CC BY
97
УДК: [(612.017.1:616-006):615.371:616-085)]:57.081
КСЕНОВАКЦИНОТЕРАПИЯ МЕЛАНОМЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Э.А. Кащенко, С.Н. Белогородцев, Г.В. Селедцова, Д.М. Самарин,
И.В. Майбородин, В.И. Селедцов, А.А. Шишков, И.В. Савкин, В.А. Козлов
ГУ «НИИ клинической иммунологии СО РАМН», г. Новосибирск 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14, e-mail: eac@ngs.ru
Показано, что вакцинация мышей C57BL6, несущих меланому В16, лизатом клеток человеческой меланомы Bro приводила к повышению сывороточной концентрации интерлейкина-4 (ИЛ-4) и к инфильтрации опухоли преимущественно нейтрофилами. В то же время вакцинация опухоленосителей лизатом клеток В16 приводила к повышению сывороточного интерферона-гамма (ИФ-гамма) и к инфильтрации опухоли нейтрофилами и лимфоцитами. Гистологический анализ показал высокую степень гибели опухолевых клеток в обеих группах вакцинированных животных. Тем не менее только ксеногенная, но не сингенная вакцинация ассоциировалась с пролонгацией жизни опухоленосителей. Таким образом, полученные данные указывают на важность в механизме противоопухолевого действия ксеновакцинации иммунных реакций, опосредуемых Т-хелперами 2-го типа.
Ключевые слова: меланома, ксеногенная клеточная вакцина, Т-клеточная реакция.
XENOVACCINOTHERAPY FOR MELANOMA IN EXPERIMENTAL STUDIES E. A. Kaschenko, S.N. Belogorodtsev, G.V. Seledtsova, D.M. Samarin,
I.V. Maiborodin, VI. Seledtsov, A.A. Shishkov, I.V Savkin, V.A. Kozlov Research Institute of Clinical Immunology, Novosibirsk 14, Yadrintsevskaya Street Novosibirsk-634099, Russia, e-mail: eac@ngs.ru
Vaccination of melanoma B16-bearing C57BL6-mice with human Bro melanoma cell lysate resulted in the increase in serum interleukin-4 (IL-4) concentration and tumor infiltration preferably by neutrophils. At the same time, vaccination of tumor-bearing mice with melanoma B16 cell lysate led to the increase in serum interferon-gamma (IF-gamma) and tumor infiltration by neutrophils and lymphocytes. Histological analysis showed a high rate of tumor cell death in both groups of vaccinated animals. Nevertheless, only xenogenic but not syngenic vaccination associated with life prolongation of tumor-bearing mice. Thus, the data obtained point out the importance of xenovaccination of T-helper-2-mediated immune responses in the mechanism of anti-tumor effect.
Key words: melanoma, xenogenic cell vaccine, T-cell immune reaction.
Многочисленными исследованиями установлено, что иммунная система способна распознавать и активно уничтожать туморогенные клетки. Поэтому противоопухолевая вакцинация является одним из наиболее перспективных подходов как к профилактике, так и к лечению опухолевых заболеваний. Среди большого разнообразия разрабатываемых противоопухолевых вакцин ксеновакцины привлекают особое внимание. С одной стороны, опухолеассоциированные антигены (ОАА) разных видов имеют высокую степень гомологии. С другой стороны, показано, что структурные отличия ксеноген-ных ОАА от их гомологов в вакцинируемом организме придают им дополнительную имму-ногенность и делают их высокоэффективными в индукции противоопухолевых иммунных реакций [3, 5-8, 12-14]. Однако механизм им-муногенного действия ксеногенных ОАА изучен недостаточно. В частности, остаются вопросы, касающиеся цитокиновой направленности
индуцируемых ксеногенными ОАА иммунных реакций. Данные настоящего исследования указывают на важность в механизме действия ксеновакцины иммунных реакций, опосредуемых T-хелперами 2-го типа.
Материал и методы
В работе использовались самцы мышей линии C57BL/6 (В6, H-2b), 6-9-месячного возраста, полученные из питомника лабораторных животных СО РАМН (г. Новосибирск). Клетки меланомы В16, перевиваемые на мышах B6, и клетки человеческой меланомы Bro были получены из Онкологического научного центра РАМН (г. Москва). Опухолевые клетки сохраняли in vitro в среде RPMI 1640, содержавшей 10 % инактивированной сыворотки плодов коров, 5 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина и антибиотики (все реактивы Sigma, США). Для получения вакцины клеточные суспензии помещали в пластиковые пробирки (50 мл) и центрифугировали
10 мин (2000 об/мин) при t=4-8°C Далее клетки ресуспендировали в охлажденной дистиллированной воде и повторно центрифугировали при указанных выше условиях. После центрифугирования лизат помещали в охлажденный физиологический раствор и в расфасованном виде хранили до использования при -20°С.
Для индукции опухолевого роста клетки меланомы В16 (5х105/ мышь) имплантировали под кожу передней брюшной стенки сингенных мышей. Через 3 дня животных вакцинировали лизатом клеток В16 или Bro (5х106/ мышь). Две последующие вакцинации проводили с интервалом в 3-5 дней. В контроле животным вместо вакцины вводили физиологический раствор. Для проведения иммунологических исследований часть мышей из каждой группы выводилась из эксперимента на 15-й день после имплантации опухоли.
В пролиферативном тесте клетки селезенки культивировали в среде RPMI 1640, содержавшей 5 % инактивированной сыворотки плодов коров, 5 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 5*10-5 М меркаптоэтанола и антибиотики (все реактивы Sigma, США), в 96-луночном планшете (3х105/лунка) в присутствии лизированных клеток B16 (5*105/лунка) или сингенных спле-ноцитов в контроле. За 6 ч до окончания культивирования в культуры вносили [3H] -тимидин (0,75 мкС^лунку). Уровень пролиферативной клеточной активности определяли по включению [3Н]-тимидина. Индекс стимуляции (ИС) вычисляли по формуле: ИС = опыт (имп/мин) / контроль (имп/мин).
Уровни интерферона-гамма (ИФ-гамма) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в сыворотках мышей определяли с использованием коммерческих
иммуноферментных тест-систем, согласно инструкции фирмы-изготовителя (BioSource, Intrenational, Inc.).
Для гистологического исследования срезы опухоли толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты исследовали на световом микроскопе «Triton» (Seti, Бельгия) при увеличении 600 раз. Степень лейкоцитарной инфильтрации и гибели клеток опухоли оценивали по 5-балльной шкале (0 - нет, 1 - слабо выражена, 2 - умеренно выражена, 3 - выражена, 4-5 - резко выражена).
Представленные данные (средние значения, дополненные соответствующими стандартными отклонениями) были воспроизведены не менее чем в 3 однотипных экспериментах. Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия Каплан и Майер.
Результаты и обсуждение
Уровень Т-клеточной сенсибилизации вакцинированных мышей к ОАА меланомы В16 был оценен в пролиферативном тесте (таблица). Достоверный прирост пролиферативного ответа клеток селезенки на меланомные антигены имел место в группе мышей, иммунизированных сингенной вакциной (р<0,002). Такого прироста не наблюдалось в группе мышей, иммунизированных ксеногенной вакциной.
Известно, что Т-хелперы 1-го типа, ответственные за развитие клеточных иммунных реакций, продуцируют интерферон-гамма (ИФ-гамма), тогда как T-хелперы 2-го типа, ответственные в большей степени за развитие гуморальных реакций, продуцируют интерлейкин-4 (ИЛ-4). Поэтому уровни этих цито-
Таблица
Пролиферативный ответ клеток селезенки на антигены клеток В16, концентрация сывороточных ИФ-гамма и ИЛ-4, степень инфильтрации и гибели клеток в опухолевой ткани
Группа животных Индекс пролиферации ИФ-гамма, пг/мл ИЛ-4, пг/мл Степень инфильтрации Степень гибели клеток
Контроль 1 0 0 1 1
Иммунизация син-генной вакциной (В16) 4,6 ± 0,3 6,5 ± 2,1 0 4 4
Иммунизация ксе-ногенной вакциной (Bro) 1,3 ± 0,3 0 6,2 ± 0,8 4 4
17 18 23 25 27 30 31 32 33 34 35 37 38 39
время после привития опухоли (сутки)
контроль ■ сингенная вакцина а ксеногенная вакцина
Рис. 1. Выживаемость экспериментальных животных-опухоленосителей в сравниваемых группах
кинов в крови могут являться индикаторами направленности и активности происходящих в организме иммунных процессов. В сыворотках крови мышей контрольной группы содержание ИФ-гамма и ИЛ-4 не превышало минимально определяемых концентраций (1пг/мл и 5 пг/мл соответственно). В группе мышей, иммунизированных сингенной вакциной, содержание в сыворотке ИФ-гамма возрастало до 6,5 ± 2,1 пг/мл. В группе мышей, иммунизированных ксеновакциной, сывороточная концентрация ИФ-гамма не претерпевала существенных изменений. В то же время в этой группе наблюдался подъем ИЛ-4 до определяемого значения 6,2 ± 0,8 пг/мл (таблица).
При гистологическом исследовании только слабо выраженная лейкоцитарная инфильтрация опухоли и незначительная степень гибели опухолевых клеток (апоптоз и некроз) были отмечены в контрольной группе. В обеих опытных группах инфильтрация и степень гибели опухолевых клеток были резко выражены. В группе ксеновакцинированных животных большая часть инфильтрирующих клеток была представлена нейтрофилами, тогда как в группе мышей, вакцинированных сингенными ОАА, соотношение нейтрофилов и лимфоцитов в инфильтрате было близким к 1 (данные не представлены).
Кроме того, ксеновакцинация статистически достоверно (р<0,05) пролонгировала выживаемость опухоленосителей. В то же время
выживаемость в группе животных, вакцинированных сингенной вакциной, существенно не отличалась от выживаемости, демонстрируемой контрольной группой (рис. 1).
В целом, полученные данные указывают на то, что вакцинация ксеногенными ОАА индуцировала иммунные реакции, опосредуемые преимущественно Т-хелперами 2-го типа. Отсюда можно предполагать, что значимая роль в сдерживании развития опухолевого процесса может принадлежать опухолеспецифическим антителам. В этом случае в качестве цитоток-сических эффекторов могут выступать несущие Fc-рецепторы полиморфонуклеарные лейкоциты. Вакцинация сингенными ОАА, по-видимому, в большей степени стимулирует иммунные реакции, опосредуемые Т-хелперами 1-го типа. Интересно, что прирост пролиферативной Т-клеточной активности, достигнутый за счет вакцинации сингенными ОАА, не ассоциировался с пролонгацией жизни опухоленосителей.
Полученные данные входят в определенное противоречие с представлением о ведущей роли в формировании противоопухолевого эффекта иммунных реакций, опосредуемых Т-хелперами 1-го типа [7, 12]. По-видимому, вклад той или иной ветви иммунного ответа в противоопухолевый эффект может значительно варьировать в зависимости от особенностей как вакцины, так и вакцинируемого объекта.
Ранее было показано, что иммунизация меланомных пациентов клеточной вакциной, содержащей мышиные меланомные и карцином-ные ОАА, приводила к значимому увеличению концентрации в сыворотках как ИФ-гамма, так и ИЛ-4 [1, 11]. Сходные данные были получены при исследовании вакцинированных пациентов с опухолями желудочно-кишечного тракта [2, 10]. Ксеновакцинотерапия, по-видимому, активизирует у пациентов иммунные процессы, опосредуемые Т-хелперами как 1-го, так и 2-го типа. Это утверждение согласуется с опубликованными данными, свидетельствующими о генерации клеточных и гуморальных иммунных реакций у ксеновакцинированных пациентов [10, 11]. Человек и мышь - дискордантные по отношению к друг другу виды. Это означает, что при попадании в организм человека мы-
шиные клетки опсонизируются естественными (пресуществующими) антителами и далее посредством опосредуемого Fc-рецепторами фагоцитоза попадают в профессиональные антиген-презентирующие клетки (макрофаги, дендритические клетки). Активное вовлечение этих клеток в процессинг чужеродного материала и презентацию ОАА в комплексе с продуктами главного комплекса гистосовместимости как II, так и I класса может быть важным элементом в механизме генерации у человека противоопухолевых иммунных реакций, опосредуемых Т-хелперами 1-го типа [4, 9]. У мышей нет пред-существующих антител к антигенам человека. Это подразумевает возможность относительно длительной персистенции интактных человеческих ОАА в организме мыши. Возможно, что такая персистенция создает благоприятные условия для более эффективного вовлечения в иммунный процесс Т-хелперов 2-го типа и В-клеток и обеспечивает превалирование этой ветви иммунного ответа над иммунными реакциями, опосредуемыми Т-хелперами 1-го типа и цитотоксическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ).
Известно, что большинство ОАА (продукты генов mAgE, BAGE, GAGE, RAGE, белки теплового шока, онкофетальные антигены и др.) относятся к так называемым общим ОАА, которые могут экспрессироваться на опухолях разного гистогенеза. Такое антигенное сходство разных опухолей, по-видимому, является следствием вовлечения сходных внутриклеточных механизмов в процессы малигнизации разных типов клеток. Теоретически это означает, что одна и та же ксеногенная полиантигенная вакцина может быть эффективно использована в лечении разных опухолевых заболеваний. Представляется также важным то, что антигенный состав ксеновакцины может быть расширен или изменен в зависимости от решаемых за-
дач. Высокая иммуногенность ксеновакцины, технологичность и относительная дешевизна ее получения открывают, по нашему мнению, широкие перспективы для ее практического применения в будущем.
ЛИТЕРАТУРА
1. Селедцов В.И., Фельде М.А., Самарин Д.М. и др. Иммунологические и клинические аспекты применения ксеновакцинотерапии в лечении меланомы // Российский онкологический журнал. 2006. № 4. C. 23-29.
2. Фельде М.А., Самарин Д.М., Ница Н.А. и др. Оценка клеточной иммунореактивности при ксеновакцинотерапии пациентов с IV стадией колоректального рака // Медицинская иммунология. 2006. № 1. C. 67-72.
3. Bergman P.J., McKnight J., Novosad A. et al. Long-term survival of dogs with advanced malignant melanoma after DNA vaccination with xenogeneic human tyrosinase: a phase I trial // Clin. Cancer Res. 2003. Vol. 9. P. 1284-1290.
4. Galili U., LaTempeD.C. Natural anti-Gal antibody as a universal augmenter of autologous tumor vaccine immunogenicity // Immunology Today. 1997. Vol. 18. P. 281-285.
5. Hawkins W.G., Gold J.S., Blachere N.E. et al. Xenogeneic DNA immunization in melanoma models for minimal residual disease // J. Surg. Res. 2002. Vol. 102. P. 137-143.
6. Houghton A.N., Gold J.S., Blachere N.E. Immunity against cancer: lesions learned from melanoma // Curr. Opin. Immunol. 2001. Vol. 13. P. 134-140.
7. Kochenderfer J.N., Gress R.E. A comparison and critical analysis of preclinical anticancer vaccination strategies // Exp. Biol. Med. (Maywood). 2007. Vol. 232. P. 1130-1141.
8. Naftzger C., Takechi Y., Kohda H. et al. Immune response to a differentiation antigen induced by altered antigen: a study of tumor rejection and autoimmunity // PnAs. 1996. Vol. 93. P. 14809-14814.
9. Rafiq K., Bergtold A., Clynes R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity // J. Clin. Invest. 2002. Vol. 1. P. 71-79.
10. Seledtsov V.I., Niza N.A., Surovtseva M.A. et al. Xenovac-cinotherapy for colorectal cancer // Biomed. Pharmacother. 2007. Vol. 61. P. 125-130.
11. Seledtsov VI., Shishkov A.A., Surovtseva M.A. et al. Xeno-vaccinotherapy for melanoma // Eur. J. Dermatol. 2006. Vol. 16. P. 655-661.
12. SioudM., Sorensen D. Generation of an effective anti-tumor immunity after immunization with xenogeneic antigens // Eur. J. Immunol. 2003. Vol. 33. P. 38^5.
13. Steitz J., Bruck J., SteinbrinkK. et al. Genetic immunization of mice with human tyrosinase-related protein 2: implications for the immunotherapy of melanoma // Int. J. Cancer. 2000. Vol. 86. P. 89-94.
14. Weber L.W., Bowne W.B., Wolchok J.D. et al. Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA // J. Clin. Invest. 1998. Vol. 102. P. 1258-1264.
Поступила 10.07.08
