Применение 4-метилстеринов для обнаружения добавок растительных жиров в молочном жире Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК 541.18.05/.052:547.67

ПРИМЕНЕНИЕ 4-МЕТИЛСТЕРИНОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДОБАВОК РАСТИТЕЛЬНЫХ ЖИРОВ В МОЛОЧНОМ ЖИРЕ

© 2015 А. В. Карташева1 , С. А. Ефанов2 , Е. В. Грехнева3, И. Б. Кометиани4

1 магистрант каф. химии e-mail: exotdel@kursktelecom. ru

Курский государственный университет

2 начальник экспертно-исследовательского отдела №1 e-mail: [email protected]

Филиал ЭКС ЦЭКТУ

3 канд. хим. наук, доцент каф. химии e-mail: grekhnyovaev@yandex. ru 4 канд. биол. наук, зав. каф. химии e-mail: grekhnyovaev@yandex. ru

Курский государственный университет

Для идентификации добавок растительных жиров в молочном жире использованы сведения о различиях в механизме биосинтеза растительных и животных стеринов. Методом тонкослойной хроматографии на силикагеле предложена возможность обнаружения зоны 4-метилстеринов, в которой посредством газовой хромато-масс-спектрометрии идентифицирован цитростадиенол, являющийся промежуточным продуктом биосинтеза растительных стеринов.

Ключевые слова: газовая хромато-масс-спектрометрия, тонкослойная хроматография, стерины, цитростадиенол.

Молочный жир является одним из основных компонентов, определяющих пищевую ценность молока и молочных продуктов. Из всех природных жиров молочный жир по химическому составу является самым сложным и уникальным.

Качественный и количественный состав основных жирных кислот, входящих в состав глицеридов молочного жира, достаточно изучен и служит одним из критериев при оценке его подлинности, закрепленным на уровне ГОСТ Р 52253-2004 «Масло и паста масляная из коровьего молока. Общие технические условия». Поскольку известно, что молочный жир, несмотря на свой относительно постоянный состав, имеет особенность изменяться в зависимости от времени года, используемых кормов, географических особенностей местности, породы коров, незначительные отклонения от установленных в данном стандарте диапазонов требуют дополнительной проверки другими методиками.

Одной из них является методика, изложенная в ГОСТ 31979-2012 «Молоко и молочные продукты. Метод обнаружения растительных жиров в жировой фазе газожидкостной хроматографией стеринов», которая позволяет выявлять добавку растительных жиров по наличию растительных стеринов, извлечение которых основано на процедуре осаждения в виде дигитонинов. Основной проблемой при использовании данного стандарта является высокая стоимость дигитонина, в связи с чем он не нашел широкого применения.

Одной из возможных альтернатив в данном случае может быть использование газовой хромато-масс-спектрометрии после предварительной пробоподготовки исследуемого жира омылением со спиртовым раствором щелочи [Карташева и др. 2014].

В литературе описано применение тонкослойной хроматографии для обнаружения и идентификации стеринов. Наиболее простым ее вариантом является использование пластин с силикагелем. В частности, описано разделение неомыляемых веществ рафинированного растительного масла в системе гексан : диэтиловый эфир (7:3). В данном варианте можно идентифицировать три зоны, образованные 4-дезметилстеринами, 4-метилстеринами, 4,4-диметилстеринами, которые располагаются в соответствии с уменьшением их полярности. Последние две группы стеринов служат в биологических объектах, как правило, «сырьем» для синтеза 4-дезметилстеринов [Abidi 2001].

В методике, изложенной в ISO 12228, предлагается использовать гексан:диэтиловый эфир (1:1) как элюент, позволяющий разделить Д7 стеролы, Д5 стеролы, метилстеролы, и тритерпены.

Вместе с тем исследование механизма биосинтеза стеринов у животных, растений и грибов показывает, что преобразование 4,4-диметилстеринов в 4-дезметилстерины у растений происходит через стадию образования 4-метилстеринов, в то время как при биохимических превращениях у грибов и животных 4-метилстерины не образуются [Leo 2012]. Таким образом, выявление зоны 4-метилстеринов на хроматограмме может служить маркером для выявления добавки растительного жира в молочный жир.

В результате исследования жирнокислотного состава образцов сливочного масла, реализуемого в розничной торговой сети на предмет наличия жиров немолочного происхождения по ГОСТ Р 52253-2004 для исследования были выбраны продукты, реализуемые как масло сливочное, но с имеющим место отклонением от жирнокислотного состава с массовой долей молочного жира 22,9 (объект № 1) и 66,5 % (объект № 2), и сливочное масло, удовлетворяющее требованиям ГОСТ Р 52253-2004 (объект № 3) в части жирнокислотного состава. Дополнительно исследовалось растительное масло (объект № 4).

Извлечение неомыляемых веществ объектов № 1, 2, 3 проводили при помощи щелочного гидролиза с использованием спиртового раствора гидроксида калия с концентрацией 1 моль/л. Для анализа брали навеску массой около 10 г. В колбу с навеской вносили 50 см3 раствора щелочи и кипятили с обратным холодильником 1 час, охлаждали, добавляли 100 см3 дистиллированной воды и экстрагировали в делительной воронке неомыляемые вещества гексаном (трижды по 50 см3). Гексановый экстракт упаривали до 1 мл. Для растительного масла (образец № 4) использовали пробоподготовку с дигитонином по ГОСТ 31979-2012.

Разделение стеринов осуществляли на пластинах для тонкослойной хроматографии с алюминиевой подложкой, покрытых слоем силикагеля марки Silica gel 60 F254 (MERCK) без предварительной активации в системе растворителей гексан:диэтиловый эфир (1:1).

В качестве проявителя использовали раствор хлорного железа. 50 мг ЕеС1з6Н2О растворяли в 90 мл воды, прибавляли 5 мл ледяной уксусной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты. Через 2-3 мин. полученную хроматограмму нагревали до 100°С. Стерины при такой обработке дают пятна розово-сиреневого цвета [Кейтс 1975].

Исследование состава хроматографических зон проводили методом хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС) с использованием газового хроматографа Agilent 6850 c масс-селективным детектором Agilent 5975С в следующем режиме: колонка -

Карташева А. В., Ефанов С. А., Грехнева Е. В., Кометиани И. Б. Применение 4-метилстеринов для обнаружения добавок растительных жиров

в молочном жире

кварцевая капиллярная НР -5MS; температура колонки: начальная 100 0С, подъем до 280 0С, со скоростью 15 град/мин, выдержка 40 минут; температура интерфейса 290 С; температура инжектора 290 0С; газ-носитель - гелий; постоянный расход газа через колонку 1,0 мл/мин.

Запись хроматограмм и регистрацию масс-спектров проводили в режиме по полному ионному току в диапазоне масс 50-450 атомных единиц. Идентификацию веществ осуществляли путем прямого сравнения спектров, зарегистрированных в вершинах хроматографических пиков, с библиотечными масс-спектрами и с учетом информационно-справочной таблицы ISO 12228.

Для исследования состава хроматографических зон неомыляемых веществ объектов № 1, 2, 3, экстракты, содержащие неомыляемые вещества, наносили в виде тонкой линии на стартовую линию пластины Sorbfil ПТСХ-П-А. По причине недостаточной толщины слоя сорбента на имеющихся пластинах использовали 3-4 пластины с целью получения нужного количества идентифицируемых веществ. Нахождение положения пятен на пластинах велось с использованием значения величин Rf, определенных после проявления.

Десорбцию идентифицируемых веществ проводили по методике, изложенной в ISO 12228.

В результате исследования неомыляемых веществ объектов, полученных после омыления со спиртовым раствором щелочи, а также стеринов растительного масла, полученных осаждением дигитонином, тонкослойной хроматографией на силикагеле обнаружены от одного до четырех хроматографических зон (пятен). Наличие зоны с соответствующим значением величины Rf*10 для каждого объекта представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты исследования анализируемых веществ методом тонкослойной хроматографии

Объект, № Зоны на хроматограммах в порядке возрастания Rf*10

1,6 2,0 2,7 3,4

1 - + + +

2 + + + +

3 + + - +

4 + + + -

Как видно из таблицы, в продуктах, реализуемых как масло сливочное, но с имеющим место отклонением в жирнокислотном составе от молочного жира (объекты № 1, 2), а также в растительном масле (объект № 4) присутствует зона с Ш*10 2,7, которая не обнаруживается в образце сливочного масла (объект № 3).

Соединения, идентифицированные методом газовой хромато-масс-спектрометрии и располагающиеся на месте хроматографических зон объектов № 2, 3, приведены в таблице 2. Исследование первой и второй зоны проводилось совместно по причине близкого расположения на хроматограмме. Полученные хроматограммы приведены на рисунках 1, 2.

Таблица 2

Результаты исследования хроматографических зон объектов № 2 и № 3 методом газовой хромато-масс-спектрометрии

Rf*10 Группа соединений № Время выхода, мин Идентифицированные соединения

Объект №2 Объект №3

1,6 4,4-дезметилстерины 1 19,2 Холестерин Холестерин

2,0 2 21,4 Кампастерин

3 22,1 Стигмастерин

4 23,5 ß-ситостерин

2,7 4-метилстерины 5 27,5 Цитростадиенол Не обнаружено

3,4 4,4-диметилстерины 6 24,0 Ланостерин Ланостерин

7 24,0 Циклоартенол

~СЗ -ЖЖ.—Ж

2 3

4

■еде -si ггх гзс

го: го:

HD НО

L

тт

:tc ■ " ZZ V'J: ■ 'i'f ":Ltf 'i-f itf"

а б

Рис 1. Хроматограммы экстрактов хроматографическтих зон (пятен): (а) зон с И^Ш 1,6 и 2,0 объекта №2, (б) зон с 1,6 и 2,0 объекта №3.

зле

• з:о: ■ ?:о: ют

2Ж

та: мш

2Ж

U

1DDD тао *I «О Ш II 2U0 EI ы ш

6,7

■и«»*, »ийти,»,. ц»

э: :■!■: • эх х :о: - эх

■ ш

■ п эх

х :.:.: Z эх

ТС -+ХЕГ&Ш D И1Ч

6

тики

XX ZO XX XX ex

б

Рис 2. Хроматограммы экстрактов хроматографическтих зон (пятен): (а) зоны с И^Ш 2,7 объекта №2, (б) зоны с И^Ш 3,4 объекта №2, (в) зоны с И^Ш 3,4 объекта № 3

Для уточнения времени выхода были исследованы стерины, выделенные из растительного масла пробоподготовкой с дигитонином. Время выхода стеринов, обнаруженных в растительном масле и их идентификация приведены в таблице 3, хроматограмма - на рисунке 3.

5

а

в

Карташева А. В., Ефанов С. А., Грехнева Е. В., Кометиани И. Б. Применение 4-метилстеринов для обнаружения добавок растительных жиров

в молочном жире

Таблица 3

Время выхода стеринов выделенных из растительного масла

№ Время выхода, мин. Стерины

1 21,4 кампастерин 24-метил холест-5-ен-3ß-ол

2 22,1 стигмастерин 24-этил холеста-5,22-диен-3ß-ол

3 23,5 ß-ситостерин 24-этил холест-5-ен-3ß-ол

4 23,9 Д5 авеностерин 24(28)-этилиден холест-5-ен-3ß-ол

5 25,0 Д7 стигмастенол 24-этил холест-7-ен-3ß-ол

6 25,5 Д7 авеностерин 24(28)-этилиден холест-7-ен-3ß-ол

7 27,5 цитростадиенол 4-метилстигма-7,24(28)-диен-3-ол

1SCTXED-

"1« ■ ■ ■ 1ТП,

лА

э'со^ ' ¿dap ' ii'ob ' SCD^ ' Эсо^

Рис. 3. Хроматограмма растительного масла

3

1

2

7

Таким образом, характерной чертой исследованных объектов, в состав которых входили как растительные, так и животные жиры, является наличие хроматографической зоны с Ш*10, равной 2,7, в составе которой идентифицирован 4-метилстерин -цитростадиенол, являющийся промежуточным продуктом биосинтеза ситостерола и стигмастерола из циклоартенола путем поэтапного удаления двух метильных групп при С4. Данный факт позволяет использовать наличие зоны 4-метилстеринов на пластине с силикагелем в качестве маркера, при исследовании сливочного масла на предмет фальсификации жирами растительного происхождения.

Библиографический список

Abidi S.L. Chromatographic analysis of plant sterols in foods and vegetable oils // J. Chromatogr. A. 2001. 935. P. 173-201 (Elsevier).

Leo M. L. Handbook of Analysis of Active Compounds in Functional Foods / ed. by: Leo M. L. Nollet, Fidel Toldra- CRC Press, 2012.

ISO 12228 «Animal and vegetable fats and oils - Determination of individual and total sterols contents - Gas chromatographic method».

ГОСТ 31979-2012 «Жир молочный. Метод обнаружения растительных жиров газожидкостной хроматографией стеринов».

ГОСТ Р 52253-2004 «Масло и паста масляная из коровьего молока. Общие технические условия».

Карташева А. В., Ефанов С. А, Грехнева А. В., Кометиани И. Б. Исследование стеринов сливочного масла и спреда методом хромато-масс-спектрометрии // Auditorium: электронный научный журнал Курского государственного университета. 2014. №3. URL: auditorium.kursksu.ru/pdf/003-002.pdf (дата обращения: 14.03.2015).

Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов / пер. с англ. докт. хим наук В.А. Вернера. М.: МИР, 1975.