CC BY
16
Съ\воротслтъ\е вируспрецшнпирующие антитела в титре 1:8..Л : 16 обнаружили в реакции диффузионной преципитации у 80 % привитых цыплят на 21-е сут после иммунизации, а через неделю у всей птицы опытной группы. Контрольное внутримышечное заражение патогенным штаммом аденовируса в дозе 1 ЛД50, проведенное через 15 дн после иммунизации, показало, что вакцина надежно защищает птицу от возбудителя: все привитые цыплята остались здоровыми, в то время, как в контрольной группе заболеваемость составила 90 %, а смертность — 43 %. У павших цыплят при вскрытии обнаружили транссудат в перикардиальной полости, а
при гистологическом исследовании — базофилъные тельца-включения в клетках печени.
Результаты проведенных испытаний показали, что разработанная в НПГ1 «АВИВАК» инактивированная эмульсионная вакцина против аденовирусного гепатита безвредна для птиц и обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами.
S.V. Pankratov, N.D. Pridibayio, N.N. Krön. Vaccine against hydropericarditis syndrome of poultry (AVIVAK — ADVG).
НОВЫЕ МЕТОДЫ
УДК 619:616.98:578.831.1
Применение в диагностических целях электронной томографии негативно окрашенных вирусов со сложной структурой
Дж. Мает, Л. Демистер, компания Кода-Церва (г. Брюссель, Бельгия)
Ключевые слова: вирусы, диагностика, томография, электронная микроскопия
Сокращения: ВБН — вирус болезни Ньюкасла; ВО — вирус орф (вирус контагиозного пустулезного дерматита овец); НК — негативное контрастирование
Введение
Метод НК с успехом применяют для подготовки проб для электронной микроскопии на протяжении почти 50 лет — с тех пор, когда его предложили С. Бреннер и Р.В. Хорн [7]. Этот метод основан на погружении в матрикс тяжелого металла электронно-прозрачных частиц на подложке, что повышает их контрастность. Периодически метод модифицируют и совершенствуют [8]. Благодаря простоте и быстроте осуществления, а также отсутствию необходимости в специальных реактивах НК часто пользуются для обнаружения и идентификации вирусов [9]. Эффективность такого подхода ограничена рядом факторов, связанных с особенностями НК [10] (например, артефактами, возникающими при пересыхании анализируемых проб) и трансмиссивной электронной микроскопии (деструкции потоком электронов и изменения положения выступающих частей объектов, что делает невозможным определение их ультраструктуры). Особенно сложно изучать негативно окрашенные вирусы, имеющие сложную или ассиметричную структуру.
Некоторое представление о трехмерной структуре вирусов может дать томографическая реконструкция двухмерных микроснимков. Математическую основу томографической визуализации объектов описал Дж. Радон еще в 1917 г. в так называемой «проекционной теореме тонкого слоя» [13]. Однако потребовалось немногим менее 100 лет, чтобы электронная томографическая реконструкция стала реальным методом, основанным на интеграции гониометрических компьютерных измерений, цифровой камеры высокого разрешения и современной трансмиссивной сканирующей электронной микроскопии. Такая аппаратура постепенно входит в рутинную практику электронно-микроскопических лабораторий.
В этой статье мы описываем результаты изучения ультраструктуры негативно-окрашенных парамиксовируса и парапоксвируса, имеющих сложную структуру.
Материалы и методы
Штамм ЛаСота ВБН получили в Международной референтной лаборатории болезни Ньюкасла (Вейбридж, Великобритания). Его репродуцировали на 9...11-дневных СПВ-куриных эмбрионах посредством инокуляции в аллантоис-ную полость. [12].
Источником ВО служили пустулы слизистой оболочки ротовой полости овцы.
Суспензии этих вирусов окрашивали методом H К по стандартной схеме. Покрытые пиолоформом и углем медные сеточки (Agar Scientific) обрабатывали 1%-м алциановым синим (Fluka, Швеция) для усиления гидрофильное™ и 5 раз промывали водой. Затем на них помещали по капле вирусной суспензии, оставляли на 10 мин при комнатной температуре и 2 раза промывали водой. Сеточки с ВБН дополнительно обрабатывали 1 мин суспензией золотых частиц диаметром 10 нм, покрытых козьей антисывороткой к IgG мыши (Aurion, Нидерланды) — они служили основным маркером центровки изображения. Вслед за этим сеточки окрашивали 10 с каплей 2%-го уранил ацетата (Agar Scientific) или 1%-го фосфорно-вольфрамового калия (рН 7.2). Сеточки помещали в держатель (Model 2020, Fischione instruments) и исследовали в трансмиссивном электронном микроскопе Technai Spirit (FEI Со, Нидерланды).
Серийную микросъемку осуществляли в автоматическом режиме работы томографического модуля Explore 3D под разными углами наклона (с шагом в 1,5°) с помощью соответствующего программного обеспечения; каждый раз при изменении угла наклона корректировали фокусное расстояние. Снимки делали камерой высокого разрешения 4*4 k Eagle с увеличением в 49 000 раз. Их обрабатывали с применением программы Inspect 3D (версии 2,5). Серийные снимки ВО выравнивали по диаметру поперечного сечения изображения, а снимки ВБН — по тому же критерию и величине шести или большего количества частиц золота. Реконструкцию трехмерных изображений осуществляли на основании повторного определения алгоритма SIRTV и визуализировали вирусные частицы с помощью программы AMIRA (Mercury, Франция). На обработку каждой пробы тратили около 12 ч. Карту плотности гликопротеина F ВБН получали на основании кристаллографического анализа 11 ] с применением UCSF специальной компьютерной программы [2].
Результаты
Электронная томография параноксвируса. Негативно окрашенные вирионы ВО имеют эллипсоидную форму и ориентировочные размеры 250 х 150 нм. Их идентификационным признаком служит наличие поверхностных нитей, которые на снимках выглядят как пересекающиеся друг с другом образования (рис. 1А). В зависимости от целостности вирионов и обусловленной этим глубины проникновения в них красителя поверхностные нити могут становиться менее заметными (рис. 1Б) или вообще невидимыми, хотя неровность поверхности у их основания все равно остается различимой. Г1о аналогии с классификацией частиц ортопоксвирусов вирионы, изображенные на рисунках 1А и Б можно отнести к М (от аббревиатуры английского названия ягод шелковицы «mulberry») и С (капсульному) типам соответственно, несмотря на то, что четко видимых внутренних структур или латеральных телец, которыми обладают ортопоксивирусы, мы никогда не обнаруживали в частицах С-типа парапоксвирусов.
С помощью электронной томографии осуществили трехмерную реконструкцию негативно окрашенных частиц ВО. При обработке изображений вирионов на уровне их оболочки всегда с легкостью находили поверхностные нити даже в частицах С-типа (видеозапись I1). Параллельная ориентация снимков позволила установить, что нити образуют через более или менее равные промежутки завитки спирали (см. видеозапись 2). При анализе 8 электронно-томографических снимков разных частиц ВО обнаружили, что частицы этого вируса сильно уплощены (видеозапись 3). Использованный маркер (полистиреновые частицы) не был деформирован и сохранял сферическую форму, что подтверждает точность полученных трехмерных изображений вирионов.
Электронная томография паралшксовируса. На рисунке 2А видна негативно окрашенная частица ВБН. Ее периферия покрыта бахромой, которая образована гликопротеиновыми выступами, хотя невозможно точно определить очертания отдельных шипов. О наличии второй характерной для пара-миксовирусов морфологической особенности — внутренней рибонуклеопротеиновой спирали — в данном случае можно только догадываться. Электронная томография позволила осуществить трехмерную реконструкцию негативно окрашенного вириона этого парамиксовируса. Частицы ВБН оказались сильно уплощенными — в 2-наиравленни снимков их толщина была меньше 50 нм. На изображениях реконструированных вирионов отчетливо просматривались не только гликопротеиновые выступы (рис. 2Б. В и видеозапись 4), но их части — головка, шейка и основание (рис. 2В и Г). Высота гликопротеиновых выступов составляла 17 нм. Диаметр их головок, имевших в сечении форму круга (рис. 2В), был приблизительно равен 6 нм, а диаметр оснований, в сечении
1 Видеозаписи можно посмотреть на сайте журнала (www. rvgfarm.ru)
Рис. 2. НК и электронная томография парамиксовируса (ВБН). А — частица ВБН. Б и В — виртуальные срезы толщиной 44 нм того же вириона, сделанные в его центральной части (Б) и области оболочки (В). Г и Д — увеличенные изображения участков вириона, выделенных рамкой на рисунках Б и В соответственно. Е и Ж — трехмерная модель карты плотности Р гликопротеина ВБН — виды сбоку и сверху соответственно. Риски на рисунках А, Б и В = 100 нм, на рисунке Г = 10 нм, на рисунке Д = 8 нм
круглых по форме, не превышал 2 нм. Форма выростов на трехмерных электронно-томографических изображениях полностью соответствовала карте плотности Р-гликопротеи-на ВБН. На снимках центральной части вирионов (рис. 2Б и видеозапись 4), особенно вирионов, в которые проникли частицы краски, были заметны фрагменты спирали рибонуклео-протеина, имевшие различную длину, диаметр 17 нм, центральный канал диаметром около 5 нм и расстояниями между соседними витками спирали в 5 нм. Рибонуклеопротеин окружала электронно-прозрачная оболочка, толщина которой была приблизительно такой же, как и поверхностной глико-протеиновой бахромы (14... 18 им). Идентичные результаты получили при анализе 20 электронных томограмм.
На рисунке ЗА представлен негативно окрашенный вири-он, напоминающий формой и внешним видом частицы пара-миксовирусов. Этот агент обнаружили в патологическом материале, взятом от больного теленка. На поверхности вириона отсутствуют протеиновые образования или бесструктурные компоненты. По этому критерию можно говорить о том, что данный агент не является парамиксовирусом.
Рис. 3. НК и электронная томография вируса, выделенного от теленка. А — общий вид вириона, внешне и по размерам напоминающего парамиксовирус; Б — виртуальный срез толщиной 44 нм центральной части вириона. Риска = 100 нм
д
-
Рис. 1. НК и электронная томография парапоксвируса (ВО): А и Б — М- и С-частицы ВО, окрашенные уранил ацетатом. Масштаб обоих снимков одинаков. Риска = 100 нм
РВЖ СХЖ №2-2009
43
Обсуждение
Электронно-томографическая реконструкция негативно окрашенных частиц нарапоксвируса и нарамиксовируса позволила изучить детали ультраструктуры этих агентов, которые плохо заметны на стандартных электронно-микроскопических снимках. Последовательный анализ срезов реконструированного трехмерного изображения вирионов дает возможность детально изучать строение структур, имеющих субнанометрическую толщину, избегая артефактов, присущих трансмиссивной электронной микроскопии и обусловленных смещением отдельных частей вирионов в процессе их обработки и исследования.
С помощью электронной томографии у С-частиц ВО обнаружили лишь неровности поверхности, соответствующие отходящим от этих мест нитям, которые хорошо видны у М-час-тиц агента. Почти параллельная ориентация нитей подтверждает предположение Ц.Р. Медли и A.M. Филда [И] о том, что эти структуры спирально закручены вокруг вирионов. Обычно для обнаружения таких нитей исследователи ищут в препаратах типичные М-частицы, а если это не удается, то приходится готовить и исследовать новые препараты, чтобы поставить окончательный диагноз [11]. В особых случаях (например, при диагностике ящура или ортоноксвирусной инфекции человека) из соображений безопасности тестируемые пробы обрабатывают концентрированными препаратами, инактиви-рующими вирусы, что ведет к повреждению оболочек вирионов. К изменению морфологии вирусных агентов ведет также неправильное хранение патологического материала (особенно кожи). В таких пробах, взятых от инфицированных парапокс-вирусами животных, обнаруживают лишь вирионы типа С с проникшими в них частицами красителя. Электронная томография, обеспечивающая изучение структуры вирусных частиц на более тонком уровне, в т.ч. позволяющая обнаруживать поверхностные нити у парапоксивирусов, по всей видимости, найдет широкое применение для диагностики вирусных инфекций. У ВБН данный метод не только позволяет рассматривать отдельные поверхностные гликопротеиновые выросты, но даже изучать их ультраструктуру. В частности установили наличие у этих образований чашевидной головки и основания диаметром в 2 нм, соединенных цилиндрической ножкой, что полностью соответствует ранее созданной кристаллографической структуре протеина слияния (F) ВБН [5]. В будущем будет предпринята попытка дифференцировать с помощью электронной томографии этот гликопротеин от гемагглюти-нин-нейраминидазы. К сожалению, кристаллографической модели последней пока не создано, а ее трехмерная модель [6] характеризует только головную часть белка. С помощью трансмиссивной электронной микроскопии нам также удалось определить структуру рибонуклеопротеина, покрытого оболочкой толщиной 14... 18 нм, Полученные данные подтверждают, что матриксиый протеин тесно прилегает к фосфоли-пидной мембране, приобретенной вирионом у инфицированной им клетки.
Из-за плеоморфности и плотной упаковки поверхностной гликопротеидной оболочки парамиксовирусы сложно отличить от микоплазм [И] и/или мембран-содержащего клеточного дебриса (например, от митохондрий, у которых имеются поверхностные выступы, что делает их похожими на вирусы с поверхностными шипами [4]. Более того, парамиксовирусы бывает особенно трудно идентифицировать в негативно окрашенных препаратах — чаще всего это удается по обнаружению в тестируемых пробах свободных вирусных нуклеокапсидов. На рисунке 3 отчетливо видно, что в таких случаях с успехом можно пользоваться электронной томографией.
Недостаток простого и быстро осуществимого метода НК, использованного нами и который применяют во многих диагностических лабораториях, состоит в том, что он осуществляется без предварительной фиксации, как это делается при крио-
электронной микроскопии. Поэтому структура вирусов в тестируемых препаратах может значительно изменяться. Электронная томографическая реконструкция негативно окрашенных ВО и ВБН показала, что вирионы этих агентов сильно уплощены. Фрагментация рибонуклеопротеина ВБН была вызвана, по всей видимости, силами, возникшими во время высыхания препарата. Таким образом, апробированный нами метод электронной томографии позволяет избегать артефактов, которые часты при НК препаратов, проводимом для обычной электронной микроскопии [10], и ответственны за значительную вариабельность данных литературы о размерах и морфологии одних и тех же вирусов. Криоэлектронная томография неокрашенных препаратов дает возможность избежать подобных артефактов и служит «методом выбора» при необходимости визуализировать компоненты вирусов, имеющих сложную структуру [3]. Однако широкому внедрению данного метода пока препятствует необходимость в оснащении лабораторий современным оборудованием.
Крионегативное окрашивание [14] в комбинации с трехмерным реконструированием может стать альтернативой криоэлек-тронной микроскопии высокого разрешения [8]. К сожалению, такой подход также нуждается в высоких очистке и концентрации вирусных частиц, что весьма непрактично для диагностической электронной микроскопии. Несмотря на это, результаты проведенного нами исследования показали, что простая процедура НК предоставляет много преимуществ по сравнению с крионегативным окрашиванием тестируемых проб.
В заключение отметим, что комбинирование НК вирусов, имеющих сложную структуру, с электронной томографией позволяет избегать артефактов, присущих НК, и отчетливо визуализировать субнанометрические структуры вирионов, чего практически невозможно добиться с помощью трансмиссивной электронной микроскопии вследствие смещения структурных компонентов вирусных частиц. Как показали приведенные нами примеры, электронной томографией можно пользоваться для подтверждения диагноза при вирусных болезнях.
БИБЛИОГРАФИЯ
1.Anon. RCSB protein databank entry 1G5G. http://www.rcsb.org/pdb/cgi/ explore.cgi?pdbld=1 g5g.
2. Anon. CSF chimera software [http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/].
3. Adrian M., DubochetJ., Fuller S.D., Harris J.R. Cryo-negative staining. Micron, 1998, 29, 145—160.
4. Almeida J.D. Uses and abuses of diagnostic electron microscopy. Curr Top Microbiol Immunol, 1998, 104, 147—158.
5. Chen L., Gorman J.J., Mc Kimm-Breschkin J. et al. The structure of the fusion glycoprotein of Newcastle disease virus suggests a novel paradigm for the molecular mechanism of membrane fusion. Structure. 2001. 9, 255—266.
6. Crennell S., TakimotoT., PortnerA., Taylor G. Crystal structure of the multifunctional paramyxovirus hemagglutinin—neuraminidase. Nat Struct Biol, 2000, 7, 1068—1074.
7. Brenner S. Home R.W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta 1959, 34, 103—110.
8. Harris J.R., Bhella D., Adrian M. Recent developments in negative staining for transmission electron microscopy. Microscopy and Analysis, 2006, 20, 5—9.
9. Hazelton P.R., Gelderblom H.R. Electron microscopy for rapid diagnosis of infectious agents in emergent situations. Emerg Infect Dis, 2003, 9, 294—303.
10. Hayat M.A., Miller S.E. Negative staining. In: Hayat M.A., Miller S.E. (Ed.). Negative staining. Hill Publ Co; 1990, 36-^18.
11. Madeley C.R., Field A.M. Virus Morphology. 2nd Ed. London, Churchill Livingstone, 1988.
12. Meulemans G., Gonze M., Carlier M.C. et al. Evaluation of the use of monoclonal antibodies to hemagglutinin and fusion glycoproteins of Newcastle disease virus for virus identification and strain differentiation purposes. Arch. Virol, 1987, 92, 55—62.
13. Radon J. On determining functions from their integral values along certain manifolds(1917). Translated by Parks P.C. IEEE Transactions in Medical Imaging, 1986, 5, 170—176.
14. Subramaniam S., Bartesaghi A., Liu J. et al. Electron tomography of viruses. Curr Opin Struct Biol, 2007, 17, 596—602.
Mast J., Demeestere L. Electron tomography of negatively stained complex viruses: application in their diagnosis. Diagnostic Pathol, 2009, 4:5 doi:10.1186/1746-1596-4-5 (BMC OA).
