CC BY
91
ПТИЦА
УДК 619:616.98:579.881.11:636.52/58 ВЯКЦИНЗ. ПрОТИВ
синдрома гидроперикардита птиц
(АВИВАК-АДВГ)
C.B. Панкратов, Н.Д. Придыбайло, Н.В. Крон, НПП «АВИВАК» (г. С.-Петербург, Россия)
Ключевые слова: аденовирус, вакцина, птица, синдром гидроперикардита кур
Прошло более 20 лет с того времени, когда в Пакистане вблизи городов Карачи и Лахор, где сконцентрировано крупное бройлерное производство, возникла новая болезнь. Она чаще поражала бройлеров в возрасте 3...5 нед, реже — стада ремонтного поголовья, проявляясь вялостью, скученностью, взъерошенностью оперения, появлением желтоватой слизи в помете. В первые дни вспышки погибало до 20 % поголовья, а в последующий период падеж мог возрастать до 70...80 %. На вскрытии у павших птиц отмечали скопление прозрачного транссудата в перикардиаль-ной полости, очаги некроза в печени в виде сероватых пятен, перемежающихся с геморрагическими очагами. При гистологическом исследовании выявляли базофильные и эозино-фильные внутриядерные тельца-включения в гепатоцитах и дегенеративные изменения в поджелудочной железе, почках н миокарде. Возбудителем болезни оказался аденовирус группы I, относящийся преимущественно к серотипам 4 и 8. На основании характера патоморфологических изменений и этиологии болезнь назвали «аденовирусным гепатитом с включениями — гидроперикардитом» (син.: синдром гидроперикардита кур). Следует отметить, что в патогенезе заболевания важную роль играют болезнь Гамборо и инфекционная анемия, при которых у птицы снижается иммунитет.
В странах, где синдром гидроперикардита кур встречается наиболее часто (Пакистан, Индия, Мексика, Чили, РФ и др.), он наносит значительный экономический ущерб. Поэтому для профилактики болезни следует соблюдать, как общие ветери-нарно-санитарные мероприятия (размещать птицу разных возрастов по зонам, обеззараживать корма, проводить дезинфекцию, исключать контаминацию патогенными микроорганизмами вакцин), так и применять специфические средства.
В нашей стране зарегистрированы два препарата, предназначенные для специфической профилактики болезни: вакцина против синдрома гидроперикардита кур инактивированная сорбированная (ВНИИЗЖ, Россия) и вакцина жидкая инактивированная против аденовирусного гепатита с включениями — гидроперикардита кур из штамма «Т-12» (ВНИВИП, Россия). Однако широкое распространение аденовирусного гепатита с включениями — гидроперикардита в России (2,9 % от числа регистрируемых случаев всех инфекционных болезней кур) свидетельствует о необходимости более широкого внедрения уже известных вакцин и создания новых.
Цель нашей работы состояла в изготовлении и испытании инактивированной эмульсионной вакцины против синдрома гидроперикардита кур.
В одном из птицеводческих хозяйств, неблагополучном по данному заболеванию, взяли материал от павших птиц, имевших типичные для аденов1груснош гепатита с включениями — гидроперикардита патологоанатомические изменения. Изолированный из него вирус использовали для приготовления вакцины.
Накопление производственного штамма вируса вели на серонегативных по данной инфекции цыплятах-бройлерах в возрасте 15, 20 и 30 сут. Их заражали 0,5 см3 вируссодержа-
щего материала в мышцу бедра. С соблюдением всех правил асептики и антисептики из трупов павших птиц извлекали печень. Орган гомогенизировали, а гомогенат осветляли центрифугированием. Надосадочную жидкость сливали и инак-тивировали. Антиген контролировали на полноту инактивации, активность в реакции диффузионной преципитации и стерильность. После такой проверки из него готовили опытные серии инактивированной эмульсионной вакцины.
В результате лабораторных испытаний оптимальной оказалась вакцина на основе масляного адъюванта ISA-70. По внешнему виду препарат представляет собой однородную стерильную эмульсию белого цвета с вязкостью 31 мм2/с и стабильностью 3,0 мм (вязкость определяли на вискозиметре ВСЖ-2, а стабильность 30-минутным центрифугированием при 4000 об/мин).
Безвредность препарата проверили на цыплятах 14 и 50-суточного возраста. Им инокулировали вакцину подкожно в область нижней трети шеи в объеме 2 см3. Клинических нарушений в течение 15-дневного периода наблюдения у привитой птицы не отметили. При вскрытии птиц, убитых по завершении опыта, в месте введения вакцины не обнаружили признаков воспалительной реакции; значительная часть вакцины рассосалась, и в тканях (под кожей шеи и в области зоба) были видны лишь ее единичные вкрапления диаметром 0,1...1,0 мм.
Для оценки антигенной и иммуногенной активности вакцины сформировали 2 группы бройлеров 14-суточного возраста, серонегативных к синдрому гидроперикардита кур. Цыплят первой группы однократно подкожно (в область нижней трети шеи) иммунизировали эмульсионной вакциной в объеме 0,5 см3/гол. Вторая группа служила интактным контролем. Через 15 дн после вакцинации 50 % птицы каждой группы использовали для определения иммуногенной активности вакцины, а остальных цыплят —для определения ее антигенной активности.
Антигенные свойства опытной серии препарата оценивали по наличию антител в реакции диффузионной преципитации, а его иммуногенность определяли с помощью контрольного заражения подопытной группы патогенным изоля-том возбудителя болезни.
Транссудат в полости перикарда цыпленка, экспериментально зараженного возбудителем синдрома перикардита кур
РВЖ СХЖ №2-2009
41
ПТИЦА
Съ\воротслтъ\е вируспрецшнпирующие антитела в титре 1:8..Л : 16 обнаружили в реакции диффузионной преципитации у 80 % привитых цыплят на 21-е сут после иммунизации, а через неделю у всей птицы опытной группы. Контрольное внутримышечное заражение патогенным штаммом аденовируса в дозе 1 ЛД50, проведенное через 15 дн после иммунизации, показало, что вакцина надежно защищает птицу от возбудителя: все привитые цыплята остались здоровыми, в то время, как в контрольной группе заболеваемость составила 90 %, а смертность — 43 %. У павших цыплят при вскрытии обнаружили транссудат в перикардиальной полости, а
при гистологическом исследовании — базофилъные тельца-включения в клетках печени.
Результаты проведенных испытаний показали, что разработанная в НПГ1 «АВИВАК» инактивированная эмульсионная вакцина против аденовирусного гепатита безвредна для птиц и обладает высокими антигенными и иммуногенными свойствами.
S.V. Pankratov, N.D. Pridibayio, N.N. Krön. Vaccine against hydropericarditis syndrome of poultry (AVIVAK — ADVG).
НОВЫЕ МЕТОДЫ
УДК 619:616.98:578.831.1
Применение в диагностических целях электронной томографии негативно окрашенных вирусов со сложной структурой
Дж. Мает, Л. Демистер, компания Кода-Церва (г. Брюссель, Бельгия)
Ключевые слова: вирусы, диагностика, томография, электронная микроскопия
Сокращения: ВБН — вирус болезни Ньюкасла; ВО — вирус орф (вирус контагиозного пустулезного дерматита овец); НК — негативное контрастирование
Введение
Метод НК с успехом применяют для подготовки проб для электронной микроскопии на протяжении почти 50 лет — с тех пор, когда его предложили С. Бреннер и Р.В. Хорн [7]. Этот метод основан на погружении в матрикс тяжелого металла электронно-прозрачных частиц на подложке, что повышает их контрастность. Периодически метод модифицируют и совершенствуют [8]. Благодаря простоте и быстроте осуществления, а также отсутствию необходимости в специальных реактивах НК часто пользуются для обнаружения и идентификации вирусов [9]. Эффективность такого подхода ограничена рядом факторов, связанных с особенностями НК [10] (например, артефактами, возникающими при пересыхании анализируемых проб) и трансмиссивной электронной микроскопии (деструкции потоком электронов и изменения положения выступающих частей объектов, что делает невозможным определение их ультраструктуры). Особенно сложно изучать негативно окрашенные вирусы, имеющие сложную или ассиметричную структуру.
Некоторое представление о трехмерной структуре вирусов может дать томографическая реконструкция двухмерных микроснимков. Математическую основу томографической визуализации объектов описал Дж. Радон еще в 1917 г. в так называемой «проекционной теореме тонкого слоя» [13]. Однако потребовалось немногим менее 100 лет, чтобы электронная томографическая реконструкция стала реальным методом, основанным на интеграции гониометрических компьютерных измерений, цифровой камеры высокого разрешения и современной трансмиссивной сканирующей электронной микроскопии. Такая аппаратура постепенно входит в рутинную практику электронно-микроскопических лабораторий.
В этой статье мы описываем результаты изучения ультраструктуры негативно-окрашенных парамиксовируса и парапоксвируса, имеющих сложную структуру.
Материалы и методы
Штамм ЛаСота ВБН получили в Международной референтной лаборатории болезни Ньюкасла (Вейбридж, Великобритания). Его репродуцировали на 9...11-дневных СПВ-куриных эмбрионах посредством инокуляции в аллантоис-ную полость. [12].
Источником ВО служили пустулы слизистой оболочки ротовой полости овцы.
Суспензии этих вирусов окрашивали методом H К по стандартной схеме. Покрытые пиолоформом и углем медные сеточки (Agar Scientific) обрабатывали 1%-м алциановым синим (Fluka, Швеция) для усиления гидрофильное™ и 5 раз промывали водой. Затем на них помещали по капле вирусной суспензии, оставляли на 10 мин при комнатной температуре и 2 раза промывали водой. Сеточки с ВБН дополнительно обрабатывали 1 мин суспензией золотых частиц диаметром 10 нм, покрытых козьей антисывороткой к IgG мыши (Aurion, Нидерланды) — они служили основным маркером центровки изображения. Вслед за этим сеточки окрашивали 10 с каплей 2%-го уранил ацетата (Agar Scientific) или 1%-го фосфорно-вольфрамового калия (рН 7.2). Сеточки помещали в держатель (Model 2020, Fischione instruments) и исследовали в трансмиссивном электронном микроскопе Technai Spirit (FEI Со, Нидерланды).
Серийную микросъемку осуществляли в автоматическом режиме работы томографического модуля Explore 3D под разными углами наклона (с шагом в 1,5°) с помощью соответствующего программного обеспечения; каждый раз при изменении угла наклона корректировали фокусное расстояние. Снимки делали камерой высокого разрешения 4*4 k Eagle с увеличением в 49 000 раз. Их обрабатывали с применением программы Inspect 3D (версии 2,5). Серийные снимки ВО выравнивали по диаметру поперечного сечения изображения, а снимки ВБН — по тому же критерию и величине шести или большего количества частиц золота. Реконструкцию трехмерных изображений осуществляли на основании повторного определения алгоритма SIRTV и визуализировали вирусные частицы с помощью программы AMIRA (Mercury, Франция). На обработку каждой пробы тратили около 12 ч. Карту плотности гликопротеина F ВБН получали на основании кристаллографического анализа 11 ] с применением UCSF специальной компьютерной программы [2].
