная причина высокой смертности заключается в том, что в 40-70 % случаев диагностируется РМЖ Ш-1У стадий, что определяет неблагоприятный прогноз [2]. При раннем выявлении (стадии 1А-11В) РМЖ пятилетняя выживаемость достигает 99 % [3].
Наиболее перспективным направлением ранней диагностики РМЖ считается эпигенетический анализ: определение в ДНК опухолевых клеток метильных групп, присоединенных к цитозино-вым основаниям в регуляторных участках генов-
онкосупрессоров, уровень экспрессии которых при этом значительно снижается. Данная модификация геномной ДНК обнаруживается уже на начальных стадиях канцерогенеза, что имеет решающее значение для раннего выявления онкологических заболеваний, включая РМЖ [4].
Аберрантное метилирование ДНК с образованием 5-метилцитозина (5тС) осуществляется ДНК-метилтрансферазами Dnmt3a и Dnmt3b, узнающими преимущественно сайт RCGY (где R - А или G, Y - Т или С). В результате в обеих цепях ДНК возникает модифицированная последовательность R(5mC)GY [5]. Способность метил-зависимой ДНК-эндонуклеазы GlaI специфически распознавать и расщеплять (как показано стрелкой) именно сайты R(5mC)jGY позволила нам разработать способ идентификации сайта R(5mC)GY в конкретной позиции генома [6]. Данный метод, получивший название GLAD-ПЦР, мы впослед-
ствии применили для исследования статуса метилирования генов-онкосупрессоров в опухолевых тканях при колоректальном раке, раке легкого и желудка [7-10].
GLAD-ПЦР-анализ включает три стадии: 1) гидролиз ДНК ферментом GlaI 2) присоединение к концам гидролизованной ДНК с помощью ДНК-лигазы (Ъ) специфического адаптера (AD); 3) ПЦР в режиме реального времени (степень метилирования сайта R(5mC)GY определяет значение порогового цикла (Cq)) (рис. 1). На последнем этапе используются геномный праймер и флуоресцентный зонд, комплементарные участку ДНК вблизи определяемого сайта GlaI, и второй (гибридный) праймер с нуклеотидной последовательностью 5'-CCTGCTCTTTCATCGGYNN-3', где пятнадцать 5'-концевых нуклеотидов соответствуют адаптеру, а четыре 3' -концевых нуклеотида комплементарны геномной последовательности в точке гидролиза ДНК ферментом GlaI [6].
Благодаря субстратной специфичности ДНК-эндонуклеазы GlaI метод GLAD-ПЦР позволяет определять сайт R(5mC)GY в заданном положении генома даже в условиях избытка молекул ДНК, где этот сайт неметилирован. GLAD-ПЦР-анализ характеризуется более высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов в сравнении с методиками, основанными на бисульфитной конверсии ДНК (часто сопровождаемой деградацией и значительными потерями исследуемого материала) либо использующими метил-чувствительные эндо-нуклеазы рестрикции (не способные распознавать частично метилированную ДНК - наиболее характерный паттерн метилирования CpG-островков на самых ранних стадиях канцерогенеза). К важным
преимуществам GLAD-ПЦР относятся также значительно меньшая трудоемкость и дороговизна исследования, отличающие применение специфичных метил-связывающих белков [6,11].
Целью исследования явилось применение GLAD-ПЦР-анализа для определения аберрантно метилированных сайтов R(5mC)GY в регулятор-ных областях генов-онкосупрессоров в препаратах ДНК из тканей РМЖ.
Материал и методы
Материалом для исследования служили образцы ДНК, выделенные из тканей опухолей молочной железы, полученных в ходе оперативного вмешательства у 30 женщин в возрасте от 52 до 78 лет (средний возраст - 63,1 ± 1,3 года, s=6,7). Операционный материал собран в мае - августе 2017 г. в КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» (г. Барнаул) и КГБУЗ «Областной клинический онкологический диспансер» (г. Кемерово). У большинства пациенток диагностирован инвазивный протоковый рак (n=22) различной степени диф-ференцировки. В остальных случаях был выявлен инвазивный дольковый (n=7) или смешанный (n=1) рак. У 9 больных установлена I клиническая стадия РМЖ (T1N0M0), у 16 - II стадия (T0-1N1M0, T2-3N0-1M0), у 5 - III стадия (T0-2N2M0, T3N1-2M0, T4N0-2M0, T0-4N3M0).
В зависимости от иммуногистохимических характеристик 3 опухолевых образца были отнесены к люминальному подтипу А, включающему гормонозависимые опухоли, положительные по рецепторам эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), не имеющие рецепторов эпидермального фактора роста HER2, с низким индексом пролифератив-
Рис. 1. Схема метода GLAD-ПЦР Fig. 1. Scheme of the GLAD-PCR method
ной активности (Ki67<20 %). Для 17 образцов определен люминальный подтип B, включающий HER2-HeraraBHbie опухоли с высоким индексом пролиферативной активности (Ki67>20 %), РЭ-положительные с низкими или отрицательными значениями РП, либо НЕЯ2-позитивные опухоли, РЭ-положительные с любыми значениями Ki67 и РП. Две опухоли были отнесены к HER2-позитивному подтипу (гормононезависимые (РЭ-, РП-) с избытком рецепторов HER2), 8 - к тройному негативному подтипу (РЭ-, РП-, HER2-). В качестве сравнительного контроля были использованы образцы ДНК, выделенные из фрагментов морфологически неизмененных тканей молочной железы, взятых у 22 больных на значительном удалении от опухолевого очага, на линии резекции.
Неоадъювантную химиотерапию больные не получали вследствие малой степени распространенности опухолевого процесса либо наличия сопутствующих заболеваний, расцененных на момент планирования лечения как фактор, способный привести к утяжелению общего состояния. У всех пациенток получено информированное согласие на участие в исследовании.
Каждый тканевой образец помещали в пробирку с раствором RNA-later и хранили в течение суток в холодильнике при температуре +4 °С, затем переносили в морозильную камеру и хранили при температуре -20 °С. Выделение и очистку ДНК проводили методом фенольно-хлороформной экстракции [7].
По результатам анализа опубликованных литературных данных нами был проведен предварительный отбор генов-онкосупрессоров, регу-ляторные области которых потенциально содержат метилированные сайты RCGY - эпигенетические маркеры РМЖ. При отборе учитывались следующие критерии: присутствие в регуляторной области гена минимум одного сайта RCGY; при наличии нескольких таких сайтов - расстояние между ними не менее 50 п.н., достаточное для одновременной гибридизации на данном участке ДНК геномного праймера и флуоресцентного зонда; возможность подбора для исследуемого участка ДНК праймера и зонда, теоретически не подверженных образованию вторичных структур, ауто- и кросс-димеров, а также гибридизации с последовательностью адаптера; GC-состав исследуемого участка ДНК, не превышающий 76 %; уникальность нуклеотид-ной последовательности исследуемого участка ДНК (невхождение его в состав повторяющихся элементов генома).
На основании приведенных критериев мы сформировали исходную панель из 24 генов, содержащих потенциально метилированные сайты RCGY: ALX4 [12], BMP2 [13], CCND2 [14], CDH13 [15], CDX1 [16], FOXA1 [17], GALR1 [18], GATA5 [19], GREM1 [14, 20], HIC1 [21], HMX2 [22], HS3ST2 [23], HOXC10 [24], ICAM5 [14], LAMA1
[25], RARB [26], RASSF1A [27], RUNX3 [28], RXRG [29], RYR2 [29], SFRP2 [14, 30], SOX17 [14], TERT [31], ZNF613 [32].
Для исследования потенциальных эпигенетических маркеров РМЖ в составе регуляторных участков генов-онкосупрессоров подбирали специфичные системы праймеров и флуоресцентных зондов (табл. 1). Для этого использовали ну-клеотидные последовательности из базы данных GenBank (http://ncbi.nlm.nih.gov/genbank) по версии генома человека GRCh38.p13, семейство программ «Vector NTI 11.5» (Invitrogen, США) и онлайн-ресурс «BLAST» (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
В ходе предварительных экспериментов в регуляторной области каждого гена выявляли максимально метилированный сайт R(5mC)GY. Для всех сайтов RCGY, расположенных в пределах 200 п.н. от участка гибридизации геномного праймера и флуоресцентного зонда, определяли гибридные праймеры, комплементарные концевым тетрану-клеотидам, получаемым после гидролиза последовательности NNR(5mC)^GYNN. Наименьшее значение Cq в ПЦР в режиме реального времени указывало на максимальную степень метилирования сайта R(5mC)GY [6,7].
Для постановки всех этапов GLAD-ПЦР применяли реагенты производства ООО «Сибэнзайм». Ферментативный гидролиз ДНК проводили в течение 30 мин при 30 °С. Реакционная смесь (объемом 21,5 мкл) включала 9,0 нг ДНК исследуемого образца, 1* SE-буфер TMN (10 мМ Трис-HCl (pH 7,9), 5 мМ MgCl2, 25 мМ NaCl), 2,0 % диметилсульфоксида (ДМСО), 2,0 мкг бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1,5 ед. акт. эндонуклеазы Glal. Для лигирования продуктов гидролиза с адаптером (в объеме 30,0 мкл) к каждой пробе добавляли АТР до конечной концентрации 0,5 мМ, универсальный двухцепо-чечный адаптер (5 ' -CCTGCTCTTTCATCG-3 '/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5', где p - фосфатная группа) до конечной концентрации 0,5 мкМ и 240 ед. акт. высокоактивной Т4-ДНК-лигазы. Реакцию проводили в течение 15 мин при 25 °С. На заключительной стадии в реакционную смесь вносили компоненты ПЦР до следующих концентраций в конечном объеме 60,0 мкл: ^SE-буфер GLAD (50 мМ Трис^04 (pH 9,0), 30 мМ KCl, 10 мМ [NH4]2SO4), 3 мМ MgCl2, смесь dNTP до 0.2 мМ каждого, 0,1 мкг/мкл БСА, соответствующую смесь двух праймеров и зонда до 0,4 мкМ каждого, 0,04 ед. акт./мкл SP Taq-ДНК-полимеразы. Для повышения эффективности амплификации GC-богатых участков генов GATA5, GREM1, HIC1, ICAM5 и RUNX3 в ПЦР-смесь дополнительно добавляли ДМСО до концентрации 4 %. Затем по 20,0 мкл полученной смеси переносили в три отдельные микропробирки и проводили ПЦР в режиме реального времени в детектирующем амплификаторе «CXF-96» (Bio-Rad Lab., США) по программе:
Таблица 1/Table 1
Геномные праймеры и флуоресцентные зонды, применявшиеся для исследования генов, потенциально содержащих онкомаркеры РМЖ Genomic primers and fluorescent probes used to study genes potentially containing breast cancer tumor
markers
Ген/ Genea Наименование белкового продукта1/ Protein product namea Хромосомная локализация генаУ Chromosomal gene localizationaa Структура геномных праймеров/ флуоресцентных зондовь/ Structure of genomic primers/fluorescent probesb
ALX4 ALX homeobox 4 11p11.2 CGTCAACAACCTCTCATCC FAM-TCCATTTCTTATTTCAGTTTGCCACCA-BHQ1
BMP2 bone morphogenetic protein 2 20p12.3 CGAGTTGCGGCTGCTCAGC FAM-CCTGAAACAGAGACCCACCCCCAGC-BHQ1
CCND2 cyclin D2 12p13.32 GAAAGGCAACCCCCCCCAA FAM-CGTCTTGGCCTCAGGTCCCCGC-BHQ1
CDH13 Cadherin 13 16q23.3 GCTGGCTGGCGAGGCAGA FAM-CCTCTCCTCAAAGCCTGGCTCCCAC-BHQ1
CDX1 caudal type homeobox 1 5q32 CAGCTTCGCTGGCATTCGG FAM-CCCCCTCCAGACTTTAGCCCGGTGC-BHQ1
FOXA1 forkhead box protein A1 14q21.1 FAM-TCTCCTTCCATCTTGGCCTCGGCTC-BHQ1 AGAGGCTGGGAGCTGGACGA
GALR1 galanin receptor 1 18q23 FAM-TGCAGCAGAGAAGCCCCTGGCACC-BHQ1 GGCGAGAGCTCTTTTGGGAGGC
GATA5 GATA binding protein 5 20q13.33 FAM-CCGAGCCCGCAGCCCCCC-BHQ1 CCCCTCGATGCTGTCCTACCTGT
GREM1 gremlin 1, DAN family BMP antagonist 15q11-13 FAM-CTCCGCCCACTCACATCCCTGCC-BHQ1 GAGCGGGTCCTGGGTTGGTT
HIC1 hypermethylated in cancer 1 17p13.3 FAM-CTTGTAGTCGTCGCCGTCGCCGC-BHQ1 GGCTGGGGTCCTCGCTGCTA
HMX2 H6 family homeobox 2 10q26.13 CCAAGGGGTCCAAGGAGTCGG FAM-CCGCAGCCGCCAGGAACCCG-BHQ1
HS3ST2 heparan sulfate-glucosamine 3-O-sulfotransferase 2 16P12.2 GCCTCCCGGAGGAGTACTATGCC FAM-CACCTTCGTTTCACCGCCCCAAAGC-BHQ1
HOXC10 homeobox protein C10 12q13.13 GAGGGGGGCAGGGGAGAG FAM-CCCAGGAGGCCCCAGACCATTTC-BHQ1
ICAM5 intercellular adhesion molecule 5 19p13.2 FAM-CTCCCTCCCAGGCCCCGCCC-BHQ1 AGGGGGAAGAGTCCGCAGCTC
LAMA1 laminin, alpha 1 18p11.31 FAM-CTGACCGCGGCCGCCTCCC-BHQ1 CCACCTTCTCTGCCCACCTCCTA
RARB retinoic acid receptor, beta 3p24 TTCAGAGGCAGGAGGGTCTATTC FAM-TCCCAGTCCTCAAACAGCTCGCATGG-BHQ1
RASSF1A Ras association domain family member 1 3p21.31 ATGTCGGGGGAGCCTGAG FAM-TGCCAGCTCCCGCAGCTCAAT-BHQ1
RUNX3 runt related transcription factor 3 1P36.11 CCGGGGAGGGAGGTGTGAA FAM-CCGTAGACCCAAGCACCAGCCGC-BHQ1
RXRG retinoid X receptor, gamma 1q22-q23 GCCGCCGTCACCGCTACT FAM-CCACCGCCGTCGCTGCTGC-BHQ1
RYR2 ryanodine receptor 2 (cardiac) 1q43 FAM-TTTCCCCCAAGTCAAGGTGCTGCGAAA-BHQ1 GGGGACCACGGAGGCGACT
SFRP2 secreted frizzled related protein 2 4q31.3 CCAGCCCTCCTCGGATTACCC FAM-CTCCCTTGCTCCCCCCACCCTCC-BHQ1
SOX17 SRY (sex determining region Y)-box 17 8q11.23 CGCCCTCCGACCCTCCAA FAM-TCCCGGATTCCCCAGGTGGCC-BHQ1
TERT telomerase reverse transcriptase 5p15.33 FAM-CTCCCTGCAACACTTCCCCGCGA-BHQ1 AAAGAGAAATGACGGGCCTGTGTC
ZNF613 zinc finger protein 613 19q31.41 GTGTTGCGGGGAGCTCTCG FAM-CCTCGCTCGGAGTTCGTTTCGCAG-BHQ1
Примечание: ■ - обозначение, хромосомная локализация полное и наименование белковых продуктов генов приводятся согласно указаниям Международного комитета по номенклатуре генов - HUGO Gene Nomenclature Committee [33]; b - структура прямого или обратного геномного праймера приводится соответственно перед или после структуры зонда. В последовательности флуоресцентных зондов FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, BHQ1 - Black Hole Quencher 1.
Note: a - designation, chromosomal localization, and the full name of protein products of genes are given according to the instructions of the International Committee on Gene Nomenclature - HUGO Gene Nomenclature Committee [33]; b - the structure of the forward or reverse genomic primer is listed, respectively, before or after the structure of the probe. In the sequence of fluorescent probes FAM - 6-carboxyfluorescein, BHQ1 - Black Hole Quencher 1.
Таблица 2/Table 2
Сайты RCGY, отобранные для GLAD-ПЦР-анализа, их локализация в геноме и структура
соответствующих им гибридных праймеров RCGY sites selected for GLAD-PCR analysis, their localization in the genome and the structure
of the corresponding hybrid primers
reH/Gene Сшт/Site Координаты сайта1/ Структура гибридного праймераь/
Site coordinates1 Hybrid primer structureb
ALX4 ACGT chr11:44304756-44304759 CCTGCTCTTTCATCGGTCC
BMP2 ACGC chr20:6770341-6770344
CCTGCTCTTTCATCGGTCC
CCND2 GCGC chr12:4274691-4274693 CCTGCTCTTTCATCGGCGG
GALR1 GCGC chr18: 77249828-77249831
CCTGCTCTTTCATCGGCGG
HMX2 ACGC chr10:123147940-123147943 CCTGCTCTTTCATCGGTCT
HS3ST2 GCGT chr16:22814023-22814026 CCTGCTCTTTCATCGGCGG
RARB ACGC chr3: 25428374-25428377 CCTGCTCTTTCATCGGTTC
SOX17 GCGC chr8: 54458724-54458727 CCTGCTCTTTCATCGGCCG
ZNF613 GCGC chr19: 51887759-51887762 CCTGCTCTTTCATCGGCGT
Примечание: a - координаты сайта даны в соответствии с последней сборкой генома человека GRCh38.p13; b - подчеркнут З'-концевой тетрануклеотид гибридного праймера, комплементарный последовательности ДНК в точке гидролиза GlaI.
Note: a - Site coordinates are given according to the latest assembly of the human genome GRCh38.p13; b - The З'-tetranucleotide of the hybrid primer complementary to the DNA sequence at the GlaI hydrolysis point is underlined.
3 мин при 95 оС и 45 циклов - 10 c при 95 °С, 15 с при 61 °С, 20 с при 72 °С. Для устранения влияния возможных начальных флуктуаций на форму кривой амплификации флуоресценцию на первых пяти циклах ПЦР не детектировали.
Скрининг наиболее часто метилированных сайтов R(5mC)GY в составе регуляторных областей генов-онкосупрессоров проводили на ограниченных выборках из 10 препаратов ДНК, исследуя все образцы в трех повторах. Критерием отбора сайта для последующего анализа всей коллекции образцов ДНК опухолевых (n=30) и морфологически неизмененных тканей (n=20) больных РМЖ служило среднее значение Cq < 30, полученное по меньшей мере для одного из 10 образцов. Поскольку степень метилирования сайтов RCGY в регуляторных областях части исследуемых генов не удовлетворяла указанному критерию, из дальнейшей работы были исключены сайты в составе генов CDH13, CDX1, FOXA1, GATA5, GREM1, HIC1, HOXC10, ICAM5, LAMA1, RASSF1A, RUNX3, RXRG, RYR2, SFRP2 и TERT. Сайты R(5mC)GY, отобранные для исследования полной коллекции клинических образцов ДНК из тканей больных РМЖ, и соответствующие им гибридные праймеры приведены в табл. 2.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программного обеспечения «MedCalc 15.11» (MedCalc Software, Бельгия). Исходя из значений Cq в ПЦР в режиме реального времени, для анализируемых маркеров вычисляли точки отсечения - пороговые величины Cq, дифференцирующие положительные и отрицательные случаи. Результаты работы алгоритма визуализировали с помощью характеристических кривых (ROC-кривые; англ. Receiver Operating
Characteristic Curves) - графиков зависимости процента верно диагностированных положительных случаев (чувствительность) от процента ложно-положительных случаев (100-специфичность) для различных возможных значений диагностического теста. Площадь под ROC-кривой (ППК) является интегральным показателем диагностической эффективности маркера (для «идеального» теста ППК=1) [34].
Для отбора оптимальной комбинации маркеров с максимальным суммарным значением ППК, которая дает возможность наиболее результативно дифференцировать образцы ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей, применяли метод логистической регрессии. Данный алгоритм позволяет анализировать связи между несколькими независимыми переменными (значения Cq, пропорциональные степени метилирования исследованных сайтов R(5mC)GY) и зависимой переменной (принадлежность образца к опухолевым или морфологически неизмененным тканям).
Результаты и обсуждение
На рис. 2 отображены результаты GLAD-ПЦР-анализа метилированных сайтов RCGY в препаратах ДНК из клинических образцов, на рис. 3 -ROC-кривые, полученные при статистической обработке данных GLAD-ПЦР девяти сайтов R(5mC) GY. В табл. 3 приведены числовые значения параметров, рассчитанных для каждого из исследованных маркеров: показателей чувствительности и специфичности, величины ППК, выраженной в виде доли от всей площади квадрата с указанием стандартной ошибки измерения, и 95 % доверительного интервала.
Характерным эпигенетическим нарушением при канцерогенезе является локальное гиперметилирование так называемых CpG-островков в регулятор-ных областях генов-онкосупрессоров, которые в норме не содержат метильных групп. В настоящее время показано, что подобное аберрантное метилирование характерно для начальных стадий большинства ненаследственных (спорадических) форм рака, составляющих в среднем более 90 % всех случаев злокачественных новообразований [4]. Описано большое количество генов с разнообразными биологическими функциями, регуляторные области которых характеризуются различиями уровня метилирования ДНК в клетках РМЖ и морфологически неизмененных тканей [14, 32].
GLAD-ПЦР-анализ сайтов R(5mC)GY в генах ALX4, BMP2, CCND2, GALR1, HMX2, HS3ST2, RARB, SOX17 и ZNF613 показывает, что значения Cq для маркеров BMP2, CCND2, GALR1, HMX2, HS3ST2 и ZNF613, связанные отрицательной корреляционной зависимостью со степенью метилирования сайта [6], в большинстве образцов ДНК РМЖ в среднем на шесть и более циклов ниже значений Cq в образцах ДНК из морфологически неизмененных тканей. В то же время для маркера ALX4 это различие минимально (менее 1,5 циклов), что обусловливает перекрывание диапазонов стандартных отклонений и делает невозможным использование данного маркера для выявления опухолевых тканей. Для сайтов R(5mC)GY в составе генов SOX17 и RARB разность средних величин Cq для двух групп ДНК-образцов составляет около трех циклов, но в последнем случае отмечается большой разброс индивидуальных значений (рис. 2).
Статистический анализ результатов GLAD-ПЦР (рис. 3 и табл. 3) демонстрирует, что сайты R(5mC)GY в составе генов CCND2, BMP2, GALR1, SOX17, HMX2 и HS3ST2 характеризуются наиболее сбалансированным соотношением чувствительности и специфичности теста. Полученные значения ППК более 0,8 свидетельствуют, согласно общепринятым критериям оценки данных ROC, о высоком диагностическом потенциале указанных маркеров [34].
Комплексный анализ данных ROC с применением метода логистической регрессии показывает, что комбинация маркеров CCND2, BMP2, GALR1, SOX17, HMX2 и HS3ST2, охватывая всю коллекцию исследованных образцов, дает максимальную величину ППК=0,988 и позволяет дифференцировать образцы ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей с наибольшей эффективностью. Как видно из табл. 3, суммарные показатели чувствительности и специфичности для панели эпигенетических маркеров РМЖ составляют соответственно 90,0 и 100 %.
Полученные результаты хорошо коррелируют с опубликованными ранее данными по метилированию генов в тканях РМЖ, полученными с
применением метода бисульфитной конверсии с последующим проведением метил-специфичной ПЦР [13, 23] либо секвенированием на NGS-платформе [14, 18, 22, 32]. При этом обращает внимание, что для 4 подтипов РМЖ, дифференцируемых по рецепторному статусу опухолей (люми-нальный А, люминальный В, НЕИ2-позитивный, тройной негативный), обнаружены различия в профиле метилирования генов-онкосупрессоров, включая представленные в табл. 3 гены CCND2, GALR1, 80X17, НМХ2, Ш38Т2 и 2Ж613 [14, 18, 22, 23, 26, 32].
2. Ы et а1. показали, что аберрантное метилирование регуляторных участков генов CCND2 и S0X17 ассоциировано с развитием люминальных подтипов А и В [14]. Согласно данным S.K. Kas-sim et а1., для люминального подтипа В характерно также гиперметилирование промотора гена HS3ST2 [23]. В клетках РМЖ НЕК2-позитивного подтипа детектируется аберрантное метилирование генов GALR1, S0X17 и 2Ж613 [14, 18, 32]. По данным С. Stirzaker et а1., гиперметилирование промотора, обусловливающее инактивацию гена HMX2, является отличительным признаком тройного негативного подтипа РМЖ [22].
По результатам ЯОС-анализа данных GLAD-ПЦР, полученных нами при исследовании сайтов R(5mC)GY в вышеназванных генах, большинство исследованных образцов РМЖ по каждому из маркеров определяются как положительные (табл. 3). Это относится и к генам GALR1, ZNF613 и HMX2, аберрантное метилирование которых ассоци-ировано с подтипами РМЖ, представленными в исследованной нами выборке незначительным числом образцов. Отмеченное несоответствие может быть связано с тем, что в предшествующих работах оценивали статус метилирования всего пула CpG-динуклеотидов в составе изучаемых генов, в то время как метод GLAD-ПЦР выявляет сайты R(5mC)GY в конкретных позициях генома человека (табл. 2), метилирование которых может быть общим признаком всех подтипов РМЖ.
Выводы, сделанные в перечисленных исследованиях, основывались на сравнении средних значений степени метилирования ДНК в выборках образцов тканей без определения частотных показателей метилирования или экспрессии генов для групп «РМЖ» и «морфологически неизмененная ткань». Такие данные описаны для генов BMP2, RARB и ALX4, также представленных в табл. 3.
М. Du et а1. выявили значимое снижение уровня экспрессии мРНК BMP2 в 23 из 32 (71,88 %) исследованных образцов тканей РМЖ, соответствующее высокой частоте (68,75 %) аберрантного метилирования регуляторной области гена [13]. Выполненное нами исследование показало абсолютную диагностическую специфичность сайта RCGY в составе гена BMP2 - все образцы морфо-
Рис. 2. Результаты GLAD-ПЦР анализа выбранных R(5mC)GY сайтов в препаратах ДНК из образцов тканей больных РМЖ. По оси ординат приведены значения Cq с диапазонами стандартных отклонений. По оси абсцисс указаны номера исследованных
образцов тканей (о - опухоль, н - неизмененная ткань на линии резекции) Fig. 2. Results of GLAD-PCR analysis of selected R (5mC) GY sites in DNA preparations from tissue samples from breast cancer patients. The ordinate shows Cq values with standard deviation ranges. The abscissa shows the numbers of the tissue samples examined
(o - tumor, н - unchanged tissue on the resection line)
логически неизмененных тканей определяются как отрицательные (табл. 3).
При исследовании 48 пар образцов тканей, полученных от больных РМЖ, K. Yari et al. показали, что метилированные формы гена RARB обнаруживаются исключительно в опухолевых образцах с частотой 10,4 % [26]. Анализ данных, полученных нами для эпигенетического маркера RARB, также выявил низкий уровень диагностической чувствительности (табл. 3).
J. Yang et al. наблюдали инактивацию гена ALX4 при метилировании промотора во всех трех исследованных клеточных линиях РМЖ и в 69,44 % (75
Рис. 3. ROC-кривые, полученные для результатов GLAD-ПЦР-анализа сайтов R(5mC)GY в препаратах ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей больных РМЖ. По оси ординат приведены показатели чувствительности (%); по оси абсцисс - процент ложноположитель-ных случаев (100-специфичность) для различных значений диагностических тестов Fig. 3. ROC curves obtained for the results of GLAD-PCR analysis of R (5mC) GY sites in DNA
preparations from tumor and morphologically unchanged tissues of breast cancer patients. The ordinate shows the sensitivity indicators (%), the abscissa shows the percentage of false-positive cases (100-specificity) for different values of diagnostic tests
из 108 образцов) первичных опухолей, тогда как в неизмененных тканях молочной железы этот ген не был метилирован [12]. Однако в проведенном нами исследовании сайта Я(5тС)ОУ в гене ALX4 около трети образцов неизмененных тканей были определены как положительные (табл. 3).
Подобные расхождения могут быть обусловлены, в частности, особенностями морфологических характеристик РМЖ в выборках, исследованных разными авторами. Известно, что гистологически РМЖ представляет собой весьма разнородную группу злокачественных новообразований, которые могут различаться по профилю метилирования
Таблица 3/rable 3
Данные Roc-анализа результатов GLAD-ПЦР, полученных при исследовании сайтов R(5m0) GY в образцах ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей больных РМЖ
(в порядке уменьшения значений ППК) Data of Roc analysis of GLAD-pcR results obtained in the study of R(5mc)gY sites in DNA samples from tumor and morphologically unchanged tissues of breast cancer patients
(in order of decreasing Auc values)
Ген/ Gene
§ £
й £
u .-¡3
H и
S й
p s
H 00 и
Й
й §
£ £
¡5 ч
3 и
Щ ё й is
§ T3
ЁЧэ
ft о
(U о
й ^ О ©ч
чд in
ч© 0\
04
in
CCND2 26/30 86,7 % 21/22 95,5 % 0,926 (0,038) 0,818-0,980
ZNF613 24/29 82,8 % 16/22 72,7 % 0,828 (0,058) 0,697-0,919
ALX4 24/29 82,8 % 16/22 72,7 % 0,762 (0,072) 0,622-0,870
RARB 9/29 31,0 % 21/22 95,5 % 0,599 (0,081) 0,452-0,734
Комбинация генов CCND2, BMP2, GALR1, SOX17, HMX2, HS3ST2 27/30 90,0 % 22/22 100,0 % 0,988 (0,011) 0,909-1,000
ДНК. Помимо основных форм (неинвазивный/ инвазивный внутрипротоковый и дольковый рак) описан целый ряд особых вариантов РМЖ: папиллярный, тубулярный, аденокистозный, секреторный, апокриновый, метапластический, болезнь Педжета и др., на общую долю которых приходится до 20-25 % всех случаев заболевания [35]. Кроме того, нельзя исключить зависимости статуса метилирования генов от расово-этнической принадлежности пациенток [36].
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. GLOBOCAN 2020 Database Provides Latest Global Data on Cancer Burden, Cancer Deaths [Internet]. URL: https://ascopost.com/news/ december-2020/globocan-2020-database-provides-latest-global-data-on-cancer-burden-cancer-deaths/ (cited 19.04.2021).
2. Руководство по ранней диагностике рака. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 2018. 38 с. [Guide to cancer early diagnosis. Geneva: World Health Organization, 2018. 38 p. (in Russian)].
3. Breast Cancer Survival Rates [Internet]. URL: https://www.webmd. com/breast-cancer/guide/breast-cancer-survival-rates (19.04.2021).
4. Hesson L.B., PritchardA.L. Clinical Epigenetics. Springer Singapore, 2019. P. 153-171. doi: 10.1007/978-981-13-8958-0.
5. GaoL., EmperleM., Guo Y., Grimm S.A., Ren W., Adam S., Uryu H., Zhang Z.M., Chen D., Yin J., Dukatz M., Anteneh H., Jurkowska R.Z.,
Заключение
Полученные результаты показывают, что метод GLAD-ПЦР позволяет определять метилированные сайты R(5mC)GY в регуляторных областях генов-онкосупрессоров в образцах ДНК, выделенных из тканей РМЖ. При исследовании клинических образцов показана высокая диагностическая эффективность панели эпигенетических маркеров РМЖ, включающей сайты R(5mC)GY в составе генов CCND2, BMP2, GALRI, SOX17, HMX2 и HS3ST2: общие показатели чувствительности и специфичности теста составляют соответственно 90,0 и 100,0 %.
Lu J., Wang Y., Bashtrykov P., Wade P.A., Wang G.G., Jeltsch A., Song J. Comprehensive structure-function characterization of DNMT3B and DNMT3A reveals distinctive de novo DNA methylation mechanisms. Nat Commun. 2020 Jul 3; 11(1): 3355. doi: 10.1038/s41467-020-17109-4.
6. Кузнецов В.В., Акишев А.Г., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Способ определения нуклеотидной последовательности Pu(5mC)GPy в заданном положении протяженной ДНК. Патент РФ № 2525710. Заявл. 13.06.2013. Опубл. 20.08.2014. [Kuznetsov V.V., Akishev A.G., Ab-durashitovM.A., Degtyarev S.Kh. Method of detecting nucleotide sequence Pu(5mC)GPy at predetermined position of long-distance DNA. The patent of Russian Federation No 2525710. 20.08.2014. (in Russian)].
7. Евдокимов А.А., НетесоваН.А., СметанниковаН.А., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Давидович Е.С., Кузнецов В.В., ЕрмолаевЮ.Д., Карпов А.Б., Сазонов А.Э., Тахауов Р.М., Дегтярев С.Х. Применение
метода GLAD-ПЦР анализа для выявления сайтов метилирования в регуляторных областях генов-онкосупрессоров ELMO1 и ESR1 при колоректальном раке. Вопросы онкологии. 2016; 62(1): 117-21. [EvdokimovA.A., NetesovaN.A., SmetannikovaN.A., AbdurashitovM.A., Akishev A.G., Davidovich E.S., Kuznetsov V.V., Ermolaev Yu.D., Kar-pov A.B., Sazonov A.E., Takhauov R.M., Degtyarev S.Kh. Application of GLAD-PCR analysis for the methylation sites detection in the regulatory areas of tumor-suppressor genes ELMO1 and ESR1 in colorectal cancer. Problems in Oncology. 2016; 62(1): 117-21. (in Russian)].
8. EvdokimovAA,NetesovaN.A., SmetannikovaNA.,AbdurashitovMA., Akishev A.G. GLAD-PCR Assay of DNA Methylation Markers Associated with Colorectal Cancer. Biol Med (Aligarh) 8: 342. doi: 10.4172/09748369.1000342.
9. SmetannikovaNA., EvdokimovAA,NetesovaN.A., AbdurashitovMA., AkishevA.G., DubininE.V., PozdnyakovP.I., VihlyanovI.V., NikitinM.K., Topolnitsky E.B., Karpov A.B., Kolomiets S.A., Degtyarev S.K. Application of GLAD-PCR Assay for Study on DNA Methylation in Regulatory Regions of Some Tumor-Suppressor Genes in Lung Cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2019 Sep 20; 22(9): 551-561. doi: 10.3779/j. issn.1009-3419.2019.09.01.
10. Малышев Б.С., Нетесова Н.А., Сметанникова Н.А., Абдура-шитов М.А., Акишев А.Г., Дубинин Е.В., Азанов А.З., Вихлянов И.В., НикитинМ.К., Карпов А.Б., Дегтярев С.Х. GLAD-ПЦР-анализ сайтов метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке желудка. Acta Naturae. 2020; 12(3): 124-133. doi: 10.32607/ actanaturae.11070. [Malyshev B.S., Netesova N.A., Smetannikova N.A., A bdurashitovM.A., Akishev A. G., Du binin E. V., AzanovA.Z., Vihlyanov I. V, Nikitin M.K., Karpov A.B., Degtyarev S.Kh. GLAD PCR assay of DNA methylation sites in regulatory regions of some tumor-suppressor genes in breast cancer. Acta Naturae. 2020; 12(3): 124-133. (in Russian)]. doi: 10.32607/actanaturae.11070.
11.ДубининЕ.В,ЕвдокимовАА, НетесоваНА., СметанниковаНА., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Давидович Е.С., Дегтярев С.Х., КузнецовВ.В., МихеевВ.Н., Карпов А.Б., МалышевБ.С., ФедотовВ.В. Способ определения метилирования сайтов PuCGPy регулятор-ных областей генов-онкомаркеров колоректального рака методом GLAD-ПЦР-анализа и набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для осуществления указанного способа. Патент РФ № 2630669. Заявл. 16.07.2015. Опубл. 10.09.2017. [Dubinin E.V., Evdokimov A.A., Netesova N.A., Smetannikova N.A., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Davidovich E.S., Degtyarev S.Kh., Kuznetsov V.V., Miheev V.N., Karpov A.B., Malyshev B.S., Fedotov V.V. Method of determining the methylation sites PuCGPy regulatory regions of genes-markers of colorectal cancer by GLAD-PCR-analysis and oligonucleotide primers and fluorescent-labelled probes for realizing said method. The patent of Russian Federation No 2630669. 10.09.2017. (in Russian)].
12. Yang J., Han F., Liu W, Chen H, Hao X., Jiang X., Yin L., Huang Y, Cao J., Zhang H., Liu J. ALX4, an epigenetically down regulated tumor suppressor, inhibits breast cancer progression by interfering Wnt/p-catenin pathway. J Exp Clin Cancer Res. 2017 Nov; 36(1): 170. doi: 10.1186/ s13046-017-0643-9.
13. Du M, Su X.M., Zhang T, Xing Y.J. Aberrant promoter DNA methylation inhibits bone morphogenetic protein 2 expression and contributes to drug resistance in breast cancer. Mol Med Rep. 2014 Aug; 10(2): 1051-5. doi: 10.3892/mmr.2014.2276.
14. Li Z, Guo X., Wu Y, Li S, Yan J., Peng L, Xiao Z, Wang S, Deng Z., Dai L., Yi W., Xia K., Tang L., Wang J. Methylation profiling of 48 candidate genes in tumor and matched normal tissues from breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat. 2015 Feb; 149(3): 767-79. doi: 10.1007/s10549-015-3276-8.
15. Yang J., Niu H., Huang Y., Yang K. A Systematic Analysis of the Relationship of CDH13 Promoter Methylation and Breast Cancer Risk and Prognosis. PLoS One. 2016 May 6; 11(5): e0149185. doi: 10.1371/ journal.pone.0149185.
16. Liu J., Sun X., Qin S., Wang H, DUN, Li Y, Pang Y, Wang C, Xu C., Ren H. CDH1 promoter methylation correlates with decreased gene expression and poor prognosis in patients with breast cancer. Oncol Lett. 2016 Apr; 11(4): 2635-2643. doi: 10.3892/ol.2016.4274.
17. Jing X., Liang H., Hao C., Hongxia L., Cui X. Analyses of an epi-genetic switch involved in the activation of pioneer factor FOXA1 leading to the prognostic value of estrogen receptor and FOXA1 co-expression in breast cancer. Aging (Albany NY). 2019; 11(18): 7442-7456. doi: 10.18632/aging.102250.
18. Lindqvist B.M., Wingren S., Motlagh P.B., Nilsson T.K. Whole genome DNA methylation signature of HER2-positive breast cancer. Epigenetics. 2014 Aug; 9(8): 1149-62. doi: 10.4161/epi.29632.
19. Wang D., Yang P.N., Chen J., Zhou X.Y., Liu Q.J, Li H.J, Li C.L. Promoter hypermethylation may be an important mechanism of the transcriptional inactivation of ARRDC3, GATA5, and ELP3 in invasive ductal breast carcinoma. Mol Cell Biochem. 2014; 396(1-2): 67-77. doi: 10.1007/s11010-014-2143-y.
20. de Groot J.S., PanX., Meeldijk J., van der WallE., vanDiestP.J., Moelans C.B. Validation of DNA promoter hypermethylation biomarkers in breast cancer-- a short report. Cell Oncol (Dordr). 2014 Aug; 37(4): 297-303. doi: 10.1007/s13402-014-0189-1.
21. Cheng G., Sun X., Wang J., Xiao G., Wang X., Fan X., Zu L, Hao M., Qu Q., Mao Y., Xue Y., Wang J. HIC1 silencing in triple-negative breast cancer drives progression through misregulation of LCN2. Cancer Res. 2014 Feb; 74(3): 862-72. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-13-2420.
22. Stirzaker C, ZotenkoE, Song J.Z., Qu W, Nair S.S., Locke W.J., Stone A., Armstong N.J., Robinson M.D., Dobrovic A., Avery-Kiejda K.A., Peters K.M., French J.D., Stein S, Korbie D.J., Trau M, Forbes J.F., ScottR.J., BrownM.A., Francis G.D., Clark S.J. Methylome sequencing in triple-negative breast cancer reveals distinct methylation clusters with prognostic value. Nat Commun. 2015 Feb 2; 6: 5899. doi: 10.1038/ ncomms6899.
23. Kassim S.K., Shehata H.H., Abou-AlhusseinM.M., Sallam M.M., Amin I.I. Laboratory validation of formal concept analysis of the methylation status of microarray-detected genes in primary breast cancer. Tumour Biol. 2017 Jun; 39(6): 1010428317698390. doi: 10.1177/1010428317698390.
24. Pathiraja T.N., NayakS.R., Xi Y, Jiang S, Garee J.P., Edwards D.P, Lee A.V., Chen J., Shea M.J., Santen R.J., Gannon F., Kangaspeska S., Jelinek J., Issa J.P., Richer J.K., Elias A., McIlroy M., Young L.S., Davidson N.E., Schiff R., Li W., Oesterreich S. Epigenetic reprogramming of HOXC10 in endocrine-resistant breast cancer. Sci Transl Med. 2014 Mar 26; 6(229): 229ra41. doi: 10.1126/scitranslmed.3008326.
25. Симонова О.А., КузнецоваЕ.Б., ПоддубскаяЕ.В., Кекеева Т.В., КеримовР.А., ТроценкоИ.Д., ТанасА.С., РуденкоВ.В., АлексееваЕ.А., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Гены ламининов, конститутивно и аномально метилированные при раке молочной железы. Молекулярная биология. 2015; 49(4): 667-677. [Simonova O.A., KuznetsovaE.B., Poddubskaya E.V., Kekeeva T.V., Kerimov R.A., Trotsenko I.D., Tanas A.S., Rudenko V.V., Alekseeva E.A., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. DNA methylation in the promoter regions of the laminin family genes in normal and breast carcinoma tissues. Molecular Biology. 2015; 49(4): 598-607. (in Russian)].
26. Yari K., Rahimi Z. Promoter Methylation Status of the Retinoic Acid Receptor-Beta 2 Gene in Breast Cancer Patients: A Case Control Study and Systematic Review. Breast Care (Basel). 2019; 14(2): 117-123. doi: 10.1159/000489874.
27. Hagrass H.A., Pasha H.F., Shaheen M.A., Abdel Bary E.H., Kassem R. Methylation status and protein expression of RASSF1A in breast cancer patients. Mol Biol Rep. 2014; 41(1): 57-65. doi: 10.1007/ s11033-013-2837-3.
28. Garattini E., Bolis M, Garattini S.K., Fratelli M., Centritto F., Paroni G., Gianni'M., Zanetti A., Pagani A., Fisher J.N., Zambelli A., Terao M. Retinoids and breast cancer: from basic studies to the clinic and back again. Cancer Treat Rev. 2014 Jul; 40(6): 739-49. doi: 10.1016/j. ctrv.2014.01.001.
29. WuH.C., SoutheyM.C., HibshooshH, SantellaR.M., TerryM.B. DNA Methylation in Breast Tumor from High-risk Women in the Breast Cancer Family Registry. Anticancer Res. 2017; 37(2): 659-664. doi: 10.21873/anticanres.11361.
30. Lin I.H., Chen D.T., Chang Y.F., Lee Y.L., Su C.H., Cheng C, Tsai Y.C., Ng S.C., Chen H.T., Lee M.C., Chen H.W., Suen S.H., Chen Y.C., Liu T.T., Chang C.H., Hsu M.T. Hierarchical clustering of breast cancer methylomes revealed differentially methylated and expressed breast cancer genes. PLoS One. 2015 Feb 23; 10(2): e0118453. doi: 10.1371/journal. pone.0118453.
31. Masood S, El-Gabry E, Zhang C, Wang Z. DNA Methylation of the hTERT Gene in Breast Cancer Revisited: Diagnostic and Clinical Implications. Lab Med. 2016 Nov; 47(4): 293-299. doi: 10.1093/labmed/ lmw043.
32. SilvaT.C., CoetzeeS.G., GullN, YaoL., Hazelett D.J., Noushmehr H, Lin D.C., Berman B.P. ELMER v.2: an R/Bioconductor package to reconstruct gene regulatory networks from DNA methylation and trans-criptome profiles. Bioinformatics. 2019; 35(11): 1974-1977. doi: 10.1093/ bioinformatics/bty902.
33. HUGO Gene Nomenclature Committee. The resource for approved human gene nomenclature [Internet]. URL: http://www.genenames.org (cited 2021 Apr 19).
34. Логистическая регрессия и ROC-анализ - математический аппарат [Интернет]. URL: https://loginom.ru/blog/logistic-regression-roc-auc (дата обращения: 19.04.2021). [Logistic regression and ROC analysis - mathematical apparatus [Internet]. URL: https://loginom.ru/ blog/logistic-regression-roc-auc (cited 19.04.2021). (in Russian)].
35. «Золотой стандарт» диагностики и лечения рака молочной железы 2021. Российское общество онкомаммологов. Версия 2.0. 176 с. [Интернет]. URL: http://www.abvpress.ru/project/ www.abvpress. ru/KP_POOM_12.10.20.pdf (дата обращения: 19.04.2021). [«Gold Standard» for breast cancer diagnosis and treatment 2021. Russian society of oncomammologists. Version 2.0. 176 p. [Internet]. URL: http://www.
abvpress.ru/project/www.abvpress.ru/KP_POOM_12.10.20.pdf (cited 19.04.2021). (in Russian)].
36. Xia Y.Y., Ding Y.B., Liu X.Q., Chen XM, Cheng S.Q., Li L.B., Ma M.F., He J.L., Wang Y.X. Racial/ethnic disparities in human DNA
methylation. Biochim Biophys Acta. 2014; 1846(1): 258-62. doi: 10.1016/j.bbcan.2014.07.001.
Поступила/Received 20.04.2021 Принята в печать/Accepted 16.08.2021
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Сметанникова Наталья Анатольевна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник отдела геномных исследований, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Россия). E-mail: smetannikova@vector.nsc.ru. SPIN-код: 8548-9071. Researcher ID (WOS): A-5864-2014. Author ID (Scopus): 650423744. ORCID: 0000-0002-5082-8071.
Абдурашитов Мурат Абдурашитович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ООО «СибЭнзайм» (г. Новосибирск, Россия). SPIN-код: 3360-3217. Researcher ID (WOS): A-6433-2014. Author ID (Scopus): 6701811260. Акишев Александр Григорьевич, старший научный сотрудник, ООО «СибЭнзайм» (г. Новосибирск, Россия). SPIN-код: 5976-0887. Researcher ID (WOS): A-6476-2014. Author ID (Scopus): 6701467349.
Поздняков Павел Иванович, кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник разработки и производства средств диагностики, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцово, Россия). SPIN-код: 1427-6109. Researcher ID (WOS): A-6604-2014. Author ID (Scopus): 6603478957.
Дубинин Евгений Викторович, кандидат экономических наук, генеральный директор ООО «ЭпиДжин» (г. Новосибирск, Россия). SPIN-код: 4473-9233. Author ID (Scopus): 57188727732. ORCID: 0000-0003-3384-8406.
Карпов Андрей Борисович, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе, ФГУП «Север-ский биофизический научный центр» ФМБА России (г. Северск, Россия); профессор кафедры организации здравоохранения и общественного здоровья, Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России (г. Томск, Росиия). SPIN-код: 4393-5855. Researcher ID (WOS): R-7251-2016. Author ID (Scopus): 5594444960. ORCID: 0000-0002-0119-2740. Вихлянов Игорь Владиславович, доктор медицинских наук, главный врач КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» (г. Барнаул, Россия). Author ID (Scopus): 57211021828.
Никитин Максим Константинович, заведующий отделением, КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» (г. Барнаул, Россия).
Солдатова Светлана Михайловна, заведующая отделением, ФГБУ «Сибирский федеральный научно-клинический центр» ФМБА России (г. Северск, Россия).
Нетесова Нина Александровна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией отдела геномных исследований, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, Россия). SPIN-код: 2615-3101. Researcher ID (WOS): A-6485-2014. ORCID: 0000-00029896-5403.
ВКЛАД АВТОРОВ
Сметанникова Наталья Анатольевна: сбор и обработка данных, статистический анализ, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Абдурашитов Мурат Абдурашитович: разработка концепции и планирование научной работы, сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Акишев Александр Григорьевич: сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Поздняков Павел Иванович: сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Дубинин Евгений Викторович: сбор и обработка данных, статистический анализ, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Карпов Андрей Борисович: сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Вихлянов Игорь Владиславович: сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Никитин Максим Константинович: сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Солдатова Светлана Михайловна: сбор и обработка данных, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Нетесова Нина Александровна: разработка концепции и планирование научной работы, сбор и обработка данных, статистический анализ, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания.
Финансирование
Работа проводилась при финансовой поддержке фонда Сколково (грант № Г102/16 от 06 декабря 2016 г).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ABOUT THE AUTHORS
Natalya A. Smetannikova, PhD, Senior Researcher, Department of Genomic Research, State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector» (Koltsovo, Russia). E-mail: smetannikova@vector.nsc.ru. Researcher ID (WOS): A-5864-2014. Author ID (Scopus): 650423744. ORCID: 0000-0002-5082-8071.
Murat A. Abdurashitov, PhD, Senior Researcher, SibEnzaim LLC (Novosibirsk, Russia). Researcher ID (WOS): A-6433-2014. Author ID (Scopus): 6701811260.
Alexander G. Akishev, PhD, SibEnzaim LLC (Novosibirsk, Russia). Researcher ID (WOS): A-6476-2014. Author ID (Scopus): 6701467349.
Pavel I. Pozdnyakov, PhD, Leading Researcher of Development and Production of Diagnostic Tools, State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector» (Koltsovo, Russia). Researcher ID (WOS): A-6604-2014. Author ID (Scopus): 6603478957. Evgeny V. Dubinin, PhD, General Director of EpiGin LLC (Novosibirsk, Russia). Author ID (Scopus): 57188727732. ORCID: 00000003-3384-8406.
Andrey B. Karpov, MD, DSc, Professor, Deputy Director for Research, Federal State Unitary Enterprise «Seversk Biophysical Scientific Center» FMBA of Russia (Seversk, Russia); Professor of the Department of Healthcare Organization and Public Health, Siberian State Medical University of the Ministry of Health of Russia (Tomsk, Russia). Researcher ID (WOS): R-7251-2016. Author ID (Scopus): 5594444960. ORCID: 0000-0002-0119-2740.
Igor V. Vikhlyanov, MD, DSc, Chief Physician of the Altai Regional Oncological Dispensary (Barnaul, Russia). Author ID (Scopus): 57211021828.
Maksim K. Nikitin, MD, Head of Department, Altai Regional Oncological Dispensary (Barnaul, Russia). Svetlana M. Soldatova, Head of Department, Siberian Federal Research and Clinical Center, FMBA of Russia (Seversk, Russia). Nina A. Netesova, DSc, Head of the Laboratory of the Department of Genomic Research, State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector» (Koltsovo, Russia). Researcher ID (WOS): A-6485-2014. ORCID: 0000-0002-9896-5403.
AUTHOR CONTRIBUTION
Natalya A. Smetannikova: development of methodology, data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Murat A. Abdurashitov: study conception and design, data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Alexander G. Akishev: development of methodology, data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Pavel I. Pozdnyakov: data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Evgeny V. Dubinin: data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Andrey B. Karpov: data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Igor V. Vikhlyanov: data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Maksim K. Nikitin: data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Svetlana M. Soldatova: data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Nina A. Netesova: conception and design, data collection and analysis, writing, review, revision of the manuscript.
Funding
The present study was supported by the Skolkovo fund (grunt № G102/16 from 06.12.2016). Conflicts of interests
Authors declare lack of the possible conflicts of interests.
