CC BY
10PRIESTIA MEGATERIUM VA PANTOEA AGGLOMERANS SHTAMMLARINING
HUJAYRA SONING KO'PAYISHI 1Jalolova Bahora Shuhrat Qizi, 2Turayeva Bahora Ismoilovna, 3Go"zal Jumaniyozovna Qutliyeva, 4Davranov Qahramon Davranovich
1O'zMU Biologiya fakulteti II- bosqich tayanch doktoranti
2O'zRFA Mikrobiologiya instituti katta ilmiy xodimi 3OzRFA Mikrobiologiya instituti katta ilmiy xodimi, b.fn 4O'zRFA Mikrobiologiya instituti b.fd., proff https://doi.org/10.5281/zenodo. 8372881
Annotatsiya. Ushbu tadqiqotda bakterial suspenziyalarning ma'lum soatlar oralig'ida ozuqa muhitiga moslashishi va ko'payishi asos qilib olingan. Priestia megaterium va Pantoea agglomerans bakteriya shtammlarining 3 kunda bir xil vaktda 3 soat oralig'ida hujayra hosil qiluvchi birligi aniqlandi. Bakteriya shtammmlari kartoshka dekstrozali ozuqa muhitining uglevod manbai o'zgartirilgan dekstroza o'rniga melassadan foydalanilgan. Bakteriya shtammlari uchun kartoshka mellassali optimal ozuqa muhiti yaratilgan va ularning hujayra hosil qiluvchi birligi aniqlangan. 3-kunga kelib Priestia megaterium bakteriya shtammi 2.028 mlrd va Pantoea agglomerans bakteriya stammining 2.240 mlrd hujayra hoil qiluvchi birligi (HHB) aniqlandi.
Kalit so^zlar: Priestia megaterium, Pantoea agglomerans, Goryaev panjarali sanoq kamerasi, HHB-hujayra hosil qiluvchi birlik,
Абстракт. В данном исследовании изучен рост бактериальных штаммов Priestia megaterium и Pantoea agglomerans на модифицированной картофельно декстрозной питательной среде где декстроза была заменена мелласой. Определение роста культур проводилось на 3 сутки, через каждые 3 часа. Отмечено, что рост культуры Priestia megaterium на 3 сутки составил 2,028, а рост Pantoea agglomerans 2,240 (КОЕ).
Ключевые слова: Priestia megateriu, Pantoea agglomerans, Камера Горяева, Колониеобразующая единица -КОЕ.
Abstract. In this study, the growth of bacterial strains of Priestia megaterium and Pantoea agglomerans was studied on a modified potato dextrose nutrient medium where dextrose was replaced by mellas. Determination of the growth of cultures was carried out on the 3rd day, every 3 hours. It was noted that the growth of the Priestia megaterium culture on the 3rd day was 2.028, and the growth of Pantoea agglomerans was 2.240 (CFU).
Keywords: Priestia megateriu, Pantoea agglomerans, Goryaev's chamber, colony-forming unit - CFU.
Ko'p hujayrali organizmlardan farqli o'laroq, bir hujayrali organizmlar (shu jumladan bakteriyalar) da o'sish, ya'ni hujayra hajmining oshishi va hujayra bo'linishi bilan ko'payish bir-biri bilan chambarchas bog'liq [1]. Odatda bakteriya hujayralari ikkita ekvivalent qiz hujayralarga bo'linadi. Birinchidan, hujayra uzayadi, unda ko'ndalang septum hosil bo'ladi. Yakuniy bosqichda qiz hujayralari ajralib chiqadi. Bakterial hujayra bo'linishining o'ziga xos xususiyati bu bo'linish jarayonida replikatsiya qilingan DNKning bevosita ishtirok etishidir [2]. Aksariyat hollarda prokaryotik hujayralar hujayra devoriga ega bo'lganligi sababli, ikkilik bo'linish septumning shakllanishi bilan birga keladi - qiz hujayralar orasidagi bo'linma, keyinchalik o'rtada tabaqalanadi. Prokariot hujayraning bo'linish jarayoni E. coli misolida batafsil o'rganilgan [3]. Shu bilan birga, tengsiz bo'linish misollari mavjud. Masalan, Caulobacter crescentus grammanfiy bakteriyaning qiz hujayralaridan bin harakatchan, uning kimyotaksis uchun bitta flagellumi bor. Ikkinchi hujayra
substratga biriktirilgan holda qoladi. Harakatlanuvchi hujayralar qisqa erkin suzish davridan keyin poya hujayralariga differensiyalanadi. Xromosoma replikatsiyasi va hujayra bo'linishi faqat biriktirilgan hujayra bosqichida sodir bo'ladi [4]. Optimal sharoitda bakteriyalar juda tez o'sadi va bo'linadi dengiz Pseudomonas misoli tasvirlangan, ularning soni har 9,8 daqiqada ikki baravar ko'payadi [5]. Ko'pgina bakteriyalar noqulay sharoitlarda omon qolish uchun mo'ljallangan maxsus harakatsiz shakllarni shakllantirishga qodir. Ko'pgina gram-musbat bakteriyalar, ya'ni Bacillus, Sporolaktobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina va Thermoactinomyces avlodlari endosporalar hosil qiladi. Bu bakteriyalarning barchasi juda qalin hujayra devoriga ega, bu sporulyatsiya uchun zarur bo'lib tuyuladi [6]. Dukkakli o'simliklar (masalan, Rhizobium jinsi turlari) ildizlarida azot biriktiruvchi tugunlar hosil qiluvchi bakteriyalar bakterioidlar deb ataladigan differensial hujayralarni rivojlanishi mumkin. Bakteroidlar hajmi jihatidan vegetativ hujayralardan bir necha marta kattaroqdir, ular ko'pincha o'ziga xos X yoki Y shakliga ega. Yetuk bakterioidlarda hujayra oqsilining 10-12% nitrogenazadir [7]. Ko'p hujayrali organizmlardan farqli o'laroq, bir hujayrali organizmlarda (shu jumladan bakteriyalar) o'sish, ya'ni hujayra hajmining oshishi va hujayra bo'linishi bilan ko'payish bir-biri bilan chambarchas bog'liqdir [8]. Odatda bakteriya hujayralari ikkita ekvivalent qiz hujayralarga bo'linadi. Birinchidan, hujayra uzayadi, unda ko'ndalang septum hosil bo'ladi. Yakuniy bosqichda qiz hujayralari ajralib chiqadi. Bakterial hujayra bo'linishining o'ziga xos xususiyati bu bo'linish jarayonida replikatsiya qilingan DNKning bevosita ishtirok etishidir [9]. Ushbu umumiy farmakopeya monografiyasi ma'lum miqdordagi mikrob hujayralarini o'z ichiga olgan mikroorganizmlarning suspenziyalaridan foydalanishni talab qiladigan mikrobiologik tadqiqotlar uchun qo'llaniladi [10]. Mikrob hujayralarining kontsentratsiyasi suspenziya hajmining birligiga to'g'ri keladigan mikroorganizmlarning hujayralari soni sifatida ifodalanadi [11]. Mikrob hujayralarining kontsentratsiyasini aniqlashda, suspenziyaning birlik hajmdagi tirik hujayralar soni (1 ml da hujayra hosil qiluvchi birlikgi - HHB/ml) bilan tirik hujayralar soni belgilanadi. Laboratoriya sharoitida mikroorganizm hujayralari sonini hisoblash tartibi oddiy usulda Petri likopchalaridagi ozuqa muhitida hosil bo'lgan koloniyalarni hisoblash orqali, yoki avtomatik qurilmalar yordamida amalga oshirilishi mumkin [12]. To'g'ridan-to'g'ri vizual hisoblash usullari mavjud, mikroorganizmlarni ozuqa muhitida emlashdan keyin koloniyalar sonini aniqlash, shuningdek mikrob hujayralarini ma'lum bo'yoqlar bilan bo'yashdan keyin mikroskop ostida hisoblash [13]. To'g'ridan-to'g'ri hisoblash usullari ozuqa muhitida mikroorganizmlarning HHB sonini eng to'liq hisobga olish imkonini beradi. Ularning samaradorligi yuqori bo'lishi ozuqa (optimal) muhiti va sharoitlarga bog'liq. Bundan tashqari, to'g'ridan-to'g'ri hisoblash usullari orqali o'rganilayotgan hujayralarning hajmi va morfologik ko'rsatkichlarini aniqlash imkoniyatini beradi. Sanoq kamerasida sanash 1 ml suspenziyadagi hujayralarning umumiy sonini aniqlashning eng keng tarqalgan usuli b'lib mikroskop yordamida hisoblanadi. Sanoq kameralarining bir nechta turlari mavjud bo'lib, ularning asosiy tuzilishi bir xil: Tom-Zeys, Burker, Goryaev, Neubauer panjarali sanoq kamerasi [14]. Goryaevning hisoblash kamerasi - bu ko'ndalang kesiklar qo'llaniladigan maxsus shisha slayd bo'lib, uchta ko'ndalang tartibga solingan tekis maydonlarni hosil qiladi. O'rta platforma uzunasiga tirqish bilan yana ikkita platformaga bo'lingan, ularning har birida ma'lum bir maydonning kvadratlari o'yilgan panjara mavjud. Goryaev kamerasidagi o'rta platformaning har ikki tomonida o'rtadan 0,1 mm balandroq yana ikkita maydon bor. Mikrobli suspenziyaning loyqaligini ma'lum bir to'lqin uzunligidagi optik zichlikni o'lchash orqali aniqlash mumkin. Namunadan o'tadigan yorug'lik nurining intensivligi tarqalish (nefelometriya) yoki
yorug'likning yutilishi (turbidimetriya) bilan kamayadi. Nurning tarqalishi va yorug'likning yutilishi nafaqat suspenziyadagi hujayralar soniga, balki ularning hajmi va shakliga ham bog'liq. Ko'proq konsentrlangan suspenziyalar uchun odatda turbidimetrik usul qo'llaniladi. Juda suyultirilgan suspenziyalar uchun nefelometriya usuli katta sezuvchanligi tufayli qo'llaniladi. Nefelometrning ishlashi tekshirilayotgan muhit tomonidan tarqalgan yorug?lik intensivligini standartning tarqalish intensivligi bilan solishtirishga asoslangan. Sinov paytida namuna yorqin tarzda yoritiladi, so'ngra uzatilgan nurlanish yoki ma'lum bir burchak ostida tarqalgan nurlanishning intensivligi o'lchanadi. Muhitdagi hujayralar sonini aniqlash uchun yorug'likning tarqalishi miqdori va suspenziya hajmi birligiga to'g'ri keladigan hujayralar soni o'rtasidagi munosabatni aks ettiruvchi kalibrlash grafigi qo'llaniladi.
Materiallar va tadqiqot usullari: KM suspenziyali ozuqa muhiti, kolba, chayqatqich, Goryaeva hisoblash oynasi, qoplagich oyna, distillangan suv, gensinviolet, mikroskop, Priestia megaterium va Pantoea agglomerans bakteriya shtammlari. Tadqiqot uchun tanlab olingan bakteriya shtammlari uchun turli xildagi 6ta ozuqa muhitini tanlab olindi va shu ozuqa muhitlari ichidan dominant ozuqa muhit kartoshka dekstrozali suspenziya tanlab olindi. Tanlab olingan ozuqa muhitiga uglerod manbayi sifatida vinochilik zavodlarida qolgan chiqindi mahsuloti melasso dan foydalanildi.
Tadqiqot natijalari.
Kartoshka melassa agarli ozuqa muhitiga probirkalarga 2 kun inkubatsiya qilingan Priestia megateriu va Pantoea agglomerans bakteriya shtammlari inoculumi (108-9 HHB)dan ekuv materiali sifatida foydalanildi. Bakteriya shtammlari 250 ml Erlenmeyer kolbalariga ekildi va 37 0C haroratli 100 aylana/daqiqa tezlikda chayqatgichda qo'yildi. 24 soatdan so'ng 3 qaytariqda bacterial suyuqlik 1:10 nisbatda steril distillangan suvda Gensian violet (Gentianvioletum) yordamida bo'yab suyultirildi (1-rasm). 1 kunda 1000; 1100 va 1200 soat oraliqlari tanlab olindi.
1-rasm. Goryaev hisoblash kamerasida bakteriya hujayralarining ko rinishi
Goryaev hisoblash kamerasi yordamida 1 ml Priestia megateriu va Pantoea agglomerans
bakteriya shtammlari suyuqligidagi mikroorganizmlarning hujayra hosil qiluvchi birligi quydagi
formula asosida aniqlandi. A * 1000
x
*N
HS
A-bakteriyalar soni 1000- o'zgarmas son N- suyulish soni H- garyaev kamera chuqurligi
S- oynaning katta yuzasi I-jadval
Goryaev kamerasida Priestia megaterium shtammining hujayra hosil qiluvchi
birligini aniqlash
Goraev umumiy hisoblash O'rta palata
Bakteriya shtammi Sutkalar Takrorlar soni kamerasidagi soni hujayralar O'rtacha HHB sanoq kamerasidagi hujayralarning
(Soat) 1 2 3 4 5 umumiy soni
10:00 1 3 6 8 4 64 2,560 mln
1-sutka 11:00 19 31 24 10 27 355 14,200 mln
12:00 40 33 31 24 15 422 16,800 mln
Priestia megaterium 10:00 33 32 44 39 48 196 784 mln
2-sutka 11:00 46 38 34 43 50 211 844 mln
12:00 55 63 48 60 67 293 1,172 mlrd
10:00 83 79 88 90 92 432 1,728 mlrd
3-sutka 11:00 96 93 99 100 104 492 1,968 mlrd
12:00 110 113 118 120 99 560 2,240 mlrd
Birinchi kunda Priestia megaterium birinchi qaytariqda o'rtacha hujayralar soni 64 ta, kichik kvadratdagi hujayralarning umumiy soni 2,560 mln ni tashkil qildi. 1:10 nisbatda suyultirili Gensian violet (Gentianvioletum) bo'yog'ida bo'yaldi va mikroskop yordamida Uchinchi takrorlanishida bakteriyalarning umumiy hujayra hosil qiluvchi birligi 16,800 mlnni tashkil etdi (I-jadval). Ushbu jadvaldagi natijalarga asoslanib, suyultirilgan suspenziyadagi har bir plastinkada kamida 10 ta koloniya hosil qilgan, yashovchanligi saqlangan, faol tirik hujayralar hisoblandi va suyultirish 1:10 nisbatda o'rtacha uch takroriy nisbatda ko'rildi. Ushbu tadqiqotda har bir hisoblash kameralaridagi kamida 10 ta koloniya hosil qilgan yuqori darajada suyultirilgan inokulumda hayotga layoqatli hujayralarni hisoblash 5 kunda bir hil vaqt (3 soat) oralig' ida bakteriya hujayralari bo'linib ko'payishi va hosil bo'lishi kuzatildi.
II-jadval
Garyaev kamerasida Pantoea agglomerans shtammini hujayra hosil qiluvchi birligini aniqlash
Bakteriya shtammi Sutkalar Takrorlar soni (Soat) Goryaev kamerasida katta kvadratdagi mikroorganizmlar soni O'rtacha HHB O'rta palata sanoq kamerasidagi hujayralarning umumiy soni
1 2 3 4 5
Pantoea agglomerans 1-sutka 10:00 5 2 4 6 4 64 2,560 mln
11:00 15 8 18 10 12 201 8,040 mln
12:00 20 15 11 14 10 224 8,960 mln
2-sutka 10:00 28 44 16 25 23 106 424 mln
11:00 32 41 29 36 33 171 684 mln
12:00 39 35 47 43 41 205 820 mln
3-sutka 10:00 79 80 74 78 82 393 1,572 mlrd
11:00 85 93 90 88 96 452 1,808 mlrd
12:00 100 108 97 98 104 507 2,028 mlrd
Olingan natijalarga ko'ra Pantoea agglomerans shtammida hujayra sonining ko'payishi lsutkaning 1chi takrorlanishida Priestia megaterium bilan bir xil ko'rsatkichni namoyon etdi, ikkinchi takrorlanishda birinchi takrorlanishga nisbatan 8,040mln taga ko'payganligi kuzatildi (II-jadval). Uchunchi takrorlanishdan hujayralarning ortishi kuzatildi, to'rtinchi sutkada hujayra birligini ortishi bilan bir qatorda ozuqa muhitida bakteriya shtammining zichlashishi ortdi.
Xulosa. Tatqiqotdan asosiy maqsad Priestia megaterium va Pantoea agglomerans shtammlarining suyuq ozuqa muhitda hujayra hosil qilish birligini ortishi kuzatildi. Bu ikki shtamm bir xil ozuqa muhitda o'sishi va rivojlanishi namoyon bo'ldi. Bakterial suspenziya bilan o'simlikka ishlov berishda nechinchi sutkalar oralig'ida qo'llanilishi kuzatildi. Bakteriya shtammlari uch takrorlanishda bo'yoq bilan bo'yab ko'rilganda garaev kamerasida har bir plita va kvadratlar orasidagi bakteriyalarni sanash va kuzatish mumkinligi isbotini topdi. Bu ikki shtamm kartoshka melasso (KM) optimal ozuqa muhiti tanlab olindi hujayra sonining ortishi ozuqa muhitiga bog'liqligi kuzatildi.
REFERENCES
1. Koch A. L. Control of the bacterial cell cycle by cytoplasmic growth. Critical Reviews In Microbiology. -2002.-V.28.. l.-P. 61-77
2. Benjamin Lewin. Chapter 13: The replicon //Genes VIII. -Upper Saddle River, NJ: Pearson Prentice Hall, -2004. -ISBN 0131439812.
3. De Boer P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion In Microbiology. - 2010. -V. 13. №.6. -P.730-737.
4. Ausmees N., Kuhn J. R., Jacobs-Wagner C. The bacterial cytoskeleton: an intermediate filament-like function in cell shape //- 2003. -V.115. -№6. -P. 705-713.
5. Eagon RG. Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than 10 minutes. Journal Of Bacteriology. -1962.-V.83. -P.736-737.
6. Balkwill D. L., Stevens Jr. S. E. Effects of penicillin G on mesosome-like structures in Agmenellum quadruplicatum. Antimicrobial Agents And Chemotherapy. -1980.- V.17. -№ 3. -P.506-509.
7. Пиневич A.B. Микробиология. Биология прокариотов. Издательство С. -Петербургского университета, -2009. - Т.3. -С. 240-257.
8. Porter K.G., Feig Y.S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora.Limnol. 0ceanogr.-1980,-P:943-948.
9. Kirchman, D., Sigda, J., Kapuscinski, R.; Mitchell, R. Statistical analysis of the direct count method for enumerating bacteria. -Appl. Environ. Microb. -1982. 44, P: 376-382.
10. Montagna, P.A. Sampling design and enumeration statistics for bacteria extracted from marine sediments. Appl. Environ. Microb.-1982. -P.1366-1372.
11. Kepner R.L., Pratt J.R. Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples: Past and present. Microbiol. Rev. -1994. - P.603-615.
12. Seo E.Y., Ahn T.S., Zo Y.G. Agreement, precision, and accuracy of epifuorescence microscopy methods for enumeration of total bacterial numbers //Appl. Environ. Microb. -2010.-P.1981-1991
13. Dobretsov S., Thomason J.C. The development of marine biofilms on two commercial non-biocidal coatings: A comparison between silicone and fluoropolymer technologies //Biofouling -2011. - P: 869-880.
14. Dobretsov, S.; Abed, R.M.M. Microscopy ofbiofilms. In Biofouling Methods, 1st ed //John Wiley & Sons Ltd: Oxford. UK. -2014. - P. 3-9.
