CC BY
23BASILLUS AVLODIGA MANSUB BAKTERIYALARI O'RATSIDA TERMOSTABIL A-
AMILAZA PRODUTSENTLARINI SKRINING QILISH 1Xoliqov A.F., 2Pulatova O.M., 3Alimova B.Kh., 4Qambaralieva M.I., 5Maxsumxanov A.A.
1,2,3,4,5O'zR fa Mikrobiologiya instituti, Toshkent sh., O'zbekiston e-mail: [email protected] https://doi.org/10.5281/zenodo.8368209
Annotatsiya. Termostabil a-amilaza produtsentlari bo'lgan bakteriyalarni tanlab olish uchun Qashqadaryo, Samarqand va Toshkent viloyatlari tuproq namunalaridan ajratib olingan 62 ta izolyat kiraxmalni gidroliz qilish xususiyati bo'yicha sikrining qilindi. Natijada 8 ta Bacillus avlodiga mansub bakteriya shtammlari potentsial a-amilaza produtsenlari ekanligi, yani ular kraxmalli ozuqa-muhitida 14-29 mm-li gidroliz zonalari hosil qilganligi sababli tanlab olindi. Ulardan 3 tasi: Bacillus sp.-1.B, Bacillus sp.-3.B va Bacillus sp.-104.k shtammlarining a-amilaza faolligi suyuq ozuqa-muhitida 60 va 70 oC haroratlarda yuqori ekanligi aniqlandi.
Kalit so'zlar: a-amilaza, Bacillus, bakteriya, shtamm, tanlash, faollik, termostabil, harorat, ozuqa muhiti, kraxmal.
Abstract. In order to select bacteria, producing thermostable a-amylase, 62 isolates isolated from soil samples of Kashkadarya, Samarkand and Tashkent regions have been screened for starch hydrolysis properties. As a result, 8 bacterial strains belonging to the genus Bacillus were selected as potential a-amylase producers, which form hydrolysis zones with a diameter of 14-29 mm on the starch medium. It was found that 3 of them: Bacillus sp.-1.B, Bacillus sp.-3.B and Bacillus sp.-104.k have high a-amylase activity at temperatures of 60 and 70 oC.
Keywords: a-amylase, Bacillus, bacteria, strain, selection, activity, thermostable, temperature, nutrient medium, starch.
Аннотация. Для отбора бактерий, являющихся продуцентами термостабильной a-амилазы, было проведено скрининг среди 62 изолятов по гидролизу крахмала, выделенных из образцов почв Кашкадарьинской, Самаркандской и Ташкентской областей. В результате 8 штаммов бактерий относящиеся к роду Bacillus были отобраны как потенциальные продуценты a-амилазы, которые образуют зоны гидролиза диаметром 14-29 мм на среде с крахмалом. Установлено, что 3 штаммы: Bacillus sp.-1.B, Bacillus sp.-3.B и Bacillus sp.-104.k обладают высокой активностью a-амилазы при температурах 60 и 70 оС.
Ключевые слова: a-амилаза, Bacillus, бактерия, штамм, отбор, активность, термостабильность, температура, питательная среда, крахмал.
Kirish
Amilazalar kraxmalni parchalovchi fermentlar bo'lib butun dunyo ferment bozorining to'rtdan bir ulushini egallaydi [1, 2]. a-Amilazalar ko'plab biokatalitik jarayonlarda keng qo'llaniladigan fermentlar qatoriga kiradi. Masalan, oziq-ovqat, farmatsevtika, yengil va tekstil sanoatlarida hamda boshqa fermentatsiya jarayonlarida keng qo'llaniladi [3, 4]. Yuqorida keltirilgan ma'lumotlardan ko'rinib turibdiki, amilazalar juda muhim iqtisodiy ahamiyatga ega bo'lgan fermentlar hisoblanadi. Biokatalitik jarayon uchun kerakli bo'lgan fermentni ko'p miqdorda sintez qiluvchi organizimni izlab topish va tanlab olish, ferment sanoatida juda muhim ahamiyatga ega. Fermentlar produtsentlari orasida mikroorganizmlar, ayniqsa bakteriyalar
muhim o'rin tutadi. Tanlab olingan yangi produtsent shtammga qo'yiladigan sanoat talablari juda ko'p. Jumladan, tanlab olingan bakteriyalar arzon uglerod va azot manbasida o'sib-rivojlanishi, ko'p miqdorda kerakli bo'lgan faol va stabil fermentni sintez qilishi, hujayra tashqarisiga sekretsiya qilishi va nopatogen bo'lishi zarur [5].
Spirt ishlab chiqarish sanoatida amilolitik fermentlarning asosan ikki turi: a-amilaza va gulyukoamilazalardan keng foydalaniladi. Shu bilan birga hujayra tashqi fermentlari ichida a-amilazalar kilinik, tibbiy va analitik kimyoda ham keng foydalaniladi. Shunday ekan, a-amilaza hosil qiluvchi produtsentlarni ta'biy manbalardan ajratib olish va o'rganish milrob biotexnalogiysi uchun juda muhim ahamiyat kasb etadi. Amilaza sintez qiluvchi mikroorganizimlar asosan Bacillus, Aspergillus, Rhizopus avlodiga mansub bo'lib, ular tabiatda keng tarqalgan [6-9]. Termofil va mezofil mikroorganizmlar termostabil ferment produtsentlari sifatida ko'plab olimlarda qiziqish uyg'otgan. Chunki sanoat texnologik jarayonlarida termostabil fermentlardan foydalanish bir qancha afzalliklarga ega [9, 10]. Birinchidan, biokatalitik reaksiyaning yuqori haroratda ketishi boshqa mikroorganizmlar bilan ifloslanish ehtimolini kamaytiradi. Ikkinchidan, yuqori haroratda molekulalar harakati tez bo'lganligi sababli reaksiya tezligi yuqori bo'ladi [11-13]. Hozirgi kungacha termostabil a-amilaza produtsentlari sifatida Bacillus avlodi vakillaridan keng foydalaniladi.
Ushbu tadqiqotning maqsadi - termostabil a-amilaza produtsenti bo'lgan bakteriya shtammini tanlab olish va kultural suyuqlikdagi ferment faolligini har xil haroratlarda o'rganishdan iborat.
Tadqiqot materiallari va usullari
a-Amilaza produtsentlari sifatida Qashqadaryo, Samarqand va Toshkent viloyatlari tuproq namunalaridan ajratib olingan hamda O'zR FA Mikrobiologiya instituti Enzimologiya laboratoriyasida liofil quritilib qo'yilgan 62 ta Bacillus avlodiga mansub bakteriya izolyatlaridan foydalanildi.
Dastlabki skrining uchun quyidagi qattiq ozuqa-muhitidan foydalanildi (g/l): pepton -5.0, KH2PO4 - 5.0, agar-agar - 15.0, kraxmal - 10.0, distillingan suv - 1000 ml, pH 7.0-7.5. Ozuqa-muhiti tarkibidagi barcha komponentlar eritilib 1 kg/cm bosim ostida 25 min davomida sterilizatsiya qilindi. Sterilizatsiyadan keyin Petri idishlariga 20 ml dan quyilib, ozuqa-muhiti qotgandan keyin 35 X haroratli termostatda 24 soat inkubatsiya qilinadi. Bakteriya kulturasi ekilgandan keyin koloniya hamda kraxmal parchalanishidan hosil bo'lgan rangsiz zona diametri har kuni o'lchab boriladi. Kraxmal parchalangan rangsiz zonani yaqqol ko'rish uchun 10% yodli eritmadan 1 ml petri idishiga tomizib ko'rish mumkin.
Fermentatsiya uchun quyidagi suyuq ozuqa-muhiti ishlatildi (g/l): kartoshka kraxmali -10.0, achitqi ekstrakti - 1.0, pepton - 1.0, (NH4)2HPO4 - 10.0, MgSO4 - 0.25, CaCh - 0.05, pH 7.5. Termostabil a-amilaza faolligini aniqlash uchun bakteriyalarning kultural suyuqligidan 1.5 ml olib 10000 ayl./m tezlikda 10 min sentrifuga qilinadi va olingan supernatantda ferment faolligi aniqlanadi. a-Amilaza fermenti faolligini aniqlash uchun kraxmalni yod bilan bo'yash usulidan foydalanildi. Dastlab yodli eritmani (0.5 M xlorid kislotasida) spektrofotometrda 440 nm to'lqin uzunligida nur yutish ko'rsatkichi 0.22 optik zichlikka keltirib olinadi. Probirkalarga 2 ml 1%-li kraxmal ertitmasidan solib, suv hammomida 40, 50, 60 va 70 X haroratda 5 min davomida inkubatsiya qilinadi. Probirka ichidagi harorat ma'lum ko'rsatgichga yetgach 0.1 ml supernatant qo'shilib 10 min davomida inkubatsiya qilinadi. Reaksiyani to'xtatish uchun yodli
eritmadan 2.5 ml qo'shiladi va spektrofotometrda (670 nm) aralashmaning absorbsiyasi o'lchanadi va ferment faolligi keltirilgan adabiyotlar bo'yicha hisoblanadi [14-17].
Natijalar va ularning muhokamasi
Dastlabki skrining bosqichida Bacillus avlodiga mansub bakteryalarni tarkibida kraxmal bo'lgan ozuqa-muhitiga ekib, ularning kraxmal parchalash xususiyati tekshiriladi. Petri idishlariga ekib o'stirilgan bakteriyalar 48, 96 va 120 soat davomida bakteriya kolonyalari atrofidagi shaffof zona diametri hamda bakteriya kolonyasi diametrini o'lchash natijasida kraxmalni parchalash faolligi aniqlandi. O'tkazilgan tadqiqotlar natijasida kraxmalni parchalash zonasi diametri bo'yicha eng katta zona bergan 8 ta, yani: Bacillus sp.-1.B, Bacillus sp.-3.B, Bacillus sp.-2.k, Bacillus sp.-13.k, Bacillus sp.-21.k, Bacillus sp.-29.k, Bacillus sp.-104.k va Bacillus sp.-111.k bakteriya izolayatlari tanlab olindi. Ushbu shtammlar Petri idishida o'stirishning 96 soatida 15-21 mm, 120 soatida esa 14-29 mm bo'lgan kraxmalni gidrolizlash zonalarini bergan. 8 ta izolyat ichida 2 ta bakteriya: Bacillus sp.-1.B va Bacillus sp.-104.k shtammlari mos ravishda 29 va 23 mm bo'lgan eng katta gidroliz zonalarini berganligi aniqlandi (1-rasm).
1-rasm. Qattiq ozuqa-muhitida Bacillus sp.-1.B (chapda) va Bacillus sp.-104.k (o'ngda) shtammlarining koloniyalari atrofida kraxmalni gidroliz qilgan zonasi
Shunga qaramasdan, tanlab olib o'rganilgan 8 ta shtammning barchasi suyuq ozuqa-muhitida o'stirildi va a-amilaza faolligi o'stirish haroratidan yuqori bo'lgan har xil (40, 50, 60 va 70 oC) haroratlarda aniqlandi (2-rasm). Tajribalar shuni ko'rsatdiki, tanlab olingan hamma shtammlar ham yuqorida keltirilgan haroratlarda a-amilaza faolligini namoyon qilmadi. Yuqori a-amilaza faolligi Bacillus sp.-1.B, Bacillus sp.-3.B, Bacillus sp.-111.k va Bacillus sp.-104.k shtammlarida barcha haroratlarda kuzatildi. Eng yuqori ferment faolligini Bacillus sp.-1.B, Bacillus sp.-3.B va Bacillus sp.-104.k shtammlari 60 va 70 oC da ko'rsatishdi. Mezofil mikroorganizmlar, ayniqsa Bacillus avlodiga mansub bakteriyalar mezofil sharoitda o 'sib rivojlanishi, lekin termostabil ferment hosil qilishi adabiyotlarda keltirilgan [8-12].
1
0,?
0.8 0.7 0,6 0.5 0,4 0,3 0.2 0.1 о
2-rasm. Bacillus avlodiga mansub bakteriya shtammlarining har xil haroratlarda a-amilaza faolligini namoyon qilishi.
Shunday qilib, qolgan barcha izolyatlar termostabil a-amilaza produtsenti emasligi aniqlandi. Tajribalar tanlab olingan 3 ta izolyat bilan davom ettirilmoqda. Keyingi tajribalarda termostabil a-amilaza fermentining eng yaxshi produtsentlari tanlab olinib, molekulyar identifikatsiya qilinadi. Kelajakda a-amilaza geniga mos primerlar dizayn qilinib kerakli vektorlarga klonlash va rekombinant oqsil xossalari o'rganish istiqbolli hisoblanadi.
REFERENCES
1. Gupta, R.; Gigras, P.; Mohapatra, H.; Goswami, V.K.; Chauhan, B. (2003). Microbial -amylases: a biotechnological perspective. Process Biochem 38, 1599 - 1616
2. Reddy, N.S.; Nimmagadda, A.; Sambasiva Rao, K.R.S. (2003). An overview of the microbial a-amylase family. Afr. J. Biotechnol. 2, 645-648.2.
3. Kandra, L. (2003). Amylases of medical and industrial importance. Journal of Molecular Structure (Theochem) 666-667, 487-498
4. Rajagopalan, G.; Krishnan, C. (2008). Alpha-amylase production from catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate. Bioresour Technol 99, 3044-3050.
5. Maha A. Rakaz, Mohammed O. Hussien, Hanan M. Ibrahim "Isolation, Extraction, Purification, and Molecular Characterization for Thermostable alfa amylase from Locally Isolated Bacillus Species in Sudan" Biochemistry Research International Volume 2021 //doi: 10.1155/2021/6670380
6. Kandandapani S., Tan C., Shuib A. S., Tayyib S. Influence of Buffer Composition and Calcium Chloride on GdnHCl Denaturation of Bacillus licheniformis a-Amylase // Protein Pept Lett. - 2016.- Vol. 23, No6. - P. 537-43.
7. Bhatt K., Lal S., Srinivasan R., Joshi B. Molecular analysis of Bacillus velezensis KB 2216, purification and biochemical characterization of alpha-amylase // Int J Biol Macromol. -2020. Vol.164.- P. 3332-3339.
8. Lee, S., H. Oneda, M. Minoda, A. Tanaka, C. and Inouye, K. (2006). Comparison of starch hydrolysis activity and thermal stability of two Bacillus licheniformis a-amylases and
insights into engineering a-amylase variants active under acidic conditions. Journal of Biochemistry (Tokyo). 139: 997-1005.
9. Jin-Na Cui , Wei Hu , Yan-Xin Liu , Yong-Li Li , Jian-Hua Hu , Zhan-Ying Liu , Ji-Hong Chen Isolation and Screening of High-Yielding a-Amylase Mutants of Bacillus subtilis by Heavy Ion Mutagenesis". Appl Biochem Biotechnol (2023) Jan;195(1):68-85. doi: 10.1007/s12010-022-04097-y. Epub 2022 Aug 15.
10. Mozhaev, V. (1993). Mechanism-based strategies for protein thermostabilization. Trends Biotechnology .11:88-95.
11. Krahe, M., Antranikian, G. and Markel, H. (1996). Fermentation of extremophilic microorganisms. FEMS Microbiology Review. 18: 271- 285
12. Tanyildizi MS, Ozer D and Elibol M (2005) Optimization of a-amylase production by Bacillus sp. Using response surface methodology. Process Biochemistry 40: 2291-2296.
13. J. L. Collins, J.-Y. Liao, and M. P. Penfield, "Chemical, physical and sensory attributes of formed and frozen, baked sweetpotato," Journal of Food Science, 1995, vol. 60, no. 3, pp. 465-467.
14. Enzyme preparation. Methods for the determination of amylase activity. ГОСТ 20264.4
15. F.R. Matiri , R.R.H Rumende, S. Sudewi (2019) Identifion of a-amylase gene by PCR and activity of thermostable a-amylase from Anoxybacillus thermarum isolated from Remboken hot spring in Minahasa, Indonesia Earth and Environmental Science 217. doi:10.1088/1755-1315/217/1/012045
16. F. M Gazali and I N Suwastika Thermostable a-amylase activity from thermophilic bacteria isolated from Bora hot spring central Sulawesi (2018) Journal of Phsics 979. Doi: 10.1088/1742-6596/979/1/012001
17. Leuschner, C. and Antranikan, G. (1995). Heat stable enzymes from extremely thermophilic and hyperthermophilic microorganisms. World Journal Microbiology Biotechnology. 11: 95-114.
