CC BY
16
УДК 581.33: 561.5(477)
ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ МЕТОДИК ИЗУЧЕНИЯ ИСКОПАЕМЫХ СПОРОДЕРМ
Н.Е. Завьялова1, С.В. Полевова2, М.В. Теклевса", А.Г. Богданов4
Хотя трансмиссионная электронная микроскопия остается непревзойденным инструментом для изучения ультраструктуры ископаемых палинологических объектов, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (в том числе А1гуБсап и 8Я-81М микроскопия), ТЭМ-томография, синхротронная рентгеновская томография и сканирующая электронная микроскопия (включая изучение полутонких срезов и метод ионного травления) также могут быть применены с разной долей успеха. Отчетливо заметна потребность в неразрушающих методах исследования ископаемого материала, а также в более совершенных способах реконструкции трехмерной организации объектов.
Ключевые слова: ТЭМ, ТЭМ-томография, КЛСМ, синхротронная рентгеновская томография, СЭМ, ультраструктура, ископаемые споры и пыльцевые зерна.
Наиболее детальную информацию о внутреннем строении палинологических объектов в настоящее время можно получить с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Однако у этого метода есть серьезные недостатки: трудоемкость, обусловленная продолжительной подготовкой объекта для исследования; опасность утраты части образцов в процессе подготовки; деструктивность метода, из-за чего некоторые объекты (голотипы таксонов и другие редкие и/или ценные экземпляры) оказываются недоступными для изучения, а уже изученные объекты (сохранившиеся лишь в виде оставшихся после ультратомии блоков и срезов на сетках) нельзя изучать повторно в полной мере. Палиноморфологи ищут способы снижения отрицательного влияния этих особенностей метода ТЭМ на результаты исследований, а также не оставляют надежды усовершенствовать процесс исследования путем применения альтернативных или дополняющих методик.
В данной статье мы рассмотрим возможности изучения внутреннего строения ископаемых спородерм методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), ТЭМ-томографии, синхротронной рентгеновской томографии (СРТ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). К достоинствам КЛСМ относятся более высокая разрешающая способность
по сравнению с традиционной световой микроскопией, возможность изучать обычные палинологические препараты без дополнительной подготовки (в том числе и постоянные препараты с голотипами палинологических таксонов), получать серии виртуальных срезов всего объекта, выполнять на их основе трехмерные реконструкции, произвольно выбирать направление виртуальных срезов уже реконструированного объекта, реконструировать поверхность объекта, рассматривать объект с разных сторон. При изучении с помощью КЛСМ объект не разрушается. Единственный, но очень серьезный недостаток КЛСМ - более низкая разрешающая способность по сравнению с электронной микроскопией.
Идея конфокального светового микроскопа была впервые реализована в 1951 г. Марви-ном Минским в Массачусетском университете, США. Она состояла в том, что в оптическую систему вводили специальную диафрагму, названную конфокальной. Эта диафрагма (pinhole) пропускала в окуляр только лучи, формирующие изображение плоскости объекта, на которую в данный момент сфокусирован объектив (так называемое изображение оптического среза), и задерживала лучи, формирующие несфокусированные изображения слоев объекта, лежащих выше и ниже. Получаемое в такой оптической
1 Завьялова Наталья Евгеньевна - зав. лабораторией палеоботаники Палеонтологического института им. А.А. Борисяка РАН
(ПИН РАН), канд. биол. наук (zavial@paleo.ru); 2 Полевова Светлана Вячеславовна - вед. науч. сотр. кафедры морфологии и си-
стематики высших растений биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук (compositae@list.ru); 3 Теклева Мария Владимировна - ст. науч. сотр. ПИН РАН, канд. биол. наук ^ек^а@тай. ги); 4 Богданов Анатолий Георгиевич - вед. инженер межкафедральной лаборатории электронной микроскопии биологического
факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (angeor@list.ru).
системе изображение отличалось повышенной четкостью. Потенциал этого изобретения был полностью реализован только после изобретения лазеров, фотоэлектронных умножителей (ФЭУ), ПЗС(ССЭ)-камер, а также компактных быстродействующих компьютеров. В результате был разработан КЛСМ, позволяющий получать многомерные массивы данных, описывающих пространственную структуру микрообъектов, и гибко манипулировать ими.
В большинстве случаев КЛСМ применяют для работы с современными объектами, однако этот метод опробовали и для изучения ископаемых пыльцевых зерен. В опубликованных работах по реконструкции структуры пыльцевых зерен с помощью КЛСМ изображения имеют значительно более высокую четкость, чем фотографии, полученные с помощью обычного просвечивающего светового микроскопа (e.g., Hochuli, Burkhardt, 2013).
Использование КЛСМ для изучения поверхности объектов ограничивает его более слабая, по сравнению с СЭМ, разрешающая способность. В результате поверхность реконструируется слишком упрощенно, а в случае поверхности со скульптурными элементами мельче 0,3 мкм получается ложная картина. Поэтому требуется повторное изучение с помощью СЭМ, а исследование скульптуры поверхности с помощью КЛСМ во многом лишается смысла. При изучении крупных элементов поверхности (например, крупного шипа над порой пыльцевого зерна Wodehouseia spinata; Tekleva et al., 2012) могут оказаться полезными такие возможности КЛСМ, как виртуальный наклон образца на любой угол и помещение виртуального источника света под произвольным углом к объекту. Конфокальный микроскоп, позволяющий виртуально рассматривать с разных сторон палинологические объекты сложной архитектуры, несомненно полезен при их изучении (Теклева и др., 2014; Tekleva et al., 2015; рисунок, А, Б).
Внутреннее строение пыльцевых зерен можно наблюдать на виртуальных срезах. Возможность полностью пройти срезами объект, четко выбрать направление срезов, выполнить срезы одного и того же объекта под разными углами, не разрушая объект, выгодно отличает КЛСМ от ТЭМ, но нивелируется более низкой разрешающей способностью КЛСМ, не позволяющей различить детали ультраструктуры. Более того, сравнение виртуальных срезов КЛСМ и срезов ТЭМ показывает, что реконструкции внутреннего строения, выполненные с помощью только
КЛСМ, могут давать ложные картины (Гаврило-ва и др., 2015).
Тем не менее КЛСМ может быть полезным дополнением к основным инструментам исследования. Например, при первоначальном исследовании пыльцевых зерен из микропиле семян юрских голосеменных оставались сомнения относительно их апертурного типа (2ау1а1оуа й а1., 2016). В СМ пыльцевые зерна выглядели однобороздными, но полной уверенности не было, так как пылинки были наложены друг на друга и на кутикулу, а их общую морфологию в СМ было трудно рассмотреть. На срезах группы пыльцевых зерен в ТЭМ границы разных пыльцевых зерен и ориентация среза по отношению к каждой из пылинок были трудноразличимы. Кроме того, их ультраструктура демонстрировала определенное сходство с некоторыми трехбороздными Eucommiidites. Виртуальные срезы КЛСМ, выполненные через КЛСМ-реконструкцию группы пыльцевых зерен, удалось сориентировать так, чтобы сделать поперечные срезы одной из пылинок на разных уровнях и убедительно показать наличие единственной борозды (2ау1а1оуа й а1., 2016).
КЛСМ полезен при изучении средних и крупных спор и пыльцевых зерен (30-100 мкм). Применение этого метода целесообразно, когда надо определить наличие, характер и протяженность полостей в оболочке (в случае палиноморф со сложным строением оболочки) для дальнейшей правильной ориентировки направления срезов ТЭМ. Однако и здесь могут возникнуть сложности в зависимости от специфики объекта (например, изучение мегаспор Maexisporites, Гаврилова и др., 2015).
Л1гу8оап - модуль конфокального микроскопа, который использует 32-канальный детектор эмиссионного сигнала вместо обычного, точечного. В результате имеется возможность существенно улучшить соотношение сигнал/шум от образца, разрешение и скорость сканирования и подобрать оптимальные значения для этих параметров. Для ископаемых пыльцевых зерен, которые дают более слабую эмиссию, чем современные, удалось получить изображения, сопоставимые по яркости и разрешению с современными образцами (Sivaguru Й а1., 2016).
Метод высокоразрешающей SR-SIM-микро-скопии предусматривает использование высокочастотного структурированного освещения, обеспечивающего разрешение до 85 нм (при возбуждении лазером 488 нм). Структурированное освещение позволяет избавиться от муара,
размывающего изображение, и получить значительно более четкие изображения с высоким разрешением. В сочетании с высокоскоростной камерой сканирования этот метод позволяет получать и обрабатывать изображения значительно быстрее, что снижает нагрузку на красители и образец (Sivaguru et al., 2016).
При опробовании на ископаемом материале оба метода дали хорошие результаты, но принципиально не изменили оценку перспектив конфокальной микроскопии. Применение модулей Airyscan и SR-SIM сулит получение более четких изображений, но не позволяет достичь разрешения электронных микроскопов (СЭМ, ТЭМ). Свойство ископаемого материала слабо воспринимать флуоресцентные красители (и чем древнее образец, тем слабее эмиссия от него) создает дополнительные сложности для высокоразрешающей SR-SIM-микроскопии.
Таким образом, конфокальная микроскопия не может заменить основные электронно-микроскопические методы исследования, но может быть использована как дополнение к ним, а также для решения некоторых специфических задач.
ТЭМ-томография - относительно новый метод. Насколько нам известно, он еще не использовался для изучения ископаемых палинологических объектов. Метод был опробован на пыльцевых зернах современного Ginkgo biloba L. Работы по изучению пыльцевых зерен гинк-го с помощью ТЭМ проводили неоднократно, но описания ультраструктуры инфратектума у разных авторов не совпадали. Каждая интерпретация была подкреплена соответствующими иллюстрациями, где инфратектум был представлен как гранулярный, ячеистый или псевдостолбиковый. Выявление корректного типа ин-фратектума было необходимо для однозначной интерпретации ботанической принадлежности дисперсных ископаемых пыльцевых зерен, возможно принадлежавших гинкговым (Zavialova et al., 2011).
Инфратектум экзины G. biloba был изучен на серии срезов. По изменяющимся от среза к срезу очертаниям индивидуальных структурных элементов был сделан вывод о псевдостолбиковом типе инфратектума. Параллельно с исследованием с помощью традиционного ТЭМ, была выполнена ТЭМ-томография. Полутонкий срез толщиной 250 нм был многократно сфотографирован на аналитическом ТЭМ с ускоряющим напряжением 200 кВ при изменении угла на-
клона в диапазоне от -60° до +60° (с шагом 1°), из этих снимков был сгенерирован суммарный файл (который можно просматривать как видеофильм для предварительной оценки результата), а затем на его основе с помощью специальной программы была построена трехмерная модель. Для томографии был найден участок среза спородермы, который удовлетворял требованиям метода (располагался близко к центру сетки и в средней части ячейки, был более или менее перпендикулярен спородерме и содержал два элемента, которые можно было рассмотреть в объеме, располагался более или менее перпендикулярно оси поворота держателя образца). Результаты подтвердили выводы, сделанные с помощью традиционного ТЭМ. Однако изображения получились неудовлетворительного для публикации качества, что особенно заметно в сравнении с классическими микрографиями ТЭМ. Вполне возможно, что ТЭМ-томография перспективна для изучения ископаемых палинологических объектов. Необходимо дальнейшее совершенствование приборной базы и программного обеспечения, а также отработка методики подготовки объекта исследований.
Метод ТЭМ-томографии в полной мере раскрывает свои возможности на образцах, имеющих хорошую электронную контрастность и закрепленных на углеродных подложках без использования заливочных сред (суспензии биологических макромолекул, агрегаты вирусных частиц и т.п.; Попинако, Соколова, 2012). В этих случаях 3Э-модели получаются четкими при использовании максимально широкого диапазона углов наклона (до ±70° и более). Присутствие заливочной среды (независимо от свойств залитого объекта) сильно снижает электронную прозрачность среза при углах наклона выше 60°, что делает практически невозможной фокусировку. В результате информативность полученных моделей значительно снижается. Если в дальнейшем окажется возможным растворить заливочную среду с сохранением взаимного расположения всех деталей ультраструктуры, ценность метода ТЭМ-томографии для пали-номорфологов значительно повысится. На современном аппаратном и компьютерном уровне 3Э-ТЭМ-реконструкции объектов крупнее кубического микрометра пока никто не публикует.
В последнее время различные томографические методы находят все более широкое применение при изучении мезофоссилий. Основное преимущество этих методов заключается в том,
что исследуемый объект не разрушается. Более того, иногда даже не требуется извлечения палеонтологического остатка из породы. К сожалению, разрешающая способность большинства типов томографов недостаточна для того, чтобы использовать их для изучения палинологических объектов. Исключением, возможно, окажется синхротронная рентгеновская томография (СРТ). Например, с помощью СРТ были изучены соцветия из меловых отложений Франции (Могеаи ^ а1., 2014). В работе впервые достигнута разрешающая способность 50 нм. Для пыльцевых зерен, находящихся в пыльниках, удалось определить размеры, количество борозд, различить сетчатую поверхность экзины, определить ее толщину, различить столбики. Хотя синхротронный рентгеновский томограф далек по разрешающей способности от ТЭМ (таблица), его применение позволило получить основную информацию об общей морфологии пыльцевых зерен и некоторые сведения об ультраструктуре их экзины без разрушения уникального объекта.
ТЭМ дает двухмерные изображения ультраструктуры объекта, на основании которых па-линоморфолог должен корректно реконструировать трехмерную картину внутреннего строения спородермы. Для крупных палинологических объектов, таких как мегаспоры, неплохим подспорьем для выполнения этой задачи оказываются сколы спородермы, изученные с помощью СЭМ (Zavia1ova, Тигпаи, 2012). Хотя СЭМ проигрывает в детальности изображения ТЭМ, и на СЭМ-фотографиях нельзя распознать слишком плотно упакованные структуры и детали, различимые по электронной плотности, на них можно непосредственно (без реконструкций)
рассмотреть объемное устройство спородермы. Комбинированный анализ таких СЭМ- и ТЭМ-изображений одного и того же объекта позволяет получить более корректную реконструкцию (рисунок, В, Г). При изучении сколов ряд обстоятельств затрудняет получение информации. Скол нельзя точно сориентировать. Скол можно наблюдать сбоку, если наклонить столик, но перпендикулярно его поставить невозможно -нельзя выполнить корректные измерения толщины спородермы и отдельных ее слоев, а также получить равномерно освещенные изображения хорошего качества. Несравненно удобнее и информативнее просмотреть в СЭМ серию полутонких срезов толщиной от одного до нескольких микрометров. Такие срезы можно выполнить с помощью ультрамикротома с обычных блоков, подготовленных для ТЭМ, после чего растворить заливочную среду, а срезы перенести на столик СЭМ (Zavia1ova, Karasev, 2017; рисунок, В).
Метод ионного травления давно применяется для пробоподготовки к электронной микроскопии в материаловедении. С широким внедрением в практику СЭМ электронно-ионных (двух-лучевых) приборов его использование стало возможным и для решения некоторых биологических задач. На образце с помощью СЭМ выбирается интересующее исследователя место, в нем ионным лучом протравливается срез, который рассматривается в СЭМ (Po1evova, 2010). Очевидные достоинства метода - контролируемый выбор места для вытравливания (чего нельзя достичь при изготовлении сколов), а также возможность постепенного стравливания части образца для изучения последовательных срезов на массивном объекте. Это последнее свойство используется для построения трехмерных
Сравнение разрешающей способности микроскопов и томографов при изучении биологических
объектов
Метод Разрешающая способность
Традиционная световая микроскопия предельная 0,2 мкм, реальная 1 мкм (=1000 нм)
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 0,2 мкм (= 200 нм)
Синхротронная рентгеновская нанотомография 50 нм
Сканирующая электронная микроскопия с вольфрамовыми термоэмиссионными катодами паспортное разрешение 3 нм, реальное 4-5 нм
с полевыми электронными пушками паспортное разрешение 1 нм, реальное 2-3 нм
Трансмиссионная электронная микроскопия паспортное разрешение 0,3 нм, реальное 1 нм
Скульптура поверхности пыльцевых зерен Pseudointegricorpus clarireticulatum (Samoilovitch) Takahashi из маастрихта Зея-Буреинской впадины: А - СЭМ, Б -КЛСМ; структура спородермы мегаспоры Otynisporites tuberculatus Fuglewicz 1977 из индских отложений Кировской обл.: В - СЭМ, Г - ТЭМ. Масштабные отрезки 10 мкм (А, Б), 5 мкм (В), 1 мкм (Г)
реконструкций по серийным срезам с самым маленьким шагом. Если минимальная толщина ультратомного среза 20 нм, то в случае травления срезы могут быть сколь угодно тонкими. К сожалению, применительно к палеонтологии у метода есть несколько существенных недостатков. Травление ионным лучом - разрушающий метод. После травления не остается материальных срезов, только файлы электронных изображений. Контрастность получаемых срезов сильно зависит от восприимчивости материала к контрастерам. Для ископаемого материала она пока очень низкая (Vi11anueva-Amadoz е1 а1., 2012).
Кроме того, разрешающая способность даже самого современного СЭМ остается более низкой, чем у ТЭМ среднего класса.
Таким образом, существует ряд перспективных методик, которые уже сегодня могут быть успешно использованы для изучения палинологических объектов в дополнение к традиционным методам электронной микроскопии. Тем не менее для изучения палинологических объектов необходима разработка новых методик исследования, не разрушающих объект, и трансмиссионная электронная микроскопия пока остается вне конкуренции.
Публикация подготовлена при поддержке РФФИ, проект № 14-04-00044 для Н.Е. Завьяловой и проект №17-04-01094 для С. В. Полевовой и М.В. Теклевой.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ [REFERENCES]
Гаврилова О.А., Завьялова Н.Е., Теклева М.В., Носова Н.В., Горденко Н.В., Карасев Е.В., Маркевич В.С., Бугдаева Е.В. Морфологические и анатомические исследования остатков ископаемых высших растений с помощью конфокального микроскопа // Мат-лы междунар. конф. «XIII Московское совещание по филогении растений: филогения и морфологическая эволюция. 50 лет без К.И. Мей-ера». 2015. С. 89-93 [Gavrilova O.A., Zav'yalova N.E., Tekleva M.V., Nosova N.V., Gordenko N.V., Karasev E.V., Markevich V.S., Bugdaeva E.V. Mor-fologicheskie i anatomicheskie issledovaniya ostat-kov iskopaemykh vysshikh rastenii s pomoshch'yu konfokal'nogo mikroskopa // Mat-ly mezhdunar. Konf. «XIII Moskovskoe soveshchanie po filogenii rastenii: filogeniya i morfologicheskaya evolyutsiya. 50 let bez K.I. Meiera». 2015. S. 89-93].
Попинако А., Соколова О. Как предсказать неизвестную структуру белка // Природа. 2012. Т. 7. С. 33-38 [Popi-nako A., Sokolova O. Kak predskazat' neizvestnuyu struk-turu belka // Priroda. 2012. T. 7. S. 33-38].
Теклева М.В., Маркевич В.С., Бугдаева Е.В., Сунь Ге, Гаврилова О.А. Строение пыльцевых зерен Pseudointegricorpus clarireticulatum (Samoilo-vitch) Takahashi // Палинологическая школа-конференция с международным участием «Методы палеоэкологических исследований». 2014. С. 88-89 [Tekleva M.V., Markevich VS., Bugdaeva E.V., Sun' Ge, Gavrilova O.A. Stroenie pyl'tsevykh zeren Pseudointeg-ricorpus clarireticulatum (Samoilovitch) Takahashi // Pal-inologicheskaya shkola-konferentsiya s mezhdunarodnym uchastiem «Metody paleoekologicheskikh issledovanii». 2014. S. 88-89].
Hochuli P. A., Feist-Burkhardt S. Angiosperm-like pollen and Afropollis from the Middle Triassic (Anisian) of the Germanic Basin (northern Switzerland) // Frontiers in plant science. 2013. Vol. 4. P. 344.
Moreau J.D., Cloetens P., Gomez B., Daviero-Gomez V., Neraudeau D., Lafford T.A., Tafforeau P. Multiscale 3D virtual dissections of 100-million-year-old flowers using
X-Ray synchrotron micro- and nanotomography // Microscopy and Microanalysis. 2014. Vol. 20. № 01. P. 305-312.
Polevova S. An attempt of ion etching processing for revealing surface structure of modern pollen grains. Abstracts of the 8th European Palaeobotany-Palynology Conference, Budapest, Hungary, 6-10 July 2010. 2010. P. 194.
Sivaguru M., Urban M.A., Fried G., Wesseln C.J., Mander L., Punyasena S.W. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen // Microscopy Research and Technique 2016. Aug 1. doi: 10.1002/jemt.22732.
Tekleva M., Markevich V., Bugdaeva E., Sun Ge, Gavrilova O. Pseudointegricorpus clarireticulatum (Samoilovitch) Takahashi: morphology and ultrastructure // Historical Biology. 2015. P. 1-11.
Tekleva M.V., Markevich VS., Bugdaeva E.V, Sun G. Morphology and ultrastructure of Wodehouseia pollen. Jap. J. Palynology. 2012. Vol. 58 (8 Special Issue). P. 234.
Villanueva-Amadoz U., Benedetti A., Méndez J., Sender L.M., Diez J.B. Focused ion beam nano-sectioning and imaging: a new method in characterisation of palaeopaly-nological remains // Grana. 2012. Vol. 51 P. 1-9.
Zavialova N., Karasev E. The use of the scanning electron microscope (SEM) to reconstruct the ultrastructure of sporoderm // Palynology. 2017. Vol. 41. N 1. P. 89-100.
Zavialova N., Markevich V., Bugdaeva E., Polevova S. The ultrastructure of fossil dispersed monosulcate pollen from the Early Cretaceous of Transbaikalia, Russia // Grana. 2011. Vol. 50. N 3. P. 182-201.
Zavialova N., Nosova N., Gavrilova O. Pollen grains associated with gymnospermous mesofossils from the Jurassic of Uzbekistan // Review of Palaeobotany and Palynology. 2016. Vol. 233. P. 125-145.
Zavialova N., Turnau E. Morphology and wall ultrastructure of some Middle Devonian dispersed megaspores from northern Poland // Review of Palaeobotany and Palynology. 2012. Vol. 171. P. 103-123.
Поступила в редакцию / Received 29.12.2016 Принята к публикации / Accepted 18.06.2017
PROSPECTS OF METHODS FOR STUDIES OF FOSSIL SPORODERMS
N.E. Zavialova1, S.VPolevova2, M.V. Tekleva3, A.G. Bogdanov*
Although transmission electron microscopy has remained the best tool to study the ultrastructure of fossil pollen and spores, other methods also might be useful, such as confocal laser scanning microscopy (including Airyscan and SR-SIM), TEM-tomography, X-Ray synchrotron tomography, and scanning electron microscopy (including observations of semithin sections and ion etching). Currently, non-destructive methods are obviously wanted as well as more elaborated methods to reconstruct a three-dimensional inner morphology of studied objects.
Key words: TEM, TEM-tomography, CLSM, X-Ray synchrotron tomography, SEM, ultrastructure, fossil spores and pollen.
Acknowledgement. The study was performed with financial support of Russian Foundation for Basic Research, project № 14-04-00044 for N.Zavialova and project №17-04-01094 for S. Polevova and M. Tekleva.
1 Zavialova Natalia E., Laboratory of paleobotany, A.A. Borissiak Paleontological Institute of the Russian Academy of Sciences (PIN RAS) (zavial@paleo.ru); 2 Polevova Svetlana V., Department of higher plants, Biological Faculty, M.B. Lomonosov Moscow State University (compositae@list.ru); 3 Tekleva Maria V., PIN RAS (tekleva@mail.ru); 4 Bogdanov Anatoly G., Laboratory of electron microscopy, Biological Faculty, M.B. Lomonosov Moscow State University (angeor@list.ru).
