CC BY
32
УДК 612.112.91: 616-006.81
превентивное внутривенное введение зимозан-обработанных нейтрофилов подавляет рост меланомы в16 в печени и селезенке мышей
Геннадий Юрьевич ЛЮБИМОВ1, Андрей Геннадьевич ЛЮБИМОВ1, Елена Брониславовна МЕНЬЩИКОВА2, Владимир Александрович КОЗЛОВ1
1 НИИ фундаментальной и клинической иммунологии 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14
2 НИИ экспериментальной и клинической медицины 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
Исследовалось действие нейтрофилов, активированных ex vivo зимозаном и введенных в хвостовую вену, на рост меланомы В16 в печени и селезенке мышей. Проведенные эксперименты позволили установить, что внутривенная инъекция обработанных зимозаном нейтрофилов за 3 дня до инокуляции суспензии клеток меланомы B16 приводит к достоверному снижению количества опухолевых узелков в печени (с 33,8 ± 10,9 до 0) и прироста массы пораженной печени (с 612 ± 136 до 0 мг) на 21 день опухолевого роста. Кроме того, произошло достоверное уменьшение количества опухолевых узелков в селезенке (с 4,7 ± 0,6 до 0). Полученные результаты выявили полное подавление роста меланомы В16 в печени и селезенке мышей в результате воздействия активированных ex vivo зимозаном нейтрофилов.
Ключевые слова: нейтрофилы, макрофаги, зимозан, глюкан, печень, селезенка, меланома.
Активирующее действие зимозана на имму-нокомпетентные клетки более 50 лет находится под пристальным вниманием ученых. Однако микрочастичковая природа зимозана, а также свойство составляющих его молекул глюкана активировать фагоциты и систему комплемента приводит к череде побочных эффектов и тяжелых осложнений [12, 13, 16], что препятствует применению зимозана в медицинской практике. Также известно, что фактически любая микрочастица, попавшая в организм, захватывается фагоцитирующими клетками [2, 6]. В связи с этим возникла идея - изначально, в условиях ex vivo, инкорпорировать частицы зимозана в фагоциты, а затем вводить их в организм животного или человека.
Ранее нами показано, что макрофаги, обработанные зимозаном в условиях in vitro и в последующим введенные в портальную вену, проявляют противоопухолевое действие, подавляя рост меланомы В16 в печени мышей [1]. Если в даль-
нейшем пытаться внедрять этот экспериментальный метод в лечебной практике, то процедура использования макрофагов, получаемых из моноцитов крови человека, окажется дорогостоящей и трудоемкой [5]. В связи с этим целесообразно проведение аналогичной серии экспериментов с использованием нейтрофилов, так как методика их получения менее затратна и, согласно данным некоторых исследователей, наряду с макрофагами нейтрофилы способны принимать участие в противоопухолевой защите организма [8-10, 14]. Кроме того, очевидно, что метод внутрипорталь-ного введения клеток инвазивен и технически сложен, к тому же сама процедура вызывает у пациентов чувство страха и эмоционального дискомфорта.
Вышесказанное определило цель настоящего исследования - изучить эффект внутривенного (через хвостовую вену) введения мышам зимозан-обработанных нейтрофилов на рост меланомы В16.
Любимов Г.Ю. - к.м.н., научный сотрудник лаборатории регуляции иммунопоэза, e-mail: glubimov@rambler.ru
Любимов А.Г. - младший научный сотрудник лаборатории регуляции иммунопоэза, e-mail: glubimov@rambler.ru
Меньщикова Е.Б. - д.м.н., зав. лабораторией молекулярных механизмов свободнорадикальных процессов, e-mail: lemen@centercem.ru
Козлов В.А. - д.м.н., проф., академик РАН, зав. лабораторией клинической иммунопатологии, е-mail: niiki01@online.nsk.su
материал и методы
В работе использовали 30 самок мышей (CBA х C57BL/6)F1 в возрасте 6-8 мес., массой 32-38 г, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных НИИ фундаментальной и клинической иммунологии (г. Новосибирск). Уход за экспериментальными животными и их содержание в условиях вивария были стандартными и соответствовали требованиям приказов «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию вивариев» № 1045-73 от 06.04.1973, а также № 1179 от 10.10.1983 МЗ СССР, № 267 от 19.06.2003 МЗ РФ, «Правилам по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных», утвержденным МЗ СССР (1977) и МЗ РСФСР (1977), принципам Европейской конвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкской декларации всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996).
Мыши были разделены на 3 группы: животным группы интактного контроля (n = 5) в хвостовую вену вводили 0,5 мл натрий-фосфатного буфера (PBS), животным группы позитивного контроля (n = 5) - 0,5 мл PBS и клетки меланомы B16, животным группы опыта (n = 5) - нейтро-филы, инкубированные в присутствии зимозана, в 0,5 мл PBS и клетки меланомы B16 (см. ниже). Эксперимент повторяли дважды.
Зимозан (Биохимреактив, Латвия) гомогенизировали тефлоновым пестиком при 2000 об/мин в течение 90 с (допустимый размер гранул 1-5 мкм) и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин в неинактивированной сыворотке мышей. Затем гранулы зимозана трижды отмывали в 10 мл натрий-фосфатного буфера (PBS) при 3000 об/мин.
За 3 часа до выделения нейтрофилов мышам внутрибрюшинно вводили 1 мл 10%-го раствора пептона (Difco, США). Животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации. Для получения клеток в брюшную полость вводили 10 мл холодного PBS, брюшко массировали в течение 60 с, затем шприцем извлекали ранее введенный раствор. Содержание нейтро-филов в полученной таким образом суспензии клеток составляло 98 %, что подтверждено све-тооптическим исследованием приготовленных из нее мазков, окрашенных по Романовскому -Гимзе.
В пластиковом флаконе для культивирования с площадью 25 см2 создавали монослой нейтро-филов плотностью 1 х 106/см2, заливали 10 мл культуральной среды RPMI-1640 c 10 % инакти-вированной сыворотки мышей и 2 мг/мл зимоза-
на. Фагоцитоз проводили в течение 40 мин в термостате при 37 °С.
После фагоцитоза пластиковый флакон трижды отмывали от непоглощенных гранул зимозана 20 мл PBS, монослой клеток открепляли от поверхности флакона резиновым скрепером и доводили до концентрации 30 х 106/мл холодным PBS. Полученную суспензию клеток вводили в хвостовую вену в объеме 0,5 мл (таким образом, количество введенных нейтрофилов составляло 15 х 106 на мышь) за 3 дня до инъекции клеток меланомы В16.
С целью образования печеночных очагов роста опухоли 10 000 клеток меланомы В16 (получены из банка опухолевых линий Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена) вводили в портальную вену. На 21-й день после инъекции опухолевых клеток животных выводили из эксперимента путем цервикальной дислокации, проводили эвис-церацию печени и селезенки. Определяли массу печени, селезенки и подсчитывали в них число поверхностно расположенных опухолевых узелков. Массу опухоли определяли как разницу между массой печени животных группы позитивного контроля и группы интактного контроля, группы опыта и группы интактного контроля.
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (m), и представляли в виде M ± m. Различия между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни, достоверными считали результаты при р < 0,05.
результаты и их обсуждение
Полученные в ходе настоящего исследования данные оказались аналогичными и более показательными по сравнению с результатами опытов, в которых мы использовали макрофаги [1], поскольку введение зимозан-активированных нейтрофилов приводило к практически полной отмене опухолевого роста, что наглядно представлено на цифровом снимке (см. рисунок) и подтверждается табличными данными (см. таблицу). Так, если количество опухолевых узелков в печени мышей группы позитивного контроля (получавших инъекцию неактивированных ней-трофилов) составляло 33,8 ± 10,9, в селезенке -4,7 ± 0,6, то у мышей группы опыта, которым вводили зимозан-активированные нейтрофилы, оба показателя равнялись 0. Аналогичным образом уменьшилась и масса опухоли в обоих исследованных органах. Такое выраженное действие зимозан-активированных нейтрофилов на
Рис. Внешний вид печени мышей линии (CBA х С 57BI/6) F1 на 21-й день после инокуляции клетокмеланомы B16; за 3 дня до инъекции опухолевых клеток животным в хвостовую вену вводили PBS (а) либо суспензию аутологичных зимозан-активированных нейтрофилов (б)
Таблица
Влияние введенных внутривенно зимозан-обработанных нейтрофилов на параметры роста меланомы В16 мышей линии (CBA х С 57BI/6) F1
Параметр Позитивный контроль Опыт Интактный контроль
Масса опухоли в печени, мг 612 ± 136# 0* 0
Масса опухоли в селезенке, мг 29,6 ± 25,3# 0* 0
Количество узелков опухоли в печени 33,8 ± 10,9# 0* 0
Количество узелков опухоли в селезенке 4,7 ± 0,6# 0* 0
Масса печени, мг 2218 ± 257# 1697 ± 63 1606 ± 59
Масса селезенки, мг 166 ± 25 184 ± 16# 136 ± 22
Примечание. Обозначены статистически значимые (р < 0,001) отличия от величин соответствующих показателей группы позитивного (*) и интактного (#) контроля.
опухолевый рост, вероятно, объясняется тем, что если макрофаги вводились одновременно с опухолевыми клетками, то нейтрофилы - за три дня до инокуляции опухоли, что, возможно, привело к мобилизации клеточного противоопухолевого потенциала печени [7]. В пользу этого говорит наличие статистически недостоверной гиперплазии печени (определяемой по массе органа) и статистически значимого увеличения массы селезенки (см. таблицу), что является следствием стимуляции лейко- и гемопоэза зимозаном [3, 4]. Отсутствие выраженного прироста массы печени объясняется тем, что основной пик ее гиперплазии приходится примерно на 9-й день от момента внутривенного введения суспензии зи-мозана, затем гиперплазия начинает медленно инволюционировать и примерно к 20-25 дню раз-
меры печени возвращаются к исходному уровню [3, 4], в настоящем же исследовании мы проводили измерение массы органов на 24 день после введения зимозан-активированных нейтрофилов.
В отдельной серии экспериментов по выяснению действия интактных нейтрофилов (элиси-тированных в брюшную полость 10%-м раствором пептона и необработанных зимозаном) на опухолевый рост мы не обнаружили какого-либо их влияния на рост меланомы В16 в печени и селезенке мышей. Количество опухолевых узелков в печени животных группы позитивного контроля и у мышей, которым вводили нестимулиро-ванные нейтрофилы, составило соответственно 43,8 ± 17,5 и 51,0 ± 19,8. Аналогичные результаты получены при подсчете числа опухолевых узелков в селезенках (9,8 ± 4,3 и 10,5 ± 4,2 соот-
ветственно). Более того, полученные данные указывают на наличие недостоверной стимуляции роста опухоли в печени и селезенке, что согласуется с данными других авторов [11, 15].
Таким образом, введение зимозан-активиро-ванных нейтрофилов в венозную систему большого круга кровообращения за несколько дней до инокуляции меланомы В16 приводит к полной отмене роста опухоли в печени и селезенке, очевидно, в результате значительной активации цитотоксических свойств иммунокомпетентных клеток данных органов. Это может происходить либо за счет увеличения притока в печень и селезенку соответствующих предшественников, либо за счет активации уже имеющихся в них резидентных пулов.
заключение
Исследование влияния нагруженных зимоза-ном нейтрофилов на рост меланомы В16 в печени и селезенке мышей выявило полное подавление злокачественного роста меланомы В16. Столь выраженное угнетение объясняется тем, что активированные нейтрофилы вводились превентивно, за несколько дней до инокуляции опухоли, что позволяет увеличить потенциал неспецифической противоопухолевой активности печени и селезенки. Это дает основание для дальнейшей разработки возможности применения таких ней-трофилов в профилактике и лечении метастазов печени.
список литературы
1. Любимов Г.Ю., Любимов А.Г. Влияние инкорпорированного в аутологичные макрофаги зимо-зана на метастатический рост меланомы В16 в печени мышей // Рос. иммунол. журн. 2011. 5. (3-4). 309-314.
2. Маянский Д.Н., Щербаков В.И., Правото-ров Г.В. Растормаживание системы мононукле-арных фагоцитов микробными стимуляторами // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1983. (4). 52-55.
3. Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д. Реактивность макрофагов легких и печени нормальных и предварительно стимулированных животных // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1989. (4). 44-48.
4. Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д., Йон-кер А.М. и др. Индукция гранулематозного воспаления печени неинфекционными частицами // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1990. (5). 45-49.
5. Andreesen R., Scheibenbogen C., Brugger W. et al. Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating blood monocytes: a new approach to cancer immunotherapy // Cancer Res. 1990. 50. (23). 7450-7456.
6. Benaceraff B., Biozzi G., Halpern B., Stiffel C. Physiology and phagocytosis of particles by R. E. S. // Physiopathology of the Reticuloendothelial Cells / Ed. B.N. Halpern. Oxford: Blackwell, 1957. 52-59.
7. Bouwens L., Wisse E. Tissue localization and kinetics of pit cells or large granule lymphocytes in the liver of rats treated with biological response modifiers // Hepatology. 1988. 8. (1). 46-52.
8. Fisher B., Saffer E.A. Tumor cells cytotoxicity by granulocytes from peripheral blood of tumor-bearing mice // J. Natl. Cancer Inst. 1978. 60. (3). 687-691.
9. Gerrard T.L., Cohen D.J., Kaplan A.M. Human neutrophil-mediated cytotoxicity to tumor cells // J. Natl. Cancer Inst. 1981. 66. (3). 483-488.
10. Morikawa K., Takeda R., Yamazaki M., Mizuno D. Induction of tumoricidal activity of polymorphonuclear leukocytes by a linear beta-1,3-D-glucan and other immunomodulators in murine cells // Cancer Res. 1985. 45. (4). 1496-1501.
11. PekarekL.A., StarrB.A., ToledanoA.Y., Schreiber H. Inhibition of tumor growth by elimination of granulocytes // J. Exp. Med. 1995. 181. (1). 435-440.
12. Schirmer W.J., Schirmer J.M., Naff G.B., Fry D.E. Contribution of toxic oxygen intermediates to complement-induced reductions in effective hepatic blood flow // J. Trauma. 1988. 28. (9). 1295-1300.
13. Schirmer W.J., Schirmer J.M., Naff G.B., Fry D.E. Systemic complement activation produces hemodynamic changes characteristic of sepsis // Arch. Surg. 1988. 123. (3). 316-321.
14. Sionov R.V., Zvi G., Fridlender Z.G., Granot Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment// Cancer Microenviron. 2015. 8. 125-158.
15. Smith H.A., Kang Y. The metastasis-promoting roles of tumor-associated immune cells // J. Mol. Med. 2013. 91. (4). 411-429.
16. Volman T.J., Hendriks T., Goris R.J. Zymo-san-induced generalized inflammation: experimental studies into mechanisms leading to multiple organ dysfunction syndrome // Shock. 2005. 23. (4). 291-297.
PREVENTIVE INTRAVENOUS INJECTION OF ZYMOSAN-TREATED NEUTROPHILS SUPPRESSES GROWTH OF B16 MELANOMA IN MICE LIVER AND SPLEEN
Gennady Yur'evich LYUBIMOV1, Andrey Gennadievich LYUBIMOV1, Elena Bronislavovna Menshchikova2, Vladimir Aleksandrovich KOZLOV1
1 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology 630099, Novosibirsk, Yadrintsevskaya str., 14
2 Research Institute of Experimental and Clinical Medicine 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
We investigated the effect of activated ex vivo with zymosan and injected into tail vein neutrophils on the growth of B16 melanoma in mice liver and spleen. Our experiments showed that intravenous injection of zymosan-treated neutrophils 3 days before inoculation of B16 melanoma cell suspension results in a significant decrease of tumor nodule number in the liver (from 33.8 ± 10.9 to 0) and the weight gain of affected liver (from 612 ± 136 to 0 mg). The number of tumor nodules in the spleen dramatically decreased too (from 4.7 ± 0.6 to 0). The results indicate that intravenous injection of zymosan-treated neutrophils leads to a total suppression of B16 melanoma growth in mice liver and spleen.
Key words: neutrophil, macrophage, zymosan, glucan, liver, spleen, melanoma.
Lyubimov G.Yu. - candidate of medical sciences, researcher, laboratory of immunopoiesis regulation, e-mail: glubimov@rambler.ru
Lyubimov A.G. - junior researcher, laboratory of immunopoiesis regulation, e-mail: glubimov@rambler.ru Menshchikova E.B. - doctor of medical sciences, head of the laboratory for molecular mechanisms of free-radical processes, e-mail: lemen@centercem.ru
Kozlov V.A. - doctor of medical sciences, professor, academician of RAS, head of the laboratory of clinical immunopathology, e-mail: niiki01@online.nsk.su
