CC BY
77
Спивак И.М.1,2,3 Слижов П.А.1,4 Плескач Н.М.1, Ныров В.А.3, Панферов Е.В.12, Михельсон В.М.1
ПРЕОДОЛЕНИЕ УСКОРЕННОГО И ЕСТЕСТВЕННОГО СТАРЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ ГЕРОПРОТЕКТОРОВ
1 Институт цитологии РАН, 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4; 2 Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, СПб., Университетская наб., 7-9;3 Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, 195251, СПб., Политехническая ул., 29; 4 Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена, 191186, СПб., набережная реки Мойки, 48.
Резюме
Синдром Коккейна - редкое аутосомно-рецессивное заболевание, являющиеся типичной болезнью ускоренного старения (прогерией). Первичные фибробласты, полученные из кожи больных синдромом Коккейна, демонстрируют высокий уровень маркеров старения и выраженное нарушение митохондриальных сетей. Эти признаки сходны с признаками старения, характерными для первичных фибробластов, полученных от донора преклонного возраста (80 лет). Добавление в среду для культивирования клеток геропротекторов различного механизма действия - специализированного антиоксиданта, адресованного в митохондрии SkQ1 и антидиабетического бигуанида, непрямого ингибитора TOR-киназы метформина - уже через месяц приводит к уменьшению количества ассоциированной со старением бэта-галактозидазы и восстановлению митохондриальных сетей. Ключевые слова: старение, геропротекторы, метформин, SkQ1, SA-0-Gal, синдром Коккейна, прогерии, митохондрии
Abstract
Spivak I.M., Slizhov P.A., Pleskach N.M., Nyrov V.A., Panferov E.V., Michelson V.M. Overcoming Accelerated and Natural Aging with Geroprotectors. Cockayne syndrome is a rare autosomal recessive disorder, a typical disease of accelerated aging (progeria). Primary fibroblasts obtained from the skin of patients with Cockayne syndrome show a high level of aging markers and a pronounced impairment of the mitochondrial networks. These signs are similar to the signs of aging
characteristic of primary fibroblasts obtained from an elderly donor (80 years). The addition of geroprotectors of a different mechanism of action to the culture medium — a specialized antioxidant addressed in mitochondria SkQ1 and antidiabetic biguanide, an indirect inhibitor of TOR kinase metformin — already a month later leads to a decrease in the amount of senescence associated beta-galactosidase (SA-P-gal) and the restoration of mitochondrial networks.
Key words: aging, geroprotectors, metformin, SkQ1, SA-P-Gal, Cockayne syndrome, progeria, mitochondria/
Введение
Первичные нетрансформированные клеточные культуры изменяются с каждым пассажем: возрастает время удвоения популяции, меняется морфология клеток, различия между клетками постепенно увеличиваются, приводя к появлению разных субпопуляций, в первую очередь - субпопуляции старых клеток. Это более крупные, менее вытянутые округлые клетки, которые принято считать более старыми по сравнению с более мелкими молодыми. Постепенно более крупных клеток становится все больше, деление клеток в популяции практически останавливается [1,2]. Появляются и получившие общее название «маркеров старения» биохимические маркеры, характеризующие стареющие клетки в культуре. Моделью для выявления маркеров старения обычно служат первичные фибробласты кожи людей различного возраста и больных прогериями (синдромы Хатчинсона-Гилфорда и Вернера) или синдромами с признаками ускоренного старения, называемыми также «сегментарными прогериями» (атаксия-телангиэктазия, синдром Секкеля, синдром Коккейна и др.), подробно разобранными в обзоре В.М. Михельсона [3]. В таких фибробластах выявляется гораздо большее количество маркеров старения, чем в фибробластах молодых здоровых доноров [4]. Совокупность маркеров старения на клеточном уровне, фиксирует изменения хроматина, ядерного и цитоплазматического скелета, уровень нерепарированных повреждений ДНК и т.п (Spivak et al., 2018).
Самым первым из предложенных маркеров старения была лизосомная
ассоциированная со старением Р-галоктозидаза (SA-P-gal), активность которой
резко повышена в клетках старых доноров и стареющих клеточных линий [6, 7].
Этот маркер не утратил своего значения и активно используется в онкологии.
Повышенный уровень SA-P-gal в биопсийном материале может служить
серьезной базой для прогноза течения заболевания. На примере аденомы
134
гипофиза показано, что присутствие SA-b-gal и других маркеров старения
объясняет то, что опухоли данного типа преимущественно неинвазивны и не
метастазируют [8]. Традиционно увеличение маркеров старения связывают с
падением активности процессов репарации ДНК. [9] Исследования последних
десятилетий показали, что клеточное старение следует рассматривать как
комплекс гетерогенных, но взаимосвязанных механизмов, в которых прямо, или
опосредовано, задействованы продукты генов, дефектных при прогериях, таких
как WRN, LMNA и ATM [10]. Количество таких клеток может служить
показателем количества «старых» клеток. Изучая динамику формирования
различных маркеров старения, мы видим, что большинство маркеров старения
связаны между собой, так как отражают разные стороны одного и того же
процесса и должны описываться совместно. Появление большого количества
клеток, несущих одновременно несколько маркеров старения, может быть
признаком формирования популяции сенесцентных клеток, количество которых
в конечном счете и запускает процесс старения в определенной ткани и - шире -
на уровне организма. В исследовании, в котором участвовали многочисленные
группы добровольцев, достаточные для корректной статистической обработки
авторы делают заключение о совместном появлении различных маркеров
старения и связи их количества с биологическим возрастом, причем надежность
этой связи возрастает с увеличением возраста респондентов [11]. Таким образом,
для пилотного исследования можно выбрать один или два маркера старения и
интерполировать полученные данные на процесс старения в целом.
Изучение возможности влияния на процессы старения различными
медикаментозными препаратами - геропротекторами - сейчас является одной из
важных теоретических и прикладных задач молекулярной геронтологии и
гериатрии. Одним из таких препаратов является метформин, терапевтический
потенциал которого выходит далеко за рамки лечения диабета. Появляется все
больше данных, демонстрирующих роль этого препарата в терапии множества
заболеваний, включая рак и кардиоваскулярную патологию. Кроме того,
имеются доказательства того, что метформин замедляет процесс старения и
модулирует микробиоту, которая, как известно, имеет огромное значение для
поддержания здоровья человека [12, 13]. Метформин обладает комплексным
механизмом действия, вызывая широкий спектр физиологических эффектов.
Последние исследования показали, что метформин замедляет старение у червей,
изменяя у их кишечного микробиома метаболизм фолата и метионина [14].
Немаловажно, что метформин увеличивает продолжительность жизни C. elegans
135
путем индукции компенсаторного стресс-ответа, опосредованного AMPK и главным регулятором антиоксидантной системы NRF2 [15,16]. Метформин повышает чувствительность тканей к инсулину, снижает уровни липопротеинов низкой плотности и холестерина без снижения калорийности пищи [17]. SkQ1 -антиоксидант, адресованный в митохондрии, был синтезирован и подробно изучается В.П.Скулачевым с сотрудниками [18]. В последнее время вышло несколько подробных обзоров, описывающих его свойства и геропротекторное действие на различных экспериментальных моделях [19,20,21]. Среди новых данных о функциях SkQ1 наиболее интересными и неожиданными представляются данные об антибактериальной активности данного антиоксиданта [22].
SkQ1 широко используется сейчас в качестве геропротектора не только в офтальмологии, но и в косметологии, при этом продолжаются его фундаментальные углубленные исследования: показано, что в определенных условиях SkQ1 может подавлять рост опухолевых клеток [23]. В качестве основной модели нами выбраны клетки больных с синдромом Коккейна, которые могут служить надежной моделью для изучения ускоренного старения. Нами порказано, что по наличию в клетках больных всех маркеров старения синдром Коккейна может считаться истиной прогерией [24].
Материалы и методы Первичные культуры фибробластов
В лаборатории радиационной цитологии получены клеточные линии здоровых доноров 25 лет 8SP и 75 лет 10 SP, а также больных с синдромом Коккейна 7 лет Cs4SP и 13 лет Cs5SP.
Получение первичной культуры фибробластов кожи проводилось
посредством стандартной методики: биоптат кожи из области предплечья донора
5x5 мм механически диспергировался. Полученные фрагменты кожи помещали
в чашку Петри под покровное стекло в полную ростовую питательную среду
МЕМ (Sigma, США) с добавлением 16% сыворотки эмбрионов коров (Sigma,
США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gib^, США),
25мкг/мл фунгизона и 0,3 мг/мл Ь-глутамина. Материал инкубировали, меняя
питательную среду 1 раз в 4-7 сут, до достаточной конфлюенции фибробластов.
При достижении необходимого монослоя клетки снимали с подложки с
помощью 0,25%-ного раствора трипсин-ЭДТА (Gib^, США) и вели дальнейшее
культивирование в пластиковых флаконах и на чашках Петри (Nunclon, США) в
136
среде MEM (Sigma, США) с добавлением 12% фетальной сыворотки групного рогатого скота (Sigma, США), 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США) при +37 °С в атмосфере с содержанием 5% С02.
Определение активности ассоциированной со старением ß-галактозидазы
Активность SA-ß-Gal выявляли с использованием фирменного набора «Senescence-galactosidase staining kit» (Cell Signalling Thecnology, США) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Клетки на чашках Петри промывали PBS, фиксировали в течение 10 мин. при комнатной температуре 1-кратным фиксирующим раствором, после чего дважды промывали PBS и окрашивали в окрашивающем растворе при 37 Со в течение ночи. Об активности SA-ß-Gal судили по появлению синих гранул в цитоплазме клеток, оценивали визуально.
Выявление митохондриальных сетей
Прижизненная окраска проводится MitoTracker® Green FM и MitoTracker®OrangeCMTMRos. (Thermo Fisher Scientific) в концентрации 25-500 нМ в бессывороточной среде. Время инкубации 45 минут, прижизненная съёмка на конфокальном микроскопе Leica TCS SP5. Обработка микрофотографий в программе ImageJ ( National Institutes of Health, USA) методом определения интенсивности флуоресценции.
Статистическая обработка.
Статистическую обработку результатов проводили в программном пакете Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, 2010). Использованные методы: расчёт средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, определение значения статистических различий между отдельными клеточными линиями при помощи t-критерия Стьюдента.
Результаты.
В культуральную среду, на которой вели первичные фибробласты всех исследованных линий были добавлены митотрекеры - SkQ1 и метформин в концентрации 0.1 нМ. Клетки культивировали в таких условиях в течение 6 недель.
В начале эксперимента (нулевая точка) и в конце клетки были окрашены для
выявления SA-ß-Gal и проанализированы. В нулевой точке количество SA-ß-Gal
137
в клетках здорового донора было существенно ниже, чем в клетках пожилого донора и больных с синдромом Коккейна, то есть в соответствии с этим маркером старения его клетки были «молодыми», а клетки пожилого донора и больных синдромом Коккейна - «старыми». За 6 недель ведения эти данные немного выросли, но принципиально не изменились, так как это небольшой срок для того, чтобы процесс старения выражено усилился. Наиболее выраженным эффект постарения был у линии сб58р. В тоже время после действия геропротекторов уровень 8Л-Р-Оа1 в клетках всех изученных линий резко снизился. Особенно выраженным это снижение было в линии сб48р под действием 8к^1. Данные представлены на рис.1. Видно, что ведение с геропротекторами в течение 6 недель приводит к проявлению существенно более молодого фенотипа, причем эффект виден как в клетках здорового донора, так и больных синдромом Коккейна, но степень выраженности этого фенотипа выше в клетках пожилого донора и больных сб, чем в клетках молодого донора.
Р ■
Г ■
I 85Р (25 лет) I ЮБР (75 лет) СгДБР (7 лет) I Сб55Р (13 лет)
Нулевая точка Без воздействия Метформин ОД нМ 5кО ОД нМ
Рис. 1. Доля клеток с высоким уровнем 8А-р^а1 в исследуемых линиях через 6 недель воздействия
При исследовании при тех же условиях выраженности митохондриальных сетей и активности митохондрий в исследуемых клетках было обнаружено, что
объем митохондриальной сети в клетках 8БР (молодой здоровый донор) без действия митотрекеров немного снижается за 6 недель эксперимента, а под их воздействием остается на уровне нулевой точки. В тоже время в клетках 10 БР (пожилой здоровый донор) без воздействия объем митохондриальной сети сохраняется, а при действии обоих геропротекторов резко снижается. Вероятно, митохондриальные сети в этих клетках недостаточно устойчивы, и любое сильное воздействие может эту устойчивость нарушить. В клетках Сб48Р и Сб58Р (больные с синдромом Коккейна) под действием метформина происходит небольшое уменьшение объема митохондриальной сети по сравнению с клетками, росшими 6 недель без воздействия, но под действием 8к^1 происходит резкое увеличение даже по сравнению с нулевой точкой. Вероятно, это связано с тем, что 8к^1 - антиоксидант работающий именно в митохондриях. Данные представлены на рис.2.
100
90 *
80 I
70 *
60 II 11 Т 1 * ■ 8БР (25 лет) в ЮБР (75 лет)
50 н Ж" 7Ь * 1 * * 1 1
40 н * * ■ СбДБР (7 лет) ■ С55БР (13 лет)
30 20 1 И В —
10 о —
Нулевая точка Без воздействия 1 Метформин ОД нМ БкШ ОД нМ
Рис 2. Объём митохондриальной сети в клетках через 6 недель эксперимента
Если мы будем оценивать изменения энергетической системы клетки не по объему митохондриальной сети, а по активности митохондрий, то картина будет сходной, но несколько иной. Также во всех клетках наблюдается снижение активности митохондрий под действием метформина и резкое повышение ее под действием 8к^1. В клетках пожилого донора, в которых мы наблюдали
снижение объёма митохондриальной сети при ведении в течение 6 недель без воздействия, мы в этой же точке наблюдаем возрастание активности митохондрий, вероятно, это компенсатторноая реакция. То есть «рассыпание» митохондриальной сети приводит к повышению активности отдельных митохондрий. Эти данные, безусловно, требуют дальнейшего изучения. Результаты представлены на рис.3.
Рис. 3. Активность митохондрий в клетках через 6 недель эксперимента
То, что во всех изученных линиях и метформин и SkQ1 приводят к выраженному снижению количества «старых» клеток с SA-0-Gal, подтверждает геропротекторные свойства обоих веществ. В тоже время исследование состояния энергетического аппарата клетки соответствует данным о том, что метформин снижает интенсивность общего обмена, выступая в качестве модели «снижения калорийности питания» (caloric restriction), а SkQ1 напротив,
повышает активность работы митохондрий. Благодарности
Авторы искренне благодарны академику В.П.Скулачеву за предоставленную возможность использовать SkQ1.
Список литературы
1. Mikhelson V.M. Replicative mosaicism might explain the seeming contradictions in trhe telomere theory of aging // Mech. Aging and Devel. 2001. Vol.122. P.1361-1365.
2. Lorenzini A, Tresini M, Austad SN, Cristofalo VJ. 2005. Cellular replicative capacity correlates primarily with species body mass not longevity. Mech Ageing Devel. 2005. Vol. 126. P. 1130-1133.
3. Михельсон В.М. Наследственное преждевременное старение человека // Клин. геронтол. 1996. Т.4. С. 29-35.
4. Scaffidi P., Misteli T. Lamin A-Dependent Nuclear Defects in Human Aging. // Science. 2006. Vol.312. P.1059-1063.
5. Spivakl., Mikhelson V., Pleskach N., Zakharchuk A., Smirnova T. andS pivak D. 2017. Ageing Markers in Primary Fibroblasts of Healthy Middle Aged Persons and their Psychological Correlates: Review and Four Case Studies . SM Journal of Neurology and NeuroscienceVol. 3, issue 2 http://smjournals.com/neurology-neuroscience/in-press.php
6. Dimri G.P., Lee X., Basile G. et al. That identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995, Vol. 92, P 9363-9367.
7. 7.Lee B.Y., Han J.A., Im J.S., et al. Senescence-associated P-galactosidase is lysosomal P-galactosidase //Aging cell. 2006. Vol.5. Р. 187-195.
8. Sabatino ME, Petiti JP, Sosa Ldel V, et al. Evidence of cellular senescence during the development of estrogen-induced pituitary tumors//Endocr Relat Cancer. 2015. Vol. 22(3). Р. 299-318.
9. Ikeda Y, Kumagai H, Motozawa Y, et al. Understanding Vascular Diseases: Lessons From Premature Aging Syndromes // Can J Cardiol. 2016. Vol. 32(5). Р.650-8.
10. 10 Ramirez C. L., Cadinanos J., Varela I., et al. Human progeroid syndromes, aging and cancer: new genetic and epigenetic insights into old questions // Cel. Mol.Life Sci., 2007. Vol. 64. Р.155-170.
11. Waaijer ME, Croco E, Westendorp RG et al. DNA damage markers in
141
dermal fibroblasts in vitro reflect chronological donor age // Aging (Albany NY). 2016. Vol. 8(1). P.147-57.
12. Pryor R., Cabreiro F. Repurposing metformin: an old drug with new tricks in its binding pockets. Biochem J. 2015 Nov 1; 471 (3): 307 - 322
13. Tseng CH Metformin reduces gastric cancer risk in patients with type 2 diabetes mellitus. Aging (Albany NY). 2016 Aug;8(8):1636-49.
14. Cabreiro F., Au C., Leung K.Y., Vergara-Irigaray N., Cocheme H.M., Noori T., Weinkove D., Schuster E., Greene N.D., Gems D. Metformin retards aging in C. elegans by alteringmicrobial folate and methionine metabolism. Cell. 2013 Mar 28; 153 (1): 228 - 39;
15. Onken B., Driscoll M. Metformin induces a dietary restriction-like state and the oxidative stress response to extend C. elegans Healthspan via AMPK, LKB1, and SKN-1. PLoS One. 2010 Jan 18; 5 (1): e8758;
16. De Haes W., Frooninckx L., Van Assche R., Smolders A., Depuydt G., Billen J., Braeckman B.P., Schoofs L., Temmerman L. Metformin promotes lifespan through mitohormesis viathe peroxiredoxin PRDX-2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jun 17; 111 (24): E2501 - 9;
17. Anisimov V.N. Metformin: do we finally have an anti-aging drug? Cell Cycle 2013, 12, 3483-3489;
18. Skulachev VP, Anisimov VN, Antonenko YN, Bakeeva LE, Chernyak BV, Erichev VP, Filenko OF, Kalinina NI, Kapelko VI, Kolosova NG, Kopnin BP, Korshunova GA, Lichinitser MR, Obukhova LA, Pasyukova EG, Pisarenko OI, Roginsky VA, Ruuge EK, Senin II, Severina II, Skulachev MV, Spivak IM, Tashlitsky VN, Tkachuk VA, Vyssokikh MY, Yaguzhinsky LS, Zorov DB. 2009. An attempt to prevent senescence: A mitochondrial approach. Biochim Biophys Acta. 1787:437-461.
19. Feniouk BA, Skulachev VP .2017. Cellular and Molecular Mechanisms of Action of Mitochondria-Targeted Antioxidants. Curr Aging Sci. ;10(1):41-48.
20. Korshunova GA, Shishkina AV, Skulachev MV. 2017. Design, Synthesis, and Some Aspects of the Biological Activity of Mitochondria-Targeted Antioxidants. Biochemistry (Mosc). 82(7):760-777. doi: 10.1134/S0006297917070021.
21. Lukashev AN, Skulachev MV, Ostapenko V, Savchenko AY, Pavshints ev VV, Skulachev VP. 2014. Advances in development of rechargeable mitochondrial antioxidants. Prog Mol Biol Transl Sci. 127:251-65. doi: 10.1016/B978-0-12-394625-6.00010-6.
22. Nazarov PA, Osterman IA, Tokarchuk AV, Karakozova MV, Korshunova GA, Lyamzaev KG, Skulachev MV, Kotova EA, Skulachev VP, Antonenko YN. 2017. Mitochondria-targeted antioxidants as highly effective antibiotics. Sci Rep. 7(1):1394. doi: 10.1038/s41598-017-00802-8.
23. Shagieva G, Domnina L, Makarevich O, Chernyak B, Skulachev V, Dugina V. Depletion of mitochondrial reactive oxygen species downregulates epithelial-to-mesenchymal transition in cervical cancer cells. Oncotarget. 2016 Nov 25. [Epub ahead of print]
24. Слижов П.А., Долинина Т.И., Плескач Н.М., Жеребцров С.В., Булатникова М.А., Михельсон В.М., Спивак И.М. 2018. Маркеры старения в клетках больных синдромом Коккейна. Общие и индивидуальные различия. Цитология, 60(3):188-199. (Markers of Aging in Cells of Patients with Cockayne Syndrome. General and Individual Differences, P. A. Slizhov, T. I. Dolinina, N. M. Pleskach, S. V. Zherebtsov, M. A. Bulatnikova, V. M. Mikhelson, I. M. Spivak, Cell and Tissue Biology, 12(4), 296-306 DOI 10.1134/S1990519X18040090.)
С.С.Сулакшин,
д-р физ.-мат. наук, д-р полит. наук, проф.
РОССИЙСКОЕ ГОСУДАРСТВО ПРЕВРАЩАЕТСЯ В КРИМИНАЛЬНОЕ
Центр научной политической мысли и идеологии, Москва
В работе сведены некоторые результаты изучения природы современного политического режима и государства, как института в России периода путинизма.
Криминальное государство — это институт, который не выполняет собственные законы, не уважает международное право и, добавлю ещё, создаёт квази-право, преференционное в отношении собственного режима для его самовоспроизводства. Как любой криминальный организм оно тяготеет к гипертрофии монополии единоначалия (монополия власти) и к тотальному контролю сетевых проекций. История показывает, что такого рода организационные мутанты исторически недолговечны, заканчивают плохо и поэтому превращение современного российского государства в криминальное, то есть преступное, — это угроза стране, требующая научного осмысления|, общественного осознания и, естественно, активности.
143
