CC BY
108
Ольга Анатольевна Симонова1, Екатерина Борисовна Кузнецова2, Ольга Владимировна Бабенко3, Виктория Владимировна Руденко4, Георгий Авраамович Франк5, Лариса Эдуардовна Завалишина6, Татьяна Владимировна Кекеева7, Людмила Николаевна Любченко8, Нина Андреевна Горбань9, Дмитрий Владимирович Залетаев10, Владимир Викторович Стрельников11
МЕТИЛИРОВАНИЕ ГЕНОВ СУБЪЕДИНИЦ ЛАМИНИНА-5 В НОРМЕ И ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1 Ординатор, лаборатория эпигенетики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН (115478, РФ, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1)
2 К. б. н., старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной генетики человека
ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, РФ, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8); старший научный сотрудник, лаборатория эпигенетики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН (115478, РФ, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1)
3 К. б. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория молекулярной генетики человека
ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, РФ, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8); ведущий научный сотрудник, лаборатория эпигенетики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН (115478, РФ, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1)
4 Ординатор, лаборатория эпигенетики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН (115478, РФ, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1)
5 Академик РАМН, профессор, д. м. н., руководитель, патологоанатомическое отделение МНИОИ им. П. А. Герцена (125284, РФ, г. Москва, 2-й Боткинский проезд, д. 3)
6 Д. б. н., ведущий научный сотрудник, патологоанатомическое отделение МНИОИ им. П. А.Герцена (125284, РФ, г. Москва, 2-й Боткинский проезд, д. 3)
7 К. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория молекулярной генетики человека ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, РФ, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8); научный сотрудник, патологоанатомическое отделение МНИОИ им. П. А. Герцена (125284, РФ, г. Москва, 2-й Боткинский проезд, д. 3)
8 Д. м. н., заведующий, лаборатория клинической онкогенетики НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское ш., д. 24)
9 К. м. н., старший научный сотрудник, патологоанатомическое отделение ФГБУМРНЦМинздравсоцразвития России (249036, РФ, г. Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, д. 4)
10 Профессор, д. б. н., заведующий, лаборатория молекулярной генетики человека ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, РФ, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8); заведующий, лаборатория эпигенетики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН (115478, РФ, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1)
11 К. б. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория молекулярной генетики человека ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздравсоцразвития России (119991, РФ, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8); ведущий научный сотрудник, лаборатория эпигенетики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН (115478, РФ, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1); e-mail: vstrel@list.ru
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, ул. Москворечье, д. 1, Медико-генетический научный центр РАМН, лаборатория эпигенетики,
Стрельников Владимир Викторович; e-mail: vstrel@list.ru
Особенности метилирования генов субъединиц ламинина-5 LAMA3, LAMB3 и LAMC2 в норме и при злокачественных новообразованиях ранее исследовались только одной научной группой (и G. Sathyanarayana и соавт., 2003—2004). Эти авторы показали наличие аномального метилирования указанных генов в 5—40% случаев рака молочной железы. При этом в ДНК из нормальных лимфоцитов, клеток буккального эпителия и клеток немалигнизированной ткани молочной железы метилирование
тех же локусов не наблюдалось или же наблюдалось в 0—7% случаев. Отмечены значимые ассоциации между аномальным метилированием, экспрессией мРНК и клинико-морфологическими характеристиками опухолей. Приведенные исследования не были повторены другими группами; соответственно результаты не были подтверждены либо опровергнуты. Тем не менее благодаря многочисленным обзорам, опубликованным за прошедшие годы, положение об аномальном метилировании генов LAMA3, LAMB3 и LAMC2 как об одном из основных элементов молекулярной патологии ламинина-5 при раке стало общепринятым. Примененный в нашей работе метод метилчувствительной полимеразной реакции позволил выявить метилирование промоторных областей генов LAMA3, LAMВ3 и LAMС2 в 96—100% образцов рака молочной железы, прилежащей условно нормальной ткани молочной железы и секционного материала молочной железы. Метилирование промоторов LAMA3 и LAMВ3 выявлено также во всех образцах буккального эпителия и крови. Наши результаты, подтвержденные секвенированием бисульфит-конвертированной ДНК, свидетельствуют о невозможности использования метилирования ранее предложенных участков промоторных областей генов субъединиц ламинина-5 в качестве диагностического маркера и ставят вопрос о пересмотре представлений о механизмах молекулярной патологии этого типа ламинина при раке.
Ключевые слова: ламинин, рак молочной железы, метилирование ДНК.
Инвазия в окружающие ткани является основным свойством злокачественных солидных опухолей, способствующим их распространению и метастазированию. В процессе инвазии опухолевые клетки, проходя через базальную мембрану, мигрируют в соединительнотканную строму. Это явление подразумевает тесные взаимоотношения опухолевых клеток с внеклеточным матриксом и перестройку его структур [1]. Эпителий и подлежащая строма функционируют в активном взаимодействии как единое целое. Двусторонние взаимодействия опосредуются внеклеточными белками — ламининами — и их трансмембранными рецепторами — интегринами. Прикрепление клеток нормального эпителия к базальной мембране обеспечивается гемидесмосомами, основными структурными элементами которых являются интегрин а6р4 и его лиганд ламинин-5. В составе дольковых и протоковых структур молочной железы (МЖ) гемидесмосомы формируются как миоэпителиальными, так и лю-минальными клетками [2]. Ламинин-5 — член семейства белков-ламининов, характерный для эпителиальных тканей, представляет собой гетеротример, который состоит из субъединиц а3, Р3 и у2, кодируемых соответственно генами LAMA3, LAMB3 и LAMC2 [3].
В ряде работ описано нарушение экспрессии цепей ламинина в опухолях. Для цепей ламинина-5 отмечалось тканеспецифическое нарушение регуляции экспрессии: в глиомах и карциномах желудка обнаружено увеличение экспрессии, при раке предстательной железы и раке молочной железы (РМЖ) — ее снижение [4—6].
Одним из механизмов регуляции экспрессии генов — супрессоров опухолевого роста является метилирование их промоторных областей. Для генов субъединиц лами-нина-5 особенности метилирования в норме и при злокачественных новообразованиях исследовались только одной группой и опубликованы за первым авторством ^ G. Sathyanarayana в 2003—2004 гг. [7—10]. Авторы выявили аномальное метилирование генов LAMA3, LAMB3 и
© Симонова О. А., Кузнецова Е. Б., Бабенко О. В., Руденко В. В., Франк Г. А., Завалишина Л. Э., Кекеева Т. В., Любченко Л. Н., Горбань Н. А., Залетаев Д. В., Стрельников В. В., 2011 УДК 618.19-006.6:575:577.2.088
LAMC2 в 5—40% случаев РМЖ и мочевого пузыря и в 13— 77% случаев рака легкого. При этом в ДНК из нормальных лимфоцитов периферической крови, клеток бук-кального эпителия и клеток немалигнизированной ткани МЖ метилирования тех же локусов не наблюдалось или же наблюдалось в 0—7% случаев. Для всех 3 субъединиц отмечены значимые ассоциации между аномальным метилированием, экспрессией мРНК и клинико-морфологическими характеристиками опухолей [7—10].
В настоящей работе исследован характер метилирования генов субъединиц ламинина-5 в образцах РМЖ, парных им образцах прилежащей морфологически неизмененной ткани, образцах секционного материала нормальной МЖ, образцах периферической крови и буккального эпителия здоровых доноров.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проведено на 50 образцах РМЖ, 50 парных им образцах прилежащей морфологически неизмененной ткани, 2 образцах секционного материала нормальной МЖ, 30 образцах периферической крови и 7 образцах буккального эпителия здоровых доноров. Образцы клинического материала предоставлены РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, ФГУ МНИОИ им. П. А. Герцена, ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России. После взятия образцы тканей замораживали и хранили в жидком азоте. Геномную ДНК выделяли по стандартной методике фенол-хлороформной экстракции.
Метилчувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР)
Метод основан на способности метилчувствитель-ных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированные основания, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы использовали ДНК исследуемых образцов, предварительно гидролизованную рестриктазой HpaII. Для исключения ложноотрицательных результатов в ходе исследования для каждого локуса была разработана схема ПЦР с 2 парами праймеров: один фрагмент принадлежал исследуемому гену, а другой служил положительным контролем (облигатно метилированный участок
гена CUX1). Для оценки полноты гидролиза ДНК проводили МЧ-ПЦР фрагмента гена ING1, содержащего сайты узнавания рестриктазы HpaII, для которого доказано отсутствие метилирования как в норме, так и в опухоли.
Гидролиз ДНК производили в смеси: 1,5 мкг геномной ДНК, 10 ед. акт. фермента НраП, 2 мкл буфера SEBufferB/Y (10х) («СибЭнзим», Новосибирск). Объем смеси доводили до 20 мкл деионизированной водой и инкубировали в течение 16 ч при температуре 37 °С.
ПЦР проводили по следующей схеме: к 0,1 мкг ДНК добавляли 0,05 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 2,5 мкл десятикратного буфера для ПЦР (50 мМ КО, 30 мМ MgCl2,10 мМ трис-НО pH 8,4), деионизированной воды до 25 мкл. Затем добавляли 40—60 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при температуре 95 °С в течение 10 мин, вносили под слой масла термофильную ДНК-полимеразу (1 ед. акт.) и проводили 33 цикла ПЦР с параметрами: 95 °С — 40 с, 66°С — 40 с, 72°С — 40 с. Финальная элонгация проводилась при температуре 72 °С в течение 10 мин. Последовательности используемых праймеров и размеры продуктов ПЦР приведены в табл. 1.
Продукты МЧ-ПЦР разделяли в 8% полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра.
Метилспецифическое секвенирование
Для подтверждения результатов анализа метилирования промоторных областей исследуемых генов, полученных с помощью МЧ-ПЦР, проведено метилспецифиче-ское секвенирование этих последовательностей. Дизайн праймеров (табл. 2) был выполнен при помощи программы «MethPrimer» [11].
Подготовка образцов геномной ДНК к метилспеци-фическому секвенированию заключалась в их обработке бисульфитом натрия и проведении метилспецифической ПЦР (МС-ПЦР), формирующей матрицу для секвениро-вания.
Обработка ДНК бисульфитом натрия вызывает превращение неметилированных остатков цитозина в урацил, но не изменяет метилированные остатки цитозина. Геномную ДНК денатурировали с помощью NaOH (конечная концентрация 0,3 М) с последующей инкубацией при температуре 37 °С в течение 15 мин. Модификацию ДНК осуществляли при помощи бисульфита натрия и гидрохинона в конечных концентрациях соответственно 2 М и 0,5 М в течение 15 ч при температуре 55 °С. Модифицированную ДНК очищали от бисульфита с помощью колонок для очистки ДНК согласно прилагаемой инструкции («Wizard DNA Clean-up system»; «Promega»).
Реакционная смесь для МС-ПЦР объемом 25 мкл включала 10 мМ Трис-HCl pH 8,4, 50 мM KCl, 4 мЫ MgCl2, по 200 мкМ dNTP, 10% ДМСО, 5% глицерина, 2% деионизированного формамида, 50—100 нг обработанной бисульфитом ДНК и 1 ед. термофильной ДНК-полимеразы. Смесь прогревали при температуре 95 °С в течение 6 мин и проводили 33 цикла с параметрами: 94 °С — 40 с, 57 °С — 60 с, 72 °С — 60 с. Финальную элонгацию проводили при температуре 72 °С в течение 7 мин.
Секвенирование продуктов ПЦР проводили на генетическом анализаторе ABI310 методом терминирующих дидезоксинуклеотидов в соответствии с протоколом ABI
Prism 310 Genetic Analyzer Kits («Applied Biosystems», США).
результаты
Анализ промоторной области гена LAMA3 методом МЧ-ПЦР выявил метилирование в 100% образцов РМЖ и прилежащей условно нормальной ткани МЖ. Метилирование исследуемой области также было выявлено во всех образцах буккального эпителия, крови и секционного материала МЖ.
Метилирование участка промотора LAMВ3 было определено в 98% (49 из 50) образцов тканей первичных опухолей. Метилирование этого участка выявлено также во всех образцах условно нормальной ткани МЖ, в лейкоцитах крови, буккальном эпителии и секционном материале МЖ.
Анализ участка промотора LAMС2 показал метилирование в 96% (48 из 50) образцов тканей первичных опухолей. Метилированное состояние определено во всех образцах условно нормальной ткани МЖ и образцах секционного материала МЖ. В то же время во всех образцах крови и буккального эпителия констатировано отсутствие метилирования промоторной области гена LAMС2.
Примеры результатов анализа метилирования генов LAMA3, LAMB3 и LAMC2 методом МЧ-ПЦР представлены на рис. 1. Результаты полностью подтвердились при ме-тилспецифическом секвенировании соответствующих геномных участков. Частота метилирования промотор-ных областей 3 исследованных генов в различных тканях и сравнение результатов, полученных в настоящем исследовании и в работах U. G. Sathyanarayana и соавт. [7— 10], приведены в табл. 3.
ОБСУЖДЕНИЕ
В настоящее время для ген-специфического анализа метилирования, когда объектом исследования, как правило, является аномальное метилирование обогащенных CpG промоторных участков генов, применяют два подхода: МЧ-ПЦР, основанную на обработке ДНК метил-чувствительными рестриктазами, и МС-ПЦР, которую проводят на ДНК, подвергнутой бисульфитной конверсии [12].
Протоколы, основанные на бисульфитной модификации ДНК, характеризуются высокой эффективностью, но при этом сложны в исполнении и могут иметь погрешности в плане четкости и воспроизводимости результатов. Ряд артефактов может возникать вследствие неполной конверсии цитозина и случайной конверсии 5-метилцитозина исходной матрицы. Эффективность исследований, основанных на анализе бисульфит-моди-фицированной ДНК, в значительной степени зависит от дизайна праймеров для МС-ПЦР. При этом следует учитывать, что результаты, получаемые при использовании МС-ПЦР, отражают характер метилирования только пар CG, входящих в состав праймеров.
Эффективность методов, основанных на использовании МЧ-ПЦР, сопоставима с таковой для МС-ПЦР [13]. При этом несомненными достоинствами МЧ-ПЦР являются меньшая техническая сложность и трудоемкость, а также возможность оценки статуса метилирования всех пар CG в составе анализируемого фрагмента, входящих
Таблица 1
Праймеры, используемые для проведения МЧ-ПЦР
Исследуемый ген Последовательности праймеров 5—3' Размер продукта ПЦР, п. н. Число исследуемых динуклеотидов CpG
LAMA3 F: GCT TGC AGT TGA CTT TGA CCG R: CGC AGA CAG CCT TCC TCA CCT 257 3
LAMB3 F AGA TTC CT GAGA CCC GCC CTG R: GCC AGC CCA CCC TTC TCA CTT 410 3
LAMC2 F CGC ACA TTC CAG GCA AAG GCT R: GGG CAG GAG GAG CGAGAA GCA 413 5
CUX1 F: GCC CCC GAG GAC GCC GCT ACC R: AAG CGG TCC AGG GGT CCA GGC 565 6
ING1 F TAT TTC GCG TCG ATC TCC R: CAG CCC CGC CGC AT GAGA G 416 9
в сайты узнавания применяемой метилчувствительной рестриктазы. При разработке протокола необходимо учитывать возможность неполного гидродиза ДНК ферментами рестрикции. Для исключения ложноположительных результатов в систему включают дополнительную пару праймеров, фланкирующих участок какого-либо гена, который имеет несколько сайтов узнавания используемой метилчувствительной рестриктазы и характеризуется отсутствием метилирования во всех тканях. Для исключения ложноотрицательных результатов в ходе исследования в систему также необходимо ввести локус, который послужит в качестве положительного контроля ПЦР (как правило, это облигатно метилированный участок генома). При обеспечении указанных кон-тролей достоверность метода МЧ-ПЦР выше, чем достоверность МС-ПЦР, при котором исключение артефактов реакции посредством внутренних контролей затруднено и, как правило, не применяется. В связи с этим метод МЧ-ПЦР принят нами за основу при разработке систем для анализа метилирования промоторных областей генов LAMA3, LAMB3 и LAMC2.
Таблица 2
Последовательности праймеров, используемых для ме-тилспецифического секвенирования
Исследуемый ген Нуклеотидная последовательность праймеров 5'—3'
LAMA3 F GTT GTA ATA TTT AGT TTA TAG GTT GTT T R: CTC CTC AAT CCA CCC ATT TAC TC
LAM83 F TTT TAT AGG TAG GTG GGT ATT GTG G R: AAT AAA TCA AAC CCT AAA ACC AAA C
LAMC2 F1: ATT GGG TTT TTT AGT TTG AGG A R1: ACC TTC CTT TTC CTT AAT CAA A F2: TTT GTG TTT TGT GTG TTT GTT T R2: AAA AAC AAA TTC TCA ACC CAA
Напротив, исследователи, ранее проводившие анализ метилирования промоторных областей генов LAMA3, LAMB3 и LAMC2, использовали метод МС-ПЦР. Следует учитывать, что при проведении ПЦР с обработанной бисульфитом ДНК для некоторых пар праймеров показана неодинаковая эффективность амплификации метилированной и неметилированной последовательностей. Авторы проводили МС-ПЦР метилированной и немети-лированной последовательностей исследуемых генов в
CUX
(ВК)
LAMA3
1Н 1Т 2Н 2Т 3Н 3Т 4Н 4Т 5Н 5Т 6Н 6Т М К+
CUX (ВК)
LAMB3
CUX
(ВК)
LAMC2
Рисунок 1. Метилирование промоторных областей генов LAMA3, LAMB3 и LAMC2. Во всех образцах наблюдается метилирование исследуемых промоторных областей. ВК — внутренний контроль; К+ — положительный контроль; М — маркер молекулярного веса; 1—6 номера парных образцов ДНК (Н — условно нормальная ткань, Т — ткань опухоли).
1Н 1Т 2Н 2Т 3Н 3Т 4Н 4Т 5Н 5Т 6Н 6Т М К+
Таблица 3
Частота метилирования промоторных областей генов LAMA3, LAMB3 и LAMC2 в различных тканях человека
Ген Исследование РМЖ Условно нормальная ткань МЖ Секционный материал МЖ Лимфоциты крови Буккальный эпителий
LAMA3 Настоящее 50/50 (100%) 50/50 (100%) 2/2 (100%) 30/30 (100%) 7/7 (100%)
[6—9] 33/74 (44%) 2/30 (7%) Н/а 0—1/14 (0—7%) 0/12 (0)
LAMB3 Настоящее 49/50 (98%) 50/50 (100%) 2/2 (100%) 30/30 (100%) 7/7 (100%)
[6—9] 3/74 (4%) 0/30 (0) Н/а 0—1/14 (0—7%) 0/12 (0)
LAMC2 Настоящее 48/50 (98%) 50/50 (100%) 2/2 (100%) 0/30 (0) 0/7 (0)
[6—9] 15/74 (20%) 2/30 (7%) Н/а 0—1/14 (0—7%) 0/12 (0)
Н/а — не анализировался.
формате раздельных реакций, что не позволяет провести адекватную оценку наличия/отсутствия метилирования ДНК. Кроме того, не было проведено подтверждения соответствия последовательностей продуктов ПЦР исследуемым участкам генома [7—10]. Перечисленные недостатки дизайна экспериментов могли привести к ошибочным оценкам характера метилирования исследованных участков генома.
Во избежание голословности приведенных оценок представим пример неудачного дизайна праймера для МС-ПЦР промоторного участка гена LAMA3 в работе U. G. Sathyanarayana и соавт. [9]. Последовательность праймера представлена на рис. 2. На 3'-конце отмечены две пары CpG, метилирование которых определяется при использовании этого праймера в МС-ПЦР. Отмечены также позиции однонуклеотидных замен, описанных в базе данных коротких генетических вариаций (dbSNP Short Genetic Variations [14]) под идентификационными кодами rs28413178 и rs77542553. Полиморфизм rs28413178 представляет собой замену G > C, которая с учетом близкого расположения к 3'-концу праймера может снижать эффективность амплификации как метилированного, так и неметилированного аллелей. Полиморфизм rs77542553 заключается в замене С > T, мимикрирующей результат обработки неметилированного участка ДНК бисульфитом натрия. В этом случае присутствие минорного аллеля должно приводить к ошибочному определению состояния аллеля как неметилированного. Не исключено, что
именно присутствие этой однонуклеотидной замены в образцах ДНК заставило U. G. Sathyanarayana и соавт. сделать ложный вывод о неметилированном состоянии промотора LAMA3 в исследованных тканях [7—10].
Полученные нами результаты позволяют предполагать, что статус метилирования изученных участков промоторов генов LAMA3, LAMB3 и LAMC2 не является определяющим фактором регуляции уровня их экспрессии. Недавние исследования показали, что экспрессия всех 3 субъединиц ламинина-5 находится под положительным контролем опухолевого супрессора SMAD4, транслирующего сигналы от цитокинов суперсемейства TGFP [16]. Нарушенную экспрессию ламинина-5 в клетках солидных опухолей, дефицитных по SMAD4, удавалось нормализовать восстановлением функции SMAD4 [16].
заключение
Полученные нами результаты свидетельствуют о невозможности использования метилирования ранее предложенных участков промоторных областей генов субъединиц ламинина-5 в качестве диагностического маркера и ставят вопрос о пересмотре представлений о механизмах молекулярной патологии этого типа ламинина при раке.
Очевидный вывод из представленной работы заключается в необходимости дополнительного независимого исследования по изучению состояния метилирования генов субъединиц ламинина-332 в норме и при злокачественных новообразованиях.
Рисунок 2. Анализ последовательности праймера для МС-ПЦР промоторной области гена LAMA3. Обведены пары CpG, метилирование которых определяется при использовании этого праймера. Черными прямоугольниками отмечены положения однонуклеотидных полиморфизмов. Рисунок сформирован с помощью компьютерной программы просмотра геномов «UCSC Genome Browser» [15].
Работа проводилась при поддержке Федерального агентства по науке и инновациям, в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры, инновационной России» (ГК№02.740.11.0089).
ЛИТЕРАТУРА
1. Любимов А. В., Блэк К. Л., Любимова Ю. Ю. Изоформы ла-минина в диагностике и прогнозировании течения опухолей мозга и молочной железы // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2003. — Т. 14, № 3. — С. 83—91.
2. Expression of hemidesmosomes and component proteins is lost by invasive breast cancer cells / Bergstraesser L. M., Sriniva-san G., Jones J. C., Stahl S., Weitzman S. A. // Am. J. Pathol. — 1995. — Vol. 147. — P. 1823—1839.
3. Stahl S., Weitzman S., Jones J. C. The role of laminin-5 and its receptors in mammary epithelial cell branching morphogenesis // J. Cell Sci. — 1997. — Vol. 110. — P. 55—63.
4. Down-regulation of laminin-5 in breast carcinoma cells / Martin K. J., Kwan C. P., Nagasaki K., Zhang X., O'Hare M. J., Kaelin C. M., Burgeson R. E., Pardee A. B., Sager R. // Mol. Med. — 1998. — Vol. 4, N 9. — P. 602—613.
5. Expression of hemidesmosomal and extracellular matrix proteins by normal and malignant human prostate tissue / Nagle R. B., Hao J., Knox J. D., Dalkin B. L., Clark V., Cress A. E. // Am. J. Pathol. — 1995. — Vol. 146. — P. 1498—1507.
6. Giannelli G., Antonaci S. Biological and clinical relevance of laminin-5 in cancer // Clin. Exp. Metastasis. — 2000. — Vol. 18. — P. 439— 443.
7. Molecular Detection of Noninvasive and Invasive Bladder Tumor Tissues and Exfoliated Cells by Aberrant Promoter Methylation of Laminin-5 Encoding Genes / Sathyanarayana U. G., Maruyama R., Pa-dar A., Suzuki M., Bondaruk J., Sagalowsky A., Minna J. D., Frenkel E. P., Grossman H. B., Czerniak B., Gazdar A. F. // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64. — P. 1425—1430.
8. Aberrant Promoter Methylation and Silencing of Laminin-5-En-coding Genes in Breast Carcinoma / Sathyanarayana U. G., Padar A., Huang C. X., Suzuki M., Shigematsu H., Bekele B. N., Gazdar A. F. // Clin. Cancer Res. — 2003. — Vol. 9. — P. 6389—6394.
9. Epigenetic Inactivation of Laminin-5-encoding Genes in Lung Cancers / Sathyanarayana U. G., Toyooka S., Padar A., Takahashi T., Brambilla E., Minna J. D., Gazdar A. F. // Clin. Cancer Res. — 2003. — Vol. 9. — P. 2665—2672.
10. Aberrant Promoter Methylation of Laminin-5—Encoding Genes in Prostate Cancers and Its Relationship to Clinicopathological Features / Sathyanarayana U. G., Padar A., Suzuki M., Maruyama R., Shigematsu H., Hsieh J.-H., Frenkel E., Gazdar A. F. // Clin. Cancer Res. — 2003. — Vol. 9. — P. 6395—6400.
11. Li L. C., Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs // Bioinformatics. — 2002. — Vol. 18, N 11. — P. 1427—1431.
12. Кузнецова Е. Б., Стрельников В. В. // Методы анализа метилирования ДНК // Мед. генетика. — 2006. — Т. 5, № 11. — С. 3—11.
13. Сравнительный анализ аномального метилирования CpG-островков, расположенных в промоторных областях генов p16/ CDKN2А и рН/ARF при немелкоклеточном раке легкого и остром лимфобластном лейкозе / Землякова В. В., Стрельников В. В., Зборовская И. Б., Балукова О. В., Майорова О. А., Васильев Е. В., Залета-ев Д. В., Немцова М. В. // Мол. биол. — 2004. — Т. 38, № 6. — С. 966— 972.
14. dbSNP: the NCBI database of genetic variation / Sherry S. T., Ward M.-H., Kholodov M., Baker J., Phan L., Smigielski E. M., Sirot-kin K. // Nucleic Acids Res. — 2001. — Vol. 29. — P. 308—311.
15. The UCSC Genome Browser database: update 2011 / Fujita P. A., Rhead B., Zweig A. S., Hinrichs A. S., Karolchik D., Cline M. S., Goldman M., Barber G. P., Clawson H., Coelho A., Diekhans M., Dreszer T. R., Giardine B. M., Harte R. A., Hillman-Jackson J., Hsu F., Kirkup V., Kuhn R. M., Learned K., Li C. H., Meyer L. R., Pohl A., Raney B. J., Rosen-bloom K. R., Smith K. E., Haussler D., Kent W. J. // Nucleic Acids Res. — 2011. — Vol. 39. — P. 876—882.
16. Divergent mechanisms underlie Smad4-mediated positive regulation of the three genes encoding the basement membrane component laminin-332 (laminin-5) / Zboralski D., Bockmann M., Zapatka M., Hoppe S., Schoneck A., Hahn S. A., Schmiegel W., Schwarte-Wald-hoff I. // BMC Cancer. — 2008. — Vol. 8 — P. 215.
Поступила 05.09.2011
Olga Anatolievna Simonova1, Ekaterina Borisovna Kuznetsova2,
Olga Vladimirovna Babenko3, Viktoria Vladimirovna Rudenko4,
Georgiy Avraamovich Frank5, Larisa Eduardovna Zavalishina6,
Tatiana Vladimirovna Kekeyeva7, Lyudmila Nikolayevna Lyubchenko8,
Nina Andreyevna Gorban9, Dmitriy Vladimirovich Zaletayev10,
Vladimir Viktorovich Strelnikov11
METHYLATION OF LAMININ-5 ENCODING GENE SUBUNITS IN NORMAL AND BREAST CANCER TISSUES
1 Attending Physician, Epigenetics Laboratory, Medical Genetics Research Center, RAMS (1, Moscvorechye ul., Moscow, 115478, RF)
2 MSc, PhD, Senior Researcher, Human Molecular Genetics Laboratory, I. M. Sechenov 1st MSMU,
Russian Health Ministry (8, Trubetskaya ul., Moscow, 119991, RF); Senior Researcher, Epigenetics Laboratory,
Medical Genetics Research Center, RAMS (1, Moscvorechye ul., Moscow, 115478, RF)
3 MSc, PhD, Leading Researcher, Human Molecular Genetics Laboratory,
I. M. Sechenov 1st MSMU, Russian Health Ministry (8, Trubetskaya ul., Moscow, 119991, RF);
Leading Researcher, Epigenetics Laboratory, Medical Genetics Research Center, RAMS (1, Moscvorechye ul., Moscow, 115478, RF)
4 Attending Physician, Epigenetics Laboratory, Medical Genetics Research Center, RAMS (1, Moscvorechye ul., Moscow, 115478, RF)
5 MD, PhD, DSc, Professor, Academician of RAMS, Professor, Head, Pathological Anatomy Department,
P. A. Hertzen MORI (3, 2 Botkinsky pr., Moscow, 125284, RF)
6 MSc, PhD, DSc, Leading Researcher, Pathological Anatomy Department,
P. A. Hertzen MORI (3, 2 Botkinsky pr., Moscow, 125284, RF)
7 MD, PhD, Senior Researcher, Human Molecular Genetics Laboratory, I. M. Sechenov 1st MSMU,
Russian Health Ministry (8, Trubetskaya ul., Moscow, 119991, RF); Researcher, Pathological Anatomy Department,
P. A. Hertzen MORI (3, 2 Botkinsky pr., Moscow, 125284, RF)
8 MD, PhD, DSc, Head, Clinical Oncogenetics Laboratory, Clinical Oncology Research Institute,
N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, 115478, RF)
9 MD, PhD, Senior Researcher, Pathological Anatomy Department, MRRC, Russian Health Ministry (4, Koroleva ul., Obninsk, Kaluzhskaya obl., 249036, RF)
10 MSc, PhD, DSc, Professor, Head, Human Molecular Genetics Laboratory, I. M. Sechenov 1st MSMU,
Russian Health Ministry (8, Trubetskaya ul., Moscow, 119991, RF); Head, Epigenetics Laboratory,
Medical Genetics Research Center, RAMS (1, Moscvorechye ul., Moscow, 115478, RF)
11 MSc, PhD, Leading Researcher, Human Molecular Genetics Laboratory, I. M. Sechenov 1st MSMU,
Russian Health Ministry (8, Trubetskaya ul., Moscow, 119991, RF); Leading Researcher, Epigenetics Laboratory,
Medical Genetics Research Center, RAMS (1, Moscvorechye ul., Moscow, 115478, RF)
Address for correspondence: Strelnikov Vladimir Victorovich, Epigenetics Laboratory, Medical Genetics Research Center, RAMS, 1, Moscvorechye ul., Moscow, 115478, RF; e-mail: vstrel@list.ru
Methylation of laminin-5-encoding genes LAMA3, LAMB3 and LAMC2 in normal and malignant tissues were studied by a single group of researchers (U. G. Sathyanarayana et al., 2003—2004) only. They demonstrated aberrant methylation of these genes in 5 to 40% of breast cancer cases. While methylation of the same loci in DNA from normal lymphocytes, buccal epithelial cells and nonmalignant breast tissue cells was observed in 0 to 7% of cases. Significant associations were found between the aberrant methylation, mRNA expression and clinicomorphological features of the tumors. This study was not repeated by other authors and the results were therefore neither confirmed nor refuted. Nevertheless, the concept of aberrant methylation of LAMA3, LAMB3 and LAMC2 as a principal feature of laminin-5 molecular pathology in cancer became commonly adopted owing to multiple recent reviews. Methyl-sensitive polymerase reaction used in our study detected promoter methylation in LAMA3, LAMB3 and LAMC2 in 96 to 100% of breast cancer specimens, adjacent normal breast tissue and breast sections. Promotor methylation of LAMA3, LAMB3 and LAMC2 was also discovered in all buccal epithelium and blood specimens. Our findings as confirmed by sequencing of bisulfate-converted DNA suggest that the promoter methylation of laminin-5 encoding genes should not be used as a diagnostic marker and that the concept of molecular pathology mechanisms of this laminin type in cancer should be revised.
Key words: laminin, breast cancer, DNA methylation.
