CC BY
41
УДК 577.2:616-06
GLAD-ПЦР-анализ сайтов метилирования ДНК в регуляторных областях генов-онкосупрессоров при раке желудка
Б. С. Малышев1, Н. А. Нетесова1, Н. А. Сметанникова1, М. А. Абдурашитов2, А. Г. Акишев2, Е. В. Дубинин2*, А. З. Азанов3, И. В. Вихлянов4, М. К. Никитин4, А. Б. Карпов5, С. Х. Дегтярев1,2 Тосударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Новосибирская обл., р.п. Кольцово, 630559 Россия 2ООО «ЭпиДжин», Новосибирск, 630090 Россия
3Областной клинический онкологический диспансер, Кемерово, 650036 Россия 4Алтайский краевой онкологический диспансер, Алтайский край, Барнаул, 656049 Россия 5Северский биофизический научный центр ФМБА России, Томская обл., Северск, 636039 Россия
*E-mail: evgeny.dubinin@epigene.ru Поступила в редакцию 20.01.2020 Принята к печати 22.07.2020 DOI: 10.32607/actanaturae.11070
РЕФЕРАТ На ранних стадиях канцерогенеза опухолевая ДНК подвергается аберрантному метилированию регуляторных областей ряда генов-онкосупре^оров по сайтам RCGY, служащих субстратом для ДНК-метилтрансферазы Dnmt3. Выявление аберрантно метилированных сайтов в ДНК различных опухолей считается первым шагом в создании эпигенетических ПЦР тест-систем для ранней диагностики онкозаболеваний. Ранее мы разработали метод GLAD-ПЦР, позволяющий определять сайт R(5mC)GY в конкретной позиции генома человека даже в условиях значительного избытка молекул ДНК с неметилированным сайтом RCGY в этой позиции. Цель настоящей работы состояла в определении аберрантно метилированных сайтов R(5mC)GY в регуляторных областях генов-онкосупрессоров (brinpl, bves, cacna2d3, cdhll, cpebl, epha7, fgf2, galrl, gata4, hopx, hs3st2, irxl, lrrc3b, pcdh10, rprm, runx3, sfrp2, sox17, tcf21, tfpi2, wnt5a, zfp82 и znf331) в препаратах ДНК из тканей рака желудка с помощью GLAD-ПЦР-анализа. На образцах ДНК из операционного материала опухолей (n = 29) и морфологически неизмененных тканей (n = 25) показан высокий диагностический потенциал панели эпигенетических онкомаркеров рака желудка, состоящей из сайтов R(5mC)GY в регуляторных участках генов irxl, cacna2d3 и epha7: суммарные показатели чувствительности и специфичности составляют 96.6 и 100.0% соответственно.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА рак желудка, гены-онкосупрессоры, метилирование ДНК, GLAD-ПЦР-анализ, метилза-висимая сайт-специфичная ДНК-эндонуклеаза GlaI.
ВВЕДЕНИЕ
Рак желудка (РЖ) - одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний, занимающее третье место в мире по числу смертельных исходов (более 700 тысяч в год) [1]. По данным ВОЗ, в 2018 году диагностировано свыше 1 млн новых случаев РЖ, а число умерших составило примерно 783 тысячи [2].
Прогноз заболевания в значительной степени зависит от клинической стадии, но в целом остается достаточно неблагоприятным: только у 40% пациентов к моменту постановки диагноза болезнь явля-
ется потенциально излечимой, а общая пятилетняя выживаемость при РЖ в большинстве стран мира не превышает 25-30% [3, 4]. Вместе с тем выявление заболевания на ранней стадии (1А-1В) позволяет увеличить этот показатель до 80% и более [5, 6].
Перспективным инструментом раннего выявления и мониторинга РЖ считается эпигенетическая ДНК-диагностика, включающая определение аберрантно метилированных регуляторных участков генов-онкосупрессоров в опухолевой ДНК, которые инактивируются при такой модификации. Аберрантное метилирование характерно для на-
чальных стадий большинства ненаследственных (спорадических) форм рака, составляющих в среднем более 90% всех случаев злокачественных новообразований [7, 8].
Известно, что метилирование ДНК de novo, в том числе и аберрантное, осуществляют ДНК-метил-трансферазы Dnmt3a и Dnmt3b, которые узнают преимущественно сайт RCGY (где R - A или G, Y - T или C) и модифицируют его с образованием последовательности R(5mC)GY в обеих цепях ДНК [5]. В дальнейшем метилирование таких сайтов поддерживается в ходе репликации ДНК-метилтрансферазой Dnmtl [9].
Метилзависимая сайт-специфичная ДНК-эндо-нуклеаза GlaI узнает и расщепляет именно сайты R(5mC)GY, что делает ее удобным инструментом для изучения метилирования ДНК [10]. На основе уникальной специфичности фермента GlaI нами ранее был разработан метод GLAD-ПЦР, позволяющий выявлять сайты R(5mC)GY в геноме даже в условиях значительного избытка молекул ДНК, в которых эти сайты неметилированы [11].
GLAD-ПЦР отличается более высокой чувствительностью и воспроизводимостью результатов в сравнении с общепринятым методом бисульфит-ного секвенирования ДНК, поскольку бисульфитная конверсия часто сопровождается существенной деградацией ДНК и значительными потерями исследуемого материала [11].
Ранее мы применили метод GLAD-ПЦР для изучения метилирования генов-онкосупрессоров в тканях колоректального рака и выявили аберрантное метилирование сайтов RCGY в генах fbnl, cnripl, adhfel, ryr2, sept9I и eid3 более чем в 75% образцов опухолевой ДНК [12, 13].
Цель данной работы состояла в применении GLAD-ПЦР-анализа для обнаружения аберрантно метилированных сайтов R(5mC)GY в регуляторных областях генов-онкосупрессоров в ДНК из тканей РЖ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалом для анализа служили образцы ДНК, выделенные из опухолей слизистой желудка, полученных от 29 пациентов в ходе оперативного вмешательства. Во всех случаях диагностирована аденокарцинома желудка различной степени диффе-ренцировки. Пять больных имели I клиническую стадию заболевания (T1N0-1M0, T2N0M0), 11 - II стадию (T1N2-3M0, T2N1-2M0, T3N0-1M0, T4aN0M0), 10 - III стадию (T2N3M0, T3N2-3M0, T4aN1-3M0, T4bN0-3M0), у трех пациентов выявлена IV стадия РЖ (наличие отдаленных метастазов (М1) при любом размере первичной опухоли (T) и наличии или от-
сутствии метастатического поражения регионарных лимфатических узлов (N)).
В качестве сравнительного контроля использовали образцы ДНК, выделенные из фрагментов морфологически неизмененной слизистой желудка, взятой у 25 больных на линии резекции - на расстоянии не менее 5 см от макроскопически определяемого края опухоли.
От всех пациентов получено информированное согласие на участие в исследовании.
Образцы тканей, полученные при выполнении оперативного вмешательства, помещали в пробирку, содержащую раствор RNA-later, и хранили в течение суток в холодильнике при температуре +4°С, затем переносили в морозильную камеру и хранили при температуре -20°С [12].
Выделение и очистку ДНК проводили методом фе-нольно-хлороформной экстракции [14].
GLAD-ПЦР-анализ
GLAD-ПЦР-анализ образцов ДНК включал три стадии: 1) гидролиз ДНК ферментом GlaI; 2) лиги-рование полученных гидролизатов ДНК с универсальным адаптером; 3) последующую ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентного зонда и первого праймера, комплементарных целевому участку ДНК, а также второго праймера, соответствующего последовательности адаптера и участку ДНК вблизи определяемого сайта GlaI (рис. 1).
Для постановки всех этапов GLAD-ПЦР применяли реагенты производства ООО «Сибэнзайм».
Ферментативный гидролиз ДНК проводили в течение 30 мин при 30°С. Реакционная смесь (объемом 21.5 мкл) включала 9.0 нг ДНК исследуемого образца, 1х SE-буфер TMN (10 мМ Трис-HCl (pH 7.9), 5 мМ MgCl2, 25 мМ NaCl), 2.0% диметилсульфоксида (ДМСО), 2.0 мкг бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 1.5 ед. акт. эндонуклеазы GlaI.
Для лигирования продуктов гидролиза с адаптером (в объеме 30.0 мкл) к каждой пробе добавляли АТР и универсальный двухцепочечный адаптер (5'-CCTGCTCTTTCATCG-3'/3'-p-GGACGAGAAAGTAGC-p-5') до конечной концентрации каждого 0.5 мкМ и 240 ед. акт. высокоактивной Т4-ДНК-лигазы. Реакцию проводили в течение 15 мин при 25°С.
На заключительной стадии в реакционную смесь вносили компоненты ПЦР до следующих концентраций в конечном объеме 60.0 мкл: 1х SE-буфер GLAD (50 мМ Трис^04 (pH 9.0), 30 мМ KCl, 10 мМ [NH4]2SO4), 3 мМ MgCl2, смесь dNTP по 0.2 мМ каждого, 0.1 мкг/мкл БСА, соответствующую смесь двух праймеров и зонда по 0.4 мкМ каждого, 0.05 ед. акт.
1) Гидролиз Glal ДНК
R(5mC)4.GY YGî(5mC)R
GlaI
NNR(5mC) GYNN NNYG (5mC)RNN
2) Лигирование с универсальным олигонуклеотидным адаптером Универсальный
адаптер
3) ПЦР в режиме реального времени
Геномный TaqMan-праймер зонд
Гибридный праймер
Рис. 1. Схема метода GLAD-ПЦР
SP Taq-ДНК-полимеразы. Для повышения эффективности амплификации GC-богатых участков гена tfpi2 в ПЦР-смесь дополнительно добавляли ДМСО до концентрации 4%.
Затем по 20.0 мкл полученной смеси переносили в три отдельные микропробирки и проводили ПЦР в режиме реального времени в детектирующем ам-плификаторе «CXF-96» (Bio-Rad Lab., США) по программе: 3 мин при 95оС и 45 циклов - 10 c при 95°С, 15 с при 61°С (bves, gata4, sox17, tcf21) или при 62°С (cacna2d3, galrl, hs3st2, pcdh10, rprm, sfrp2, wnt5a), или при 63°С (cdhll, cpebl, fgf2, hopx, tfpi2, zfp82), 20 с при 72°С. Для устранения влияния возможных начальных флуктуаций на форму кривой амплификации флуоресценцию на первых пяти циклах ПЦР не детектировали.
Подбор специфичных праймеров и зондов
Для подбора специфичных праймеров и зондов анализировали нуклеотидные последовательности, представленные в базе данных GenBank (http://
ncbi.nlm.nih.gov/genbank), по версии генома человека GRCh38/hg38, семейство программ Vector NTI 11.5 (Invitrogen, США) и онлайн-ресурс BLAST (http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov). Структуры использованных в работе праймеров и зондов приведены в табл. 1.
Гибридные праймеры, соответствующие сайтам R(5mC)GY, метилированным с наибольшей частотой, подбирали экспериментально. Каждый такой праймер имеет нуклеотидную последовательность 5'-CCTGCTCTTTCATCGGYNN-3', где 15 5'-конце-вых нуклеотидов соответствуют адаптеру, а четыре 3'-концевых нуклеотида (подчеркнуты) комплементарны геномной последовательности в точке гидролиза ДНК. В регуляторной области каждого гена с применением гибридных праймеров, соответствующих концевым тетрануклеотидам, получаемым после гидролиза последовательности NNR(5mC) + GYNN, проанализированы все сайты RCGY, расположенные в пределах ~200 п.н. от участка гибридизации флуоресцентного зонда. Наименьшее значение порогового цикла (Cq), получаемое в ПЦР в режиме реального времени, указывало на максимальную степень метилирования сайта R(5mC)GY [12, 13].
Статистический анализ
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программного обеспечения MedCalc 15.11 (MedCalc Software, Бельгия). Исходя из значений Cq образцов ДНК для анализируемых сайтов RCGY получали характеристические кривые (ROC-кривые; Receiver Operating Characteristic Curves) с 95% доверительным интервалом. Величина площади под ROC-кривой (ППК) отображает взаимосвязь чувствительности и специфичности диагностического теста. ППК является интегральным показателем диагностической эффективности сайта-онкомаркера (в «идеальном» тесте ППК = 1) [15].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Определение кандидатных генов-онкомаркеров рака желудка
К настоящему времени показано, что развитие РЖ ассоциировано с эпигенетической инактивацией целого ряда генов. По опубликованным данным мы сформировали исходную панель из 23 генов-онко-супрессоров, сайты RCGY в регуляторных областях которых мы исследовали методом GLAD-ПЦР. Эта панель включает гены brinpl [16], bves [17], cacna2d3 [18], cdhll [16], cpebl [19], epha7, fgf2, galrl [16], gata4 [20], hopx [21], hs3st2 [16], irxl [17], lrrc3b [22], pcdhlO [23], rprm [24], runx3, sfrp2 [17], soxl7 [25], tcf2l [26], tfpi2 [27], wnt5a [17], znf33l [28] и znf545 [29].
Таблица 1. Структуры праймеров и флуоресцентных зондов, используемых для GLAD-ПЦР-анализа генов-онко-маркеров РЖ
Ген3 Кодируемый белковый продукт3 Локализация гена в хромосоме3 Последовательность первого праймера и флуоресцентного зондаь
brinpl BMP / retinoic acid inducible neural specific 1 9q33.1 FAM-CCGTAAAGTCCCCTTCGCTGGTCCC-BHQ1 GAGCCGGGATTCATGCCTGTC
bves Blood vessel epicardial substance 6q21 CCGGCGGCATTCGTCGTT FAM-CCCTACCCGGACCGCACTTCTCGAA-BHQ1
cacna2d3 Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit alpha2delta 3 3p21.1-p14.3 FAM-CGCACTCGGGAAAAGCACTAAGAGCCTC-BHQ1 CGAGGGAGAAGGACTGCTACCGA
cdhll Cadherin 11 16q21 CGCTCCAGCTGGCCAGGC FAM-CTTCCCCCAACCACCATCCCGGC-BHQ1
cpebl Cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1 15q25.2 CTGCCCTGGGCCTCAGTTTCC FAM-CCCCTGCGAGCGGCGGCG-BHQ1
epha7 EPH receptor A7 6q16.1 FAM-CCAAGCACGGAGCCCGGACAGTGA-BHQ1 CCCAGCCCGCGGAGGTTC
fgf2 Fibroblast growth factor 2 4q28.1 CGGGGTCCGGGAGAAGAGC FAM-CCGACCCGCTCTCTCCGCCTCATT-BHQ1
galrl Galanin receptor 1 18q23 FAM-TGCAGCAGAGAAGCCCCTGGCACC-BHQ1 GGCGAGAGCTCTTTTGGGAGGC
gata4 GATA binding protein 4 8p23.1 CCTTTCTGGCCGGCCTCCT FAM-AGTCCCTGGACCCCAGCCCCGA-BHQ1
hopx HOP homeobox 4q12 CGGGCAGAAGCGATGGGAGA FAM-CCCGCCGGGCTGCCCTCC-BHQ1
hs3st2 Heparan sulfate-glucosamine 3-sulfotransferase 2 16p12.2 GCCTCCCGGAGGAGTACTATGCC FAM-CACCTTCGTTTCACCGCCCCAAAGC-BHQ1
irxl Iroquois homeobox 1 5p15.33 GCCAGGGAGCGGGTAGCGA FAM-CTCCACGGGCCTGCTTCTGCGG-BHQ1
lrrc3b Leucine rich repeat containing 3B 3p24.1 FAM-TGCTCACCCCGTGCTGTGCAACTTG-BHQ1 GGGCTGGGGGAAGGGCAA
pcdh10 Protocadherin 10 4q28.3 CCGGCCCTTGTATCTCTGGTGC FAM-CCGCCCATCTCTGCTCCCACAACG-BHQ1
rprm Reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator homolog 2q23.3 CCCCGTTCAAATTCGCAGGC FAM-CCCCCCACCCCTTCTCCCACAATGA-BHQ1
runx3 Runt related transcription factor 3 1p36.11 FAM-CCCTCCCAACTGTAGCCGGCCCC-BHQ1 CTGGGGCGATAATTCGGAATGA
sfrp2 Secreted frizzled related protein 2 4q31.3 FAM-CTCCCTTGCTCCCCCCACCCTCC-BHQ1 CCAGCCCTCCTCGGATTACCC
sox17 SRY (sex determining region Y)-Box 17 8q11.23 CGCCCTCCGACCCTCCAA FAM-TCCCGGATTCCCCAGGTGGCC-BHQ1
tcf21 Transcription factor 21 6q23.2 FAM-TGCCCCCCGACACCAAGCTCTCC-BHQ1 CCAGCCTGAGCGTGTCCAGC
tfpi2 Tissue factor pathway inhibitor 2 7q21.3 CCGAGCGGAGGGGCCTCT FAM-AGCGAGTCCCCCCTGCCAGCG-BHQ1
wnt5a Wnt family member 5A 3p14.3 FAM-CCCTTCCCTGCCCTCCCCACAGC-BHQ1 CAGGTGTGGGGTGGGAGGGA
zfp82 Zinc finger protein 82 19q13.12 FAM-CAGCTGCAGAGAAATGGCCCTCGGTC-BHQ1 CCCCAGCATCCTCTGCCCAC
znf331 Zinc finger protein 331 19q13.42 FAM-CCGCACACTCGCTGGCCCTTTCAC-BHQ1 GCCCGATCCCGACCAGTCAC
аОбозначение, хромосомная локализация генов и наименования конечных белковых продуктов приведены согласно указаниям Международного комитета по номенклатуре генов - HUGO Gene Nomenclature Committee (http://www.genenames.org).
bB последовательности флуоресцентных зондов FAM - 6-карбоксифлуоресцеин, BHQ1 - Black Hole Quencher 1.
Таблица 2. Сайты RCGY, выбранные для GLAD-ПЦР-анализа, их локализация в геноме и последовательности соответствующих им гибридных праймеров
Ген Сайт Координаты сайтаа Гибридный праймерь
Ътinp1 GCGC Лг9: 119369161-119369164 CCTGCTCTTTCATCGGCGG
^ев GCGC Лг6:105137614-105137617 CCTGCTCTTTCATCGGCGC
cacna2d3 GCGC Лг3:54120898-54120901 CCTGCTCTTTCATCGGCGA
cpeЪ1 GCGC Лг15: 82648343-82648347 CCTGCTCTTTCATCGGCGG
epha7 GCGC Лг6:93419955-93419958 CCTGCTCTTTCATCGGCGA
д01т1 GCGC сМ8:77249828-77249831 CCTGCTCTTTCATCGGCGG
пх1 GCGC Лг5:3596424-35966427 CCTGCTCTTTCATCGGCGG
1ттс3Ь GCGC Лг3:26623493-26623500 CCTGCTCTTTCATCGGCGG
pcdh10 GCGT Лг4:133152953-1331152956 CCTGCTCTTTCATCGGCGA
типх3 GCGT Лг1:24931357-24931360 CCTGCTCTTTCATCGGTGG
sfтp2 GCGC Лг4:153789030-15379033 CCTGCTCTTTCATCGGCGC
^21 GCGC Лг6:133889653-133889658 CCTGCTCTTTCATCGGCGA
tfpi2 GCGC Лг7:93890478-93890481 CCTGCTCTTTCATCGGCGC
г^331 GCGT сМ9:53521737-53521740 CCTGCTCTTTCATCGGTCT
а Координаты сайта приведены в соответствии с последней сборкой генома человека GRCh38/hg38. ь Подчеркнут З'-концевой тетрануклеотид гибридного праймера, комплементарный последовательности ДНК в точке гидролиза ферментом GlaI.
Выявление сайтов RCGY в ДНК из тканей РЖ, перспективных для GLAD-ПЦР-анализа
На первом этапе использовали случайную выборку из 10 препаратов опухолевой ДНК, выделенных из тканей РЖ, с помощью которой отобрали наиболее часто метилированные сайты RCGY в пределах регу-ляторных областей генов-онкосупрессоров как описано ранее [12, 13].
В качестве критерия отбора сайтов RCGY, перспективных для проведения GLAD-ПЦР-анализа, использовали значение Cq, которое не должно превышать 30 по меньшей мере у одного из 10 образцов. По результатам предварительного анализа для дальнейшего исследования всей коллекции образцов ДНК опухолевых (п = 29) и морфологически неизмененных тканей (п = 25) больных РЖ отобрали по одному сайту RCGY в составе генов Ьт1пр1, bves, cacna2d3, срвЪ1, epha7, да1т1,1тх1, 1ттс3Ь, pcdh10, типхЗ, sfтp2, ^21, tfpi2 и г^331 (табл. 2).
GLAD-ПЦР-анализ сайтов метилирования в препаратах ДНК из клинических образцов
GLAD-ПЦР-анализ выбранных сайтов RCGY выполняли в трех повторах, каждый из которых содержал 3.0 нг ДНК (~103 копий исследуемого участка гена). Диаграммы на рис. 2 отображают средние значения Cq для исследованных сайтов.
Результаты анализа сайтов R(5mC)GY в генах Ьves, cacna2d3, среЬ1, epha7, да1т и tfpi2 показывают, что значения Cq (23-27) для большинства образцов опухолевой ДНК в среднем на три и более цикла
ниже значений Cq для соответствующих образцов ДНК из здоровых тканей. В то же время у маркеров Ьтinp1, 1ттс3Ь, типхЗ, tcf21 и г^331 это различие в значении Cq для основной части образцов ДНК невелико (менее 1.5 цикла), что затрудняет их использование для выявления опухолевой ткани из-за возможного перекрывания диапазона стандартных отклонений.
На рис. 3 показаны ROC-кривые, полученные при статистической обработке данных GLAD-ПЦР 14 сайтов RCGY, а в табл. 3 представлены значения рассчитанных параметров. В столбцах 2 и 3 указано количество положительных результатов для опухолевых тканей по каждому гену и соответственно чувствительность определения по данному сайту. В столбцах 4 и 5 приведено число отрицательных результатов при проведении GLAD-ПЦР-анализа образцов ДНК из морфологически неизмененных тканей и соответственно специфичность выявления опухолевой ДНК. В столбце 6 указана величина площади под ROC-кривой (ППК), выраженная в виде доли от всей площади квадрата с указанием стандартной ошибки измерения, а в столбце 7 представлены значения 95% доверительного интервала определения данного параметра.
Статистический анализ результатов GLAD-ПЦР (рис. 3 и табл. 3) показывает, что большинство проверенных маркеров характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, и позволяет дифференцировать образцы ДНК из опухолевых и нормальных тканей РЖ. Полученные значе-
bves
epha7
cacna2d3
среЬ1
ИППОвА^ррр
Я
+
да1г1
pcdh10
1ггс3Ь
гипхЗ
ш ил м» Ышг-Щ-"- :1:И11а
\fp\2
sfrp2
znf331
шн ¡Н|| |||||||| ■р^НИННТ" ¿.шямн 1
ЗООООООООООО!
Рис. 2. Результаты GLAD-ПЦР-анализа выбранных R(5mC)GY-сайтов в препаратах ДНК из образцов тканей больных РЖ. По оси ординат приведены значения Cq с диапазонами стандартных отклонений, по оси абсцисс -номера исследованных образцов тканей (о - опухоль, н - неизмененная ткань на линии резекции)
tfpi2
brinpl
bves
и m
100 80 60 40 20
0
'¿г
__ \f
■ 7 , , ,
, , , , , ,
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
cacna2d3
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
с
m
100 80 60 40 20
0
уУ
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
cpebl
100 80 60 40 20 0
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
100 ь
80
с о н ь
с
е т и
m
ст 20
m
^
0
60
40
) / /
/
. 1
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
epha7
100
с
m
/
/
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
Рис. 3. ROC-кривые,полученные при статистическом анализе данных GLAD-ПЦР-анализа сайтов R(5mC)GY в препаратах ДНК из опухолевых и неизмененных тканей больных РЖ. По оси ординат указана чувствительность в %, по оси абсцисс приведено значение [100 - специфичность I
100 80 60
galrl
J-
40 20 0
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
100 80 60 40 20 0
lrrc3b
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
100 80
60
с о н ь
с
е
ит 40 СП
£ 20 0
/
/ /
------
... 1 ... 1
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
pcdh10
runx3
sfrp2
с
m
Г
X / /
/
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
tcf21
100
с
m
/
/
1 1
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
с о н ь
с
е т и
m
100 80 60 40 20 0
X /
/ /
. / /
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
znf331
с
m
100 80 60 40 20 0
/
........
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
с
m
100 80 60 40 20 0
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
Комбинация генов irxl, cacna2d3 и epha7
с в
/
0 20 40 60 80 100 100-специфичность
Таблица 3. Результаты ROC-анализа данных, полученных методом GLAD-ПЦР образцов ДНК из опухолевых и морфологически неизмененных тканей больных РЖ (в порядке уменьшения значений ППК)
Ген Образцы РЖ, определенные как положительные / общее число образцов РЖ Чувствительность, % Образцы морфологически неизмененных тканей, определенных как отрицательные / общее число образцов морфологически неизмененных тканей Специ-фич- ность, % ППК (стандартная ошибка) 95% доверительный интервал
irx1 27/29 93.1 22/25 88.0 0.934 (0.038) 0.833-0.984
cpeb1 25/29 86.2 24/25 96.0 0.911 (0.047) 0.802-0.971
galr1 24/29 82.7 24/25 96.0 0.866 (0.054) 0.745-0.943
tfpi2 23/29 79.3 22/25 88.0 0.846 (0.059) 0.721-0.929
cacna2d3 21/29 72.4 23/25 92.0 0.834 (0.054) 0.708-0.921
epha7 22/29 75.7 24/25 96.0 0.832 (0.066) 0.706-0.920
pcdh10 22/29 75.9 24/25 96.0 0.830 (0.061) 0.703-0.918
sfrp2 21/29 72.4 24/25 96.0 0.795 (0.064) 0.663-0.893
tcf21 15/29 51.7 25/25 100.0 0.790 (0.063) 0.657-0.889
lrrc3b 21/29 72.4 22/25 88.0 0.762 (0.070) 0.627-0.867
znf331 14/29 48.3 24/25 96.00 0.698 (0.075) 0.558-0.815
runx3 14/29 48.3 21/25 84.0 0.673 (0.074) 0.532-0.795
bves 18/29 62.1 22/25 88.0 0.627 (0.082) 0.485-0.755
brinp1 3/29 10.3 25/25 100.0 0.514 (0.081) 0.374-0.652
Комбинация генов irx1, cacna2d3 и epha7 28/29 96.6 25/25 100.0 0.985 (0.016) 0.907-1.000
ния ППК (за исключением генов znf331, runx3, bves и brinp1) больше 0.7, что, согласно общепринятым критериям оценки данных ROC, свидетельствует о возможности их использования в качестве диагностических моделей [15].
Наиболее высоким диагностическим потенциалом обладают сайты RCGY в составе генов-онкосупрессо-ров irx1 и cpeb1: значения ППК для них превышают 0.91.
С применением метода логистической регрессии (алгоритм последовательного включения / исключения) проведена оценка общих диагностических характеристик всех исследованных сайтов RCGY, что позволило отобрать оптимальную комбинацию маркеров, дающую максимальную площадь под ROC-кривой и позволяющую различать образцы ДНК из опухолевых и нормальных тканей с наибольшей эффективностью. Как видно из табл. 3, анализ комбинации маркеров irx1, cacna2d3 и epha7 позволяет проводить такую дифференциацию со 100% специфичностью и чувствительностью 96.6%.
Таким образом, с помощью GLAD-ПЦР-анализа
препаратов ДНК из клинических образцов опухолевых и нормальных тканей больных РЖ сформирована диагностическая панель сайтов RCGY, позволяющая выявлять опухолевые ткани.
ОБСУЖДЕНИЕ
Известны четыре молекулярных подтипа РЖ, которые различаются профилем метилирования ДНК [17]. В них входят: а) ВЭБ-позитивный, ассоциированный с вирусом Эпштейна-Барр; б) MSI (mlh1 silencing), характеризующийся функциональной инактивацией локуса mlh1; в) вариант со стабильными микроса-теллитными повторами; г) подтип с большим числом мутаций в микросателлитных повторах. Однако в подавляющем большинстве случаев (> 90%) гистологическим типом РЖ является аденокарцинома.
В настоящее время выявлено значительное количество генов с различными биологическими функциями, районы промотора или первого экзона в которых метилируются при РЖ [30]. При этом метилирование регуляторных областей генов bves, irx1, runx3, cacna2d3, lrrc3b и sfrp2, представленных в табл. 3,
ассоциировано по меньшей мере с тремя подтипами РЖ [17]. При исследовании метилирования ДНК на уровне генома используется метод бисульфит-ной конверсии с последующим секвенированием на NGS-платформе. J.L. Sepulveda и соавт. применили этот подход к исследованию препаратов ДНК из нормальной слизистой и опухолевой ткани и показали существенное увеличение метилирования CpG-динуклеотидов в генах Ьтт^)1, epha7 и galr1 при РЖ [16].
Выводы, сделанные в перечисленных исследованиях, основывались на сравнении медианных значений степени метилирования в выборках образцов тканей без определения частотных показателей метилирования или экспрессии генов для групп «норма» и «опухоль». Такие показатели описаны для остальных пяти генов, представленных в табл. 3.
Выключение гена cpeb1 при метилировании промотора наблюдали во всех девяти изученных клеточных линиях РЖ и в 91% первичных опухолей [19]. Похожие результаты получены для гена pcdh10, метилирование которого находят в 82% случаев опухолей желудка и в 94% линий опухолевых клеток желудка [23]. Также более чем в 80% образцов опухолей желудка выявлено метилирование промотора гена tfpi2 [27]. В 71% клеточных линий РЖ установлено выключение гена г^331. Этот эффект наблюдали и в значительном количестве образцов ДНК из опухолевых тканей, тогда как в морфологически неизмененных тканях, включая ткань желудка, этот ген не был метилирован [28]. Метилирование промо-торной области гена tcf21 наблюдали только в 65% случаев [26]. Результаты, представленные в табл. 3, хорошо коррелируют с ранее полученными количественными данными по метилированию генов в опухолях РЖ [19, 23, 26-28].
Список генов с аберрантно метилированными сайтами в опухолях РЖ (табл. 3) существенно отличается от списка генов при колоректальном раке, полученного нами ранее [13]. Исключением является ген sfrp2, метилирование регуляторной области которого в опухолевой ДНК наблюдается в обоих случаях с практически одинаковой частотой (72% при коло-ректальном раке).
Возможности GLAD-ПЦР-анализа для диагностики рака желудка
Результаты, полученные в настоящей работе, соответствуют ранее опубликованным данным и по-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. IARC. / Eds Stewart B.W., Wild C.P. World Cancer Report 2014. Geneva: WHO Press, 2014.
2. IARC. Press release № 263. WHO, Geneva, Switzerland, 2018.
казывают, что GLAD-ПЦР позволяет выявлять аберрантно метилированные сайты R(5mC)GY в ре-гуляторных областях генов-онкосупрессоров в образцах ДНК, выделенных из тканей РЖ. При этом степень метилирования сайта связана отрицательной корреляционной зависимостью со значением Cq в ПЦР в режиме реального времени.
Наиболее оптимальным комплексным маркером РЖ оказалась комбинация сайтов RCGY в ре-гуляторных областях генов irx1, cacna2d3 и epha7. Применение данной панели генов делает специфичность дифференциации опухолевых и морфологически неизмененных тканей равной 100%, а чувствительность анализа при этом повышается до 96.6% (табл. 3).
В настоящее время наиболее перспективным и активно разрабатываемым методом онкодиагностики является так называемая «жидкая биопсия», основанная на анализе свободно циркулирующей ДНК в крови. Один из основных источников такой ДНК при онкологических заболеваниях - опухолевые клетки, разрушающиеся в результате апоптоза и некроза [31]. В дальнейшем планируется провести тестирование подобранной панели эпигенетических маркеров на образцах ДНК из крови больных РЖ с целью разработки чувствительного метода лабораторной диагностики данной онкопатологии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Методом GLAD-ПЦР определены сайты R(5mC)GY, возникающие при аберрантном метилировании регу-ляторных областей генов-онкосупрессоров в образцах ДНК из тканей РЖ. Предложена панель сайтов в генах irx1, cacna2d3 и epha7, являющихся эпигенетическими маркерами РЖ, показана высокая диагностическая эффективность этой панели при дифференциации ДНК из морфологически неизмененных и опухолевых тканей. Суммарные показатели чувствительности и специфичности панели составляют 96.6% и 100% соответственно. Мы полагаем, что выбранные сайты RCGY могут использоваться также для разработки систем диагностики РЖ методом GLAD-ПЦР образцов ДНК, выделенных из крови пациентов.
Работа проведена при финансовой поддержке гранта фонда Сколково № Г102/16 от 06 декабря 2016 г.
https://www.who.int/cancer/PRGlobocanFinal.pdf. Accessed 25 Sep 2019.
3. Siegel R., Ma J., Zou Z., Jemal A. // CA Cancer J. Clin. 2014. V. 64. № 1. P. 9-29.
4. Cancer.net. Doctor-approved patient information from ASCO. https://www.cancer.net/cancer-types/stomach-cancer/ statistics. Accessed 25 Sep. 2019.
5. International medical center ONCLINIC. https://www. onclinic.ru/articles/za bolevaniya/ onkologiya/vyzhivaemost_ pri_rake_zheludka. Accessed 25 Sep. 2019.
6. American Cancer Society. https://www.cancer.org/cancer/ stomach-cancer/detection-diagnosis-staging/survival-rates. html. Accessed 25 Sep. 2019.
7. de Caceres I., Cairns P. // Clin. Transl. Oncol. 2007. V. 9. № 7. P. 429-437.
8. Langevin S.M., Kratzke R.A., Kelsey K.T. // Transl. Res. 2015. V. 165. № 1. P. 74-90.
9. Handa V., Jeltsch A. // J. Mol. Biol. 2005. V. 348. № 5. P. 11031112.
10. Tarasova G.V., Nayakshina T.N., Degtyarev S.K. // BMC Mol. Biol. 2008. V. 9. P. 7.
11. Кузнецов В.В., Акишев А.Г., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Патент № 2525710 РФ. МПК C12Q 1/68 (2006.01). 2014.
12. Евдокимов А.А., Нетесова Н.А., Сметанникова Н.А., Абдурашитов М.А., Акишев А.Г., Давидович Е.С., Ермолаев Ю.Д., Карпов А.Б., Сазонов А.Э., Тахауов Р.М. и др. // Вопросы онкологии. 2016. Т. 62. С. 117-121.
13. Evdokimov A.A., Netesova N.A., Smetannikova N.A., Abdurashitov M.A., Akishev A.G., Malyshev B.S., Davidovich E.S., Fedotov V.V., Kuznetsov V.V., Ermolaev Yu.D., et al. // Biol. Med. (Aligarh). 2016. V. 8. P. 342.
14. Смит К., Клко С., Кантор Ч. Анализ генома. Методы. / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. 244 с.
15. Pepe M.S. The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction. Oxford: Oxford University Press, 2003. 320 с.
16. Sepulveda J.L., Gutierrez-Pajares J.L., Luna A., Yao Y., Tobias J.W., Thomas S. Woo Y., Giorgi F., Komissarova E.V., et al // Mod. Pathol. 2016. V. 29. № 2. P. 182-193.
17. Lim B., Kim J.H., Kim M., Kim S.Y. // World J. Gastroenterol. 2016. V. 22. № 3. P. 1190-1201.
18. Yuasa Y., Nagasaki H., Akiyama Y., Hashimoto Y., Takizawa T., Kojima K., Kawano T., Sugihara K., Imai K., Nakachi K. // Int. J. Cancer. 2009. V. 124. № 11. P. 2677-2682.
19. Caldeira J., Simoes-Correia J., Paredes J., Pinto M.T., Sousa S., Corso G., Marrelli D., Roviello F., Pereira P.S., Weil D., et al. // Gut. 2012. V. 61. № 8. P. 1115-1123.
20. Akiyama Y., Watkins N., Suzuki H., Jair K.W., van Engeland M., Esteller M., Sakai H., Ren C.Y., Yuasa Y., Herman J.G., et al. // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. № 23. P. 8429-8439.
21. Ooki A., Yamashita K., Kikuchi S., Sakuramoto S., Katada N., Kokubo K., Kobayashi H., Kim M.S., Sidransky D., Watanabe M. // Oncogene. 2010. V. 29. P. 3263-3275.
22. Kim M., Kim J.H., Jang H.R., Kim H.M., Lee C.W., Noh S.M., Song K.S., Cho J.S., Jeong H.Y., Hahn Y., et al. // Cancer Res. 2008. V. 68. P. 7147-7155.
23. Yu J., Cheng Y.Y., Tao Q., Cheung K.F., Lam C.N., Geng H., Tian L.W., Wong Y.P., Tong J.H., Ying J.M., et al. // Gastroenterology. 2009. V. 136. № 2. P. 640-651.
24. Wang H., Zheng Y., Lai J., Luo Q., Ke H., Chen Q. // PLoS One. 2016. V. 11. № 12. e0168635.
25. Oishi Y., Watanabe Y., Yoshida Y., Sato Y., Hiraishi T., Oikawa R., Maehata T., Suzuki H., Toyota M., Niwa H., et al. // Tumour Biol. 2012. V. 33. № 2. P. 383-393.
26. Yang Z., Li D.M., Xie Q., Dai D.Q. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2015. V. 141. № 2. P. 211-220.
27. Jee C.D., Kim M.A., Jung E.J., Kim J., Kim W.H. // Eur. J. Cancer. 2009. V. 45. № 7. P. 1282-1293.
28. Yu J., Liang Q.Y., Wang J., Cheng Y., Wang S., Poon T.C., Go M.Y., Tao Q., Chang Z., Sung J.J. // Oncogene. 2013. V. 32. № 3. P. 307-317.
29. Wang S., Cheng Y., Du W., Lu L., Zhou L., Wang H., Kang W., Li X., Tao Q., Sung J.J., et al. // Gut. 2013. V. 62. № 6.
P. 833-841.
30. Qu Y., Dang S., Hou P. // Clin. Chim. Acta. 2013. V. 424. P. 53-65.
31. Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. // Молекуляр. биология. 2008. Т. 42. № 1. С. 12-23.
