CC BY
11
УДК: 581.3 581.331.2
ТЕМПЫ РАЗВИТИЯ СПОРОДЕРМЫ У ARISTOLOCHIA CLEMATITIS L. И ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS KOM.
С.В. Полевова1
Два вида кирказона отличаются по типу микроспорогенеза и по времени формирования апертур в процессе развития спородермы. Aristolochia clematitis L. проходит мейоз по сукцессионному типу и формирует апертуру на самом последнем этапе формирования спородермы, при созревании интины. A. manshuriensis Kom. имеет симультанный микроспорогенез и начинает формировать апертурные области на средней тетрадной стадии, но эндэкзина и интина формируются без апертурных областей. Сильное растягивание процесса формирования интины на последних этапах развития позволяет пыльцевым зернам A. clematitis сформировать апертуру, которая изначально не закладывалась. У более «медлительных» на ранних этапах, вплоть до стадии инициации интины, пыльцевых зерен A. manshuriensis не хватает времени сформировать какие-либо апертуры при построении эндэкзины и интины, и от их заложения на ранних этапах остаются только следы в виде сквозных щелей в эктэкзине.
Ключевые слова: Aristolochia clematitis, Aristolochia manshuriensis, пыльцевое зерно, апертура, развитие спородермы, длительность стадий развития спородермы.
Кирказон (Aristolochia L.) - крупный род семейства (Aristolochiaceae), входящего в одну из групп базальных цветковых - перечноцветных (Stevens, 2001). В роде Aristolochia описаны более 400 видов, распространенных от умеренных широт до тропиков обоих полушарий. В основном это деревянистые лианы, реже травы и кустарники. Зигоморфные цветки в виде кувшинчиков содержат гиностегий и опыляются мухами (Nakonechnaya et al., 2008). Морфологические признаки и плоидность, проанализированные и сопоставленные с молекулярными маркерами, показали хорошее совпадение на уровне подро-дов и триб (Ohi-Toma et al., 2006). Выбранные для изученния виды Aristolochia clematitis L. и A. manshuriensis Kom. относятся к разным под-родам, однако их пыльцевые зерна описываются очень сходным образом как довольно крупные, сфероидальные, безапертурные с бугорчатой поверхностью (Erdtman, 1952).
Два вида кирказона отличаются по типу мейо-за и по времени формирования апертур в сценарии развития спородермы. A. clematitis проходит мейоз по сукцессионному типу и формирует апертуру на самом последнем этапе формирования спородермы, при созревании интины (Gonzalez et al., 2001, Polevova, 2015). A. manshuriensis имеет симультанный микроспорогенез и начинает фор-
мировать апертурные области на средней тетрадной стадии, но уже при формировании эндэкзины в ней не выявляется никаких участков, которые можно было бы интерпретировать как апертурные. В дальнейшем формирование спородермы происходит точно так же, как у A. clematitis (Полевова, 2015). Все попытки обнаружить у A. manshuriensis спородерму зрелого типа, сходную с A. dematitis, не увенчались успехом. В литературе имеются сведения об ультраструктуре спородермы еще двух видов: A. fimbriata (Furness et al., 2002) и A. arborea (Halbritter et al., 2017). Оба вида характеризуются как безапертурные и на опубликованных микрографиях эндэкзина выглядит ламеллятной, как и в случае A. manshuriensis. Представляется интересным оценить темпы формирования сходных стадий развития спородермы у двух видов кирказона.
Материалы и методы
Бутоны A. clematitis на разных стадиях развития были отобраны в ботаническом саду МГУ 26 мая 2011 г., 19 мая 2012 г. и 27 мая 2014 г. Бутоны A. manshuriensis были собраны в ботаническом саду МГУ 19 мая 2012 г., 29 мая 2014 г. и 2 июня 2015 г. Один образец A. manshuriensis получен из Ботанического сада-института ДВО РАН во Владивостоке, собран 3 июня 2015 г.
1 Полевова Светлана Вячеславовна - вед. науч. сотр. кафедры морфологии и систематики высших растений биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, канд. биол. наук ([email protected]).
И.М. Кошелевой. Бутоны отбирались по размерам от самых маленьких, где можно было видеть тетрады микроспор на давленных препаратах при световой микроскопии, до увядавших цветков, где невооруженным глазом были видны многочисленные пыльцевые трубки в открывшихся теках пыльников. Всего у A. clematitis изучено 49 бутонов, а у A. manshuriensis - 68. Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) из бутонов выделяли гиностегии и фиксировали 2,5%-м глутаровым альдегидом на какодилатном буфере (pH 7,2) в течение 8 ч при 4 °C. Затем образцы дополнительно фиксировали 1%-м осмиевым фиксатором 2 ч при комнатной температуре, обезвоживали через серию спиртов и ацетона и заключали в смесь эпоновых смол (Миронов и др., 1994). С эпоновых блоков делали ультратонкие срезы на ультратоме «UC-5 Ultracut-R» («Leica Microsystems»), которые изучали на трансмиссионном электронном микроскопе «JEM-1011 TEM» («JEOL», Япония) при 80 кВ камерой «CCD GATAN ES500W» под управлением «Digital Micrograph GATAN» в общефакультетской лаборатории электронной микроскопии биологического факультета МГУ. При описаниях использовали терминологию Hesse et al. (2009).
При наличии большого числа бутонов на растениях в куртине материал отбирали в один прием. Сначала оценивали размер бутонов, в которых на давленных препаратах при световой микроскопии можно было различить тетрады микроспор, заключенные в каллозную оболочку. Считая этот размер наименьшим, с нескольких растений отбирали ряд бутонов, размеры которых постепенно увеличивались вплоть до увядающих цветков. Такой способ отбора проб предполагает уникальность стадии развития каждого бутона и их упорядоченность по мере развития микропоры и ее оболочки. В реальности размер бутона не строго коррелирует с определенной стадией микроспо-рогенеза (например, из-за различий в мощности материнских растений). Для уменьшения ошибок в интерпретации степени развития микроспор проводили ранжирование бутонов по стадиям развития, выделенным на качественном уровне. Количественные признаки (количество ламмелл эндэкзины, толщина эндэкзины и интины) оценивали на качественном уровне. Выделенные стадии развития микроспор и их оболочек были хорошо согласованы с традиционно выделяемыми и характеризовали не единственный бутон, а несколько бутонов, которые соответствовали стадии на качественном уровне. Например, утолщение интины можно было бы определять тол-
щиной в микрометрах, однако существует большая вероятность ошибки из-за случайной, иногда косой, ориентации срезов. В результате большое число бутонов, в которых пыльцевые зерна формировали интину, были отнесены к одной из четырех стадий развития (инициация интины, мало интины, много интины и расслоение интины). Поскольку стадии для обоих видов оценивались по одним и тем же критериям, а относительное число бутонов на этих стадиях у двух видов отличалось, можно предположить, что чем больше бутонов отнесено к данной стадии, тем больше ее продолжительность и доступность для сбора проб. Стремительное прохождение каких-либо процессов уменьшает вероятность их попадания в выборку. Так, картины мейоза присутствовали в исследуемом материале по обоим видам, а митоза не удалось обнаружить ни у одного образца. Логично заключить, что мейоз занимает гораздо больше времени, чем митоз, о чем свидетелвуют прямые наблюдения (Bennett et al., 1977). При изучении методом ТЭМ для всех бутонов были определены стадии развития спородермы и подсчитано для каждого вида процентное содержание бутонов на той или иной стадии относительно их общего числа.
Результаты
Формирование микроспор начинается с мейоза (рис. 1). Мейоз у A. manshuriensis проходит примерно за то же время, что и у A. clematitis (3 и 4% бутонов соответственно). Однако после мейо-за A. manshuriensis довольно долго сохраняет ровную плазмалемму (6% бутонов), в то время как A. clematitis проходит мейоз постепенно, и только в течение последовательных стадий мейоза плаз-малемма становится ровной, без инвагинаций.
Следующая стадия характеризуется сильно волнистой плазмалеммой. Эта стадия у обоих видов также близка по длительности (по 4%), однако у A. manshuriensis под каллозной оболочкой элементов примэкзины еще не наблюдается, а апертурные области уже выявляются как места с ровной плазмалеммой, которую подстилают цистерны эндоплазматического ретикулу-ма. У A. clematitis вся плазмалемма как будто вскипает, и в прогибах видна примэкзина в виде темных гранул, окруженных серым матриксом.
Следующая хорошо отличимая стадия характеризуется протостолбиками в примэкзине. У обоих видов она сравнима по длительности (1 и 2%) и облику с той лишь разницей, что у A. manshuriensis хорошо видны ровные участки голой плазмалеммы - апертурные области.
Схема строения оболочки Номер стадии Признаки стадий Относительное количество бутонов, %
A. clematitis A. manshuriensis
.................. 1 ровная плазмалемма молодых микроспор 4 6
ШШШУЯУ?*/ 2 плазмалемма волнистая, гранулы примэкзины 4 4
г т т т т т т 3 протостолбики и протопокров 2 7
4 первая ламелла эндэкзины 4 6
5 мало эндэкзины 2 6
ттшш 6 много эндэкзины 2 10
тттт 7 инициация интины 18 19
Г...Х..Х.Х.Х.Х..1 01)00 1)0(10 000000()000000 ооооооооооо 0 OIJOOOUOOO 8 мало интины 24 19
Ш11М 9 много интины 22 12
г Т тТТ X T 0000 НОО 0 000000000000"0 ООООООООООО 0 0(10001)000 10 расслоение интины 14 9
Рис. 1. Схема стадий развития спородермы у двух видов кирказона и относительное количество бутонов на каждой
стадии
На следующем этапе протостолбики соединены протопокровом. Такая стадия была выявлена только у А. шаткиг1вт18 (6%). Вероятно, у А. cleшatitis протопокров формируется стремительно.
В конце тетрадного периода основания столбиков соединяются первой ламеллой с белой линией. Эту ламеллу принято интерпретировать как инициацию подстилающего слоя и эндэкзины. На этой стадии А. шanshuriensis пребывает дольше А. cleшatitis (6 и 4% соответственно). Возможно, это связано с формированием апертурных участков у А. шanshuriensis, так как в них помимо первой ламеллы с белой линией выявляются элементы покрова.
Постепенно ламеллы эндэкзины подстраиваются изнутри. Пока их мало (до четырех) и между ними не выявляются гранулярные прослои. У А. шanshuriensis это стадия длиннее, чем у А. cleшatitis (6 и 2% соответственно), что, вероятно, связано с формированием у А. шanshuriensis апертурной пробки. В этот момент каллозная оболочка растворяется, и начинается свободно-споровый период.
Когда ламелл эндэкзины становится шесть-восемь, между ними становятся хорошо заметны гранулярные прослои. А. шanshuriensis проходит эту стадию дольше А. cleшatitis (10 и 2% соответственно). На этом этапе апертурные области А. шanshuriensis выявляются в наружных слоях спородермы, в эктэкзине и наружных ла-меллах эндэкзины, но внутренние области эн-дэкзины совершенно одинаковы по всему периметру микроспоры.
Появление интины под эндэкзиной, связанное с небольшими инвагинациями плазмалеммы, у обоих видов проходит однотипно и с одинаковой интенсивностью (19 и 18% соответственно). У обоих видов при этом не удалось заметить первого митоза, который часто сопровождает инициацию интины. Формирование интины продолжается выпячиванием плазмалеммы в виде трубчатых структур, и здесь А. шanshuriensis начинает «отставать» от А. cleшatitis (19 и 24% соответственно). Стадия, когда трубчатая интина сравнима или толще экзины, также характеризуется меньшей длительностью у А. шanshuriensis в сравнении с А. cleшatitis (12 и 22% соответственно). Затем происходит расслоение интины на наружную трубчатую и внутреннюю светлую, гомогенную части. В случае А. шanshuriensis эта стадия встречается у 9% всех изученных цветков, а в случае А. cleшatitis - у 14%.
Зрелая спородерма характеризуется столбиковой эктэкзиной с прерывистым покровом и тонким подстилающим слоем, тонкой, гомогенной электронно-плотной эндэкзиной и двухслойной интиной. Такая ультраструктура спородермы выявлена только у A. clematitis и была отмечена у 2% цветков. В таких цветках пыльцевые зерна уже имели пыльцевые трубки, что было заметно при первичном осмотре гиностегиев с помощью лупы. Для A. manshuriensis спородерма с тонкой гомогенной эндэкзиной и неравномерно утолщенной интиной, выпирающей из интактной эк-зины, не обнаружена ни у культивируемых растений в ботаническом саду МГУ в Москве и ботаническом саду во Владивостоке, ни у близкого видаA. macrophylla Lam., также культивируемого в ботаническом саду в Москве, ни на гербарных экземплярах A. manshuriensis и A. macrophylla (несмотря на наличие у обоих видов пыльцевых зерен с пыльцевыми трубками, хорошо заметными в лупу). Изучение таких проросших пыльцевых зерен на срезах ТЭМ показало, что все пыльцевые трубки, одетые интактной, двухслойной интиной, выходили через трещины в экзине. Экзина при этом была на стадии шести-восьми слоев чередующихся ламелл и гранул эндэкзины. Растения из ботанического сада МГУ регулярно завязывают много плодов, однако семена в них невсхожие. Возможно, это происходит по причине мужской стерильности, связанной с недоразвитием мужского гаметофита, которая маркируется не прошедшим до конца формированием эндэкзины, и/или проблемами с перекрестным опылением и невозможностью самоопыления. Однако в последнем случае незрелость эндэкзины остается необъясненной.
Анализ длительности последовательных фаз развития спородермы как функции доли бутонов на данной стадии от общего числа проанализированных бутонов (рис. 2), показывает, что первая стадия (мейоз и молодые микроспоры с ровной плазмалеммой) длится дольше, чем последующие стадии построения примэкзины, вплоть до формирования первой ламеллы с белой линией. После растворения каллозы самым длительным становится процесс формирования интины. Это хорошо согласуется с относительной толщиной слоев спородермы. Именно интина является самым толстым слоем в оболочке. Все тетрадные стадии и первые стадии посттетрадного периода у A. clematitis протекают заметно быстрее, чем у A. manshuriensis несмотря на то, что для A. clematitis характерен сукцессивный микро-
Рис. 2. Гистограмма распределения относительной длительности стадий развития спородермы двух видов кирказона (процент количества бутонов на данной стадии от общего числа бутонов) Стадии развития спородермы. Тетрадный период: 1 - мейоз и ровная плазмалемма молодых микроспор; 2 - плазмалемма вскипает, появляются гранулы примэкзины; 3 - выявляются протостолбики и протопокров; 4 - появляется первая ламелла эндэкзины. Посттетрадный период: 5 - мало ламелл эндэкзины; 6 - много ламелл и гранул эндэкзины; 7 - плазмалемма вскипает, инициация интины; 8 - мало интины; 9 - много интины; 10 - расслоение интины
спорогенез, который логичнее было бы считать более длительным процессом, чем симультанный, характерный для A. manshuriensis. Для A. manshuriensis характерно замирание процесса формирования примэкзины сразу после мейоза на стадии ровной плазмалеммы. Вплоть до инициации интины уже в посттетрадном периоде процессы построения спородермы у A. manshuriensis происходят медленнее, чем у A. clematitis за исключением формирования интины. Интина развивается у A. clematitis значительно медленнее, чем у A. manshuriensis, но зато доходит до кон -
ца (до формирования апертуры). Таким образом, замедление формирования спородермы на последних этапах позволяет пыльцевым зернам A. clematitis сформировать апертуру, которая изначально не закладывалась. У более «медлительных», вплоть до инициации интины, пыльцевых зерен A. manshuriensis не хватает времени сформировать какие-либо апертуры. От них остаются только следы в виде глубоких щелей в эктэкзине, при этом эндэкзина и интина остаются однотипными и толстыми по всему периметру пыльцево-
го зерна.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-50-00029
(«Растения»)).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ [REFERENCES]
Миронов А.А., Комисарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб., 1994. 400 с. [Mironov A.A., Komisarchik Ya.Yu., Mironov V.A. Metody elektronnoi mikroskopii v biologii i meditsine. SPb. Nauka. 1994. 400 s.].
Полевова С. В. Пыльца двух видов кирказона: сходство и отличия на разных стадиях развития // «Палеоботаника и эволюция растений», Конференция, посвященная 80-летию со дня рождения Сергея Викторовича Мейена (1935-1987) Москва, Главный ботанический сад РАН, 15-16 декабря 2015 г. [Polevova S.V. Pyl'tsa dvukh vidov kirkazona: skhodstvo i otlichiya na raznykh stadiyakh razvitiya // «Paleobotanika i evolyutsiya ras-tenii», Konferentsiya, posvyashchennaya 80-letiyu so
dnya rozhdeniya Sergeya Viktorovicha Meiena (1935— 1987) Moskva, Glavnyi botanicheskii sad RAN, 15-16 dekabrya 2015 g.].
BennettM.D., Lewis K.R., HarberdD.J. The time and duration of meiosis // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1977. Vol.277. N 955. P. 201-226.
Erdtman G. Pollen morphology and plant taxonomy-angio-sperms. Stockholm. 1952.
Hesse M., Halbritter H., Zetter R., Weber M., Buchner R., Frosch-Radivo A., Ulrich S. Pollen Terminology. An Illustrated Handbook. Wien, 2009. 261 р.
Gonzalez F., Rudall P.J., Furness C.A. Microsporogenesis and systematic of Aristolochiaceae // Bot. J. Linn. Soc. 2001. Vol. 137. P. 221-242.
Ohi-Toma T., Sugawara T., Murata H., Wanke S., Neinhuis C., Murata J. Molecular phylogeny of Aristolochia sensu lato (Aristolochiaceae) based on sequences of rbcL, matK, and phyA genes, with special reference to differentiation of chromosome numbers // Systematic Botany. 2006. Vol. 31. N 3. P. 481-492. Polevova S.V Ultrastructure and development of sporoderm in Aristolochia clematitis (Aristolochiaceae) // Review of Palaeobotany and Palynology. 2015. Vol. 222. P. 104-115. Stevens P.F. (2001 onwards). Angiosperm Phylogeny Website. Version 12, July 2012 [and more or less continuously updated since]." http://www.mobot.org/MOBOT/ research/APweb/.
Поступила в редакцию / Received 22.12.2016 Принята к публикации / Accepted 18.06.2017
COMPARISON OF THE TIMING OF SPORODERM DEVELOPMENT IN ARISTOLOCHIA CLEMATITIS AND ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS
S.V Polevova1
Two Aristolochia species are distinguished by microsporogenesis types and time of aperture initiation in the sporoderm development. A. clematitis has successive meiosis and forms an aperture in the late free microspore stage when the intine is maturing. A. manshuriensis has simultaneous microsporogenesis and forms aperture regions in the middle tetrad stage. However, the endexine and intine develop uniformly all over the pollen grain without any differences indicating aperture regions. Strong slowing of intine development at the end of pollen ontogeny allows pollen of A. clematitis to have an aperture which had not been formed at first. Pollen grains of A. manshuriensis, which are tardy up to the stage of intine initiation, do not have enough time to form any aperture in last stages of endexine and intine development. Only deep cracks in the ectexine weakly remind of apertures in A. manshuriensis.
Key words: Aristolochia clematitis, Aristolochia manshuriensis, pollen grains, sporoderm development, timeline sporoderm development.
Acknowledgement. The study was performed with financial support of Russian Science Foundation, project 14-50-00029 «Scientific basis of the national biobank - depository of the living systems» (branch «Plants»).
1 Polevova Svetlana V., Morphology and Taxonomy of Higher Plant Department of Biology Faculty, Lomonosov Moscow State University; [email protected].
Halbritter H., Weber M., Buchner R., Schneider H. Aristolochia arborea / PalDat (2016-11-03) - a palyno-logical database. Published on the Internet https://www. paldat.org/pub/Aristolochia_arborea/301871 [accessed 2017-02-11].
Nakonechnaya O.V., Sidorenko VS., Koren'O.G., Nesterova S.V, Zhuravlev Yu.N. Specific features of pollination in the Manchurian birthwort, Aristolochia manshuriensis //Biology Bulletin. 2008. Vol. 35. N 5. P. 459-465.
Neinhuis C., Wanke S., Hilu K.W., Muller K., Borsch T. 2005. Phylogeny of Aristolochiaceae based on parsimony, likelihood, and Bayesian analyses of trnL-trnF sequences // lant Syst. Evol. Vol. 250. P. 7-26.
