CC BY
20
УДК 619:578.833.3:578.3:616-072
Ключевые слова: вирус диареи крупного рогатого скота, нуклеокапсид, электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия
Key words: bovine viral diarrhea, nucleocapsid, electron microscopy, atomic force microscopy
Красочко П. А., Чижик С. А., Кучерявенко А. А., Красочко П. П., Дрозд Е. С., Шахнович А. А.
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ ВИРУСА ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА МЕТОДАМИ АТОМНО-СИЛОВОй И ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
RESEARCH OF MORPHOLOGY OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS BY ATOMIC FORCE AND ELECTRON MICROSCOPY
'Республиканское унитарное предприятие «Институт экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского» Адрес: 220003, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Брикета, 28. E-mail: krasochko@mail.ru
'S. N. Vyshelessky Institute of Experimental Veterinary Medicine Address: 220003, Republic of Belarus, Minsk, Briket str., 28. E-mail: krasochko@mail.ru ^Государственное научное учреждение «Институт тепло- и массообмена им. А. В. Лыкова НАН Беларуси» Адрес: 220072, Республика Беларусь, г. Минск, ул. П. Бровки, 15. E-mail: drozd.elizaveta@gmail.com 2A. V. Likov Institute of Heat and Mass Transfer of the National Academy of Sciences of Belarus Address: 220072, Republic of Belarus, Minsk, P. Brovka str., 15. E-mail: drozd.elizaveta@gmail.com 3Институт ветеринарной медицины Национальной академии аграрных наук Украины,
Адрес: 03151, Украина, г. Киев, ул. Донецкая, 30. E-mail: uhovskiy@ukr.net 3Institute of veterinary medicine of the National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine
Address: 03151, Ukraine, Kyiv, Donetskaya str., 30. E-mail: uhovskiy@ukr.net 4Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины Адрес: 210026, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. 1-я Доватора, 7/11. E-mail: 7696695@gmail.com 4Vitebsk Sign of Honor Order State Academy of Veterinary Medicine Address: 210026, Republic of Belarus, Vitebsk, 1 Dovator srt., 7/11. E-mail: 7696695@gmail.com
Красочко Петр Альбинович, д. в. н., д. б. н., академик РАЕН, проф., зам. директора1
Krasochko Petr A., Doctor of Veterinary Sciences, Doctor of Biological Sciences, Professor, Deputy Director1 Чижик Сергей Антонович, д тех. н., проф., чл.-корр. НАН Беларуси, зам. Председателя Президиума НАН Беларуси, зав. лабораторией2 Chizhik Sergey A., Doctor of Technical Sciences, Professor, Corresponding member of the National Academy of Sciences of Belarus, Head of the Laboratory2 Кучерявенко Александр Алекесандрович, к. в. н., ст. научн. сотрудник, зав. лабораторией лептоспироза3 Kucheryavenko Alexander А., Ph.D. in Veterinary Science, Senior Research Scientist, Head of the Laboratory for Leptospirosis3 Красочко Павел Петрович, к. в. н., ст. научн. сотрудник4 Krasochko Pavel P., Ph.D. in Veterinary Science, Senior Research Scientist4 Дрозд Елизавета Сергеевна, к. физ.-мат. наук, зав. лабораторией2 Drozd Elisaveta S., Ph.D. in Physics and Mathematics, Head of the Laboratory2 Шахнович Анастасия Андреевна, магистр технических наук2 Shakhnovich Anastasia A., Мaster of Technical Sciences2
Аннотация. Приведены результаты сравнительного изучения морфологии вируса диареи крупного рогатого скота методами электронной и атомно-силовой микроскопии. Показано, что с помощью электронной микроскопии возможно определить топографические данные вируса, его размеры, количество нуклеокапсидов. Атомно-си-ловой микроскопией возможно исследовать вирусные частицы без дополнительного контрастирования атомами тяжелых металлов, определить морфологию частиц, особенности адсорбции вирусных частиц на поверхность, возможно получать трехмерные изображения.
Summary. The paper presents results of a comparative study of the morphology of the bovine viral diarrhea virus by electron and atomic force microscopy. It is shown that electron microscopy allows to determine topography of the virus, its dimensions, the number of nucleocapsids. By use of atomic force microscopy it is possible to investigate viral particles without staining with heavy metal atoms, determine the morphology of the particles, particularity of adsorption of viral particles to the surface, obtain three-dimensional images.
Введение
Среди вирусных инфекций крупного рогатого скота наиболее распространена вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек. Это контагиозная болезнь преимущественно молодых животных, характеризующаяся эро-зивно-язвенным воспалением слизистых оболочек пищеварительного тракта. Зачастую возникает синдром респираторного заболевания, эрозивно-язвенный стоматит с хромотой, а также латентная инфекция коров, приводящая к острой инфекции плодов, вызывая их мумификацию, аборт, врожденные дефекты и диарею новорожденных телят.
По современной классификации возбудителем вирусной диареи крупного рогатого скота является РНК-геномный вирус, относящийся к семейству Togaviridae, роду Pestivirus.
При изучении этиологии вирусных заболеваний выделение вирусов и дальнейшее определение их морфологии является одним из основных методов вирусологического исследования. Традиционно наиболее распространенным методом, применяемым в вирусологических исследованиях является электронная микроскопия (ЭМ), которая дает увеличение объектов в 200-400 раз большее, чем световая, а разрешающая способность лучших современных электронных микроскопов достигает 3-5 Е, т. е. их полезное увеличение может быть доведено до 800-1 500 тыс. раз.
В течение последних десятилетий быстрое развитие получили методы сканирующей зондовой микроскопии, в том числе атомно-силовая микроскопия (АСМ), ставшая эффективным инструментом для решения разнообразных задач вирусологии.
Атомно-силовой микроскоп - сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для определения рельефа поверхности с разрешением от десятков ангстрем вплоть до атомарного. В отличие от сканирующего туннельного микроскопа, с помощью атомно-силового микроскопа можно исследовать как проводящие, так и непроводящие поверхности. Важнейшее преимущество атомно-силовой микроскопии перед электронной состоит
в том, что исследования можно проводить не только в вакууме, но и на воздухе и, что особенно важно, в жидкой среде, с использованием жидкостной ячейки. В ней экспериментатор имеет возможность наблюдать за течением процессов в режиме реального времени [1], что особенно ценно для изучения биологических объектов.
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение морфологии вируса диареи крупного рогатого скота с использованием электронной и атомно-силовой микроскопии.
Материалы и методы
Исследования проводились в условиях отдела вирусных инфекций РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского», лаборатории биотер-момеханики Института тепло- и массооб-мена имени А. В. Лыкова НАН Беларуси, лаборатории лептоспироза с музеем микроорганизмов Института ветеринарной медицины Национальной академии аграрных наук Украины, Институте прикладной ветеринарной медицины и биотехнологии УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины».
В работе использован вирус диареи крупного рогатого скота (штамм ВК -1 № 28). Вируссодержащую жидкость накапливали на перевиваемой культуре клеток МДБК с использованием роллерного культивирования. Инфекционный титр вируса - 7,8 lg ТЦД/50 мл [2].
Для электронной и атомно-силовой микроскопии использован вирус диареи инак-тивированный формальдегидом в 0,3 % концентрации. Для электронно-микроскопической морфологической оценки вируса диареи использовали культуру клеток почки эмбриона коровы, зараженную вирусом из расчета 5-10 ИЕ на клетку. Адсорбцию проводили при +2...+4 °С с целью синхронизации. Материал отбирали и подвергали препарированию через 5-8 часов после заражения, т. е. в период появления первых ранних признаков изменений и максимального развития цитопатического действия. Фиксацию проводили в 5 % глютаральдегиде с последующей
обработкой 1 % OsO4 по Кольфильду. После обезвоживания в ацетоне препарат заключали в сополимере метилакрилата и в эпон-812 с арладитом по Моленхауэру. Ультратонкие срезы исследвоали с помощью электронного микроскопа УЭМВ-100К [3].
Для атомно-силовой микроскопии было подготовлено 2 образца вирусов: с высокой (7,0-7,8 lg ТЦД/50 мл) и низкой концентра-цией(5,0-5,5 lg ТЦД/50 мл), т. е. суспензия вируса наносилась в количестве 20 и 10 мкл на подложку, в качестве которой использовалось покровное стекло, обработанное этиловым спиртом для обезжиривания поверхности. Исследование вируса осуществляли при помощи специализированного экспериментального комплекса, совмещающего функции сканирующей зондовой (АСМ NT-206, ОДО «Микротестмашины», Беларусь) и оптической микроскопии (оптическая система, НПРУП «ЛЭМП» БелОМО, Беларусь). АСМ-сканирование проводили стандартным кремниевым зондом CSC21 (MicroMasch Co, Эстония) с жесткостью 2 Н/м и радиусом закругления 40 нм в контактном режиме.
Результаты исследований
На рисунках 1-3 приведены результаты электронно-микроскопического исследования вируса диареи.
Рис. 2. Вирион вируса диареи в цитоплазматической
вакуоли культуры клеток ПЭК.
Увеличение х90 000 (по А. А. Кучерявенко, 1979).
Рис. 1. Формирование вирионов вируса диареи в цитоплазме культуры клеток ПЭК. Увеличение х80 000 (по А. А. Кучерявенко, 1979).
Рис. 3. Зрелые вирионы вируса диареи, вышедшие из культур клеток ПЭК.
Увеличение х150 000 (по А. А. Кучерявенко, 1979).
Проведенные исследования показали, что в основном сформированные вирионы наблюдались за пределами клеток или в поверхностных участках цитоплазмы или цитоплазматических полостях (рис. 1-3). Вирус сферический, крупный, имеет внешнюю белково-липидную оболочку с поверхностными выступами, сложный по структуре, содержит более 20 структурных белков. Вирионы имели довольно правильную ово-
:<;«< I"» Т;И>*™ ZiM.Ott [».till
t
Рис. 4. АСМ-изображения вирусных частиц вируса диареи крупного рогатого скота (низкая концентрация вируса): трехмерное изображение, размер поля сканирования 0,96 х 0,96 мкм2.
идную или овальную форму и состояли из трехслойной оболочки нуклеотида. Размеры вируса составляи 95-110 нм, а размер нуклеотида - около 50 нм. Встречались вири-оны с плотным или полым (кольцевидным) нуклеотидом.
При изучении вируса диареи крупного рогатого скота при использовании атомно-силовой микроскопии получены следующие результаты (рис. 4-7).
На микрофотографиях вируса крупного рогатого скота отчетливо видна поверхность вирусных частиц. При этом при более вы-
сокой концентрации вируса частицы вируса располагаются в виде конгломератов.
При этом отчетливо видна поверхность вирусных частиц. При низкой концентрации вируса (размер поля сканирования 0,96 х 0,96 мкм2) вирионы расположены одиночно на поверхности подложки, а при более высокой концентрации вируса (размер поля сканирования 1,2 х 1,2 мкм2) частицы располагаются в виде конгломератов. Характерно, что как при низкой, так и при высокой концентрации вируса возможно провести анализ расположения вирионов на поверхности подложки. Средний размер частицы диареи крупного рогатого скота в образце составил 65-85 нм.
Сканирование образцов высокой и низкой концентрации в контактном режиме позволило получить 2D- и 3D-изображения топографии поверхности частиц. Оценка профиля поверхности частиц показала, что размер вируса диареи крупного рогатого скота составляет 65-85 нм.
Далее было проведено исследование поверхности вируса. На рисунке 5 представлено АСМ-изображение отдельного вириона и выделенной поверхности по результатам сканирования участков поверхности вирусных частиц в режиме Deflection. В данном режиме в каждой точке отображается ошибка, реги-
1 2um Л 1,2um х ЗЗ.Опрп [256 X 256]
V
а
X:1.2um Y:1.2um Z:3S.0nm [3.2:1]
fta: 3. : S. 4nm
х, 1!гп б
Рис. 5. Топография частиц диареи крупного рогатого скота (высокая концентрация): а - 2D-изображение; б - 3D-изображение.
2B5.1nmx244.4nmx16.2nm 1131 х120]
а
б
Рис. 6. Топография частицы диареи крупного рогатого скота и ее профиль; а - 2D-изображение; б - 3D изображение.
Рис. 7. Топография и 3D-изображения поверхности вируса диареи крупного рогатого скота в режиме Deflection.
стрируемая в системе обратной связи (сигнал с фотодиода вида A + B - C - D). При этом особенности рельефа поверхности, не разрешаемые в других методах, могут быть визуализированы. В режиме Deflection хорошо видны микроскопические детали поверхности, на чем и основана классификация.
На рисунке 7 представлены топография и ЗЭ-изображения поверхности вируса диареи крупного рогатого скота в режиме Deflection.
На приведенных рисунках трехмерного АСМ-изображения вируса диареи крупного рогатого скота с полем сканирования 0,76 х 0,76 мкм2 отчетливо видна поверхность ви-риона. На трехмерном изображении поверхности вириона видны углубления и выступы различного размера, что характеризует морфологию вируса.
На основании проведенных исследований возможно оценить концентрацию вирусов, 2D- и ЗЭ-изображения топографии поверхности частиц.
Чрезвычайно важно то, что с помощью атомно-силовой микроскопии возможно исследовать вирусные частицы без дополнительного контрастирования атомами тяжелых металлов (как, например, для электронной микроскопии). Можно получать трехмерные изображения с высоким разрешением. Характерно, что исследования морфологии вируса диареи, проводимые с помощью электронной микроскопии, существенно пополняются исследованиями атомно-силовой микроскопией.
Выводы
1. С помощью электронной микроскопии сформированные вирионы наблюдались
за пределами клеток или в поверхностных участках цитоплазмы или цитоплазматиче-ских полостях, и имели довольно правильную овоидную или овальную форму и состояли из трехслойной оболочки нуклеотида.
2. Размеры вируса диареи составляли 95110 нм, а размер нуклеотида - около 50 нм, вирионы были с плотным или полым (кольцевидным) нуклеотидом.
3. При низкой концентрации вируса (размер поля сканирования 0,96 х 0,96 мкм2) вирионы расположены одиночно на поверхности подложки, а при более высокой концентрации вируса (размер поля сканирования 1,2 х 1,2 мкм2) частицы располагаются в виде конгломератов со средним размером вириона диареи крупного рогатого скота 65-85 нм.
4. При анализе атомно-силового трехмерного изображения вируса диареи крупного рогатого скота с полем сканирования 0,76 х 0,76 мкм2 на поверхности вириона видны углубления и выступы различного размера, что характеризует морфологию вируса.
Список литературы
1. Атомно-силовой микроскоп N1-206 / руководство по эксплуатации. - Гомель : ОДО Микротестма-шины. - 2004. - 66 с.
2. Красочко, П. А. Биотехнологические основы конструирования и использования иммунобиологических препаратов для молодняка крупного рогатого скота. Автореф. дисс. доктора биол. наук: 03.00.23 / П. А. Красочко. - ФГУ ВНИТИБП РАСХН. - Щелково, 2009. - 46 с.
3. Крюков, Н. Н. Выделение вируса инфекционного ринотрахеита на культурах перевиваемых клеток / Н. Н. Крюков, Т. И. Козыренко, Г. А. Надточей, А. А. Поздняков // Ветеринария, 1977. - № 9. -С. 46-48.
МОСКОВСКИЙ ВЕТЕРИНДРНЫИ BEB-UEHTP
.com
Заболел Ваш домашний питомец? Не отчаивайтесь ■ посетите наш веб-иентр!
V нас Вы найдете исчерпывающую информацию о бопвзни Вашога друга, лечении, профилактике и других вопросах ветеринарии, Тллла на наше«* сайте Вы можете найти адрес ближайшей к Вам ветеринарной клиники чтобы обратиться за помощью к специалистам
Кроме зтого. наш веб-центр располагает полным спектром информации па удоду за «чшигныыи-будь тс кодки или собаку пти4ы или рыбы, черепахи или экзотические животные, бы научитесь как правильна разводить кормить, драееировять и васпмтыгтть своим домяшни* питамцвв Ми странная* нйшвю еайш с Вами дипнндн илышм к сшзииши пртхчинныи аиюритшы и ибглли ветеринарии и ухода за животными К Вашим услугам - энциклопедические справочники и научные статьи о животном мире фото и видсоиатсрнапь.-, ежедневные новости и тематический форум
Мы ждем Вас по ядресу WWW. webmvc.com
