CC BY
27
mit gleitflachen aus Al2O3-keramic // Biomed. Tech. — 1980. — Vol. 25 — P. 165-168.
14. Streicher R.M. Tribologie künstlicher gelenke // In: Endoprothetik / Ed. by E.W. Morscher/ — Berlin-
Springer, 1995. — P. 38-53.
15. Zichner L.P., Willert H.G. Comparison of alumina-polyethylene and metal-polyethylene in clinical trials // Clin. Orthop. — 1992. — Vol. 282. — P. 86-94.
Поступила 17.11.2005
УДК 577.152.1.03:577.112.4:577.217:543.42
ПРЕИМУЩЕСТВА ПЕРИПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ И «КАССЕТНОГО» МУТАГЕНЕЗА В ТЕХНОЛОГИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
Ю.Г. Походня, Т.А. Скрягина, А.Г. Лапко Международный государственный экологический университет им А.Д. Сахарова
Гомогенные, биологически активные фармакологические препараты могут быть получены практически в неограниченных количествах биотехнологическими методами. Технология получения рекомбинантных белков постоянно совершенствуется по направлениям повышения уровня экспрессии и сокращения стадий очистки протеина. Предложен метод однастадийного клонирования рекомбинантного Ы1в-Та§ фьюжен адренодоксина с сохранением преимуществ вектора для периплазматической его экспрессии. Подобрана система детергентов для эффективного лизиса бактериальных клеток.
Ключевые слова: адренодоксин, клонирование, периплазматическая экспрессия, смесь детергентов, аффинная хроматография.
ADVANTAGES OF PERIPLASMATIC EXPRESSION AND «CASSETTE» MUTAGENESIS OF RECOMBINANT PROTEINS TECHNOLOGY
Y.G. Pohodnya, T.A. Skrahina, A.G. Lapko International Sakharov Environmental University
Biotechnology methods allow getting homogenous biologically active preparations in virtually unlimited quantities. Recombinant protein purification technology is being constantly improved to increase expression level and minimization of number of protein purification stages. This paper introduces the new method of one-stage recombinant His-Tag fusion adrenodoxin cloning. It keeps all vector advantages for its periplasmatic expression. In this issue, optimized detergents system for effective lysis of bacteria cells has been described.
Key words: adrenodoxin, cloning, periplasmatic expreccion, detergent mixture, affinity Tag technologies.
Основными направлениями в развитии технологии получения рекомбинантных белков остаются поиск оптимальных условий экспрессии и совершенствование методов выделения протеинов. В качестве примера перспективных решений в этой области может служить использование аффинной хроматографии, специфической для каждого типа Tag фьюжен белков, в частности, металл-хелатной хроматографии, основанной на связывании His-Tag фьюжен протеинов с двухвалентными катионами металлов, иммобилизованными на
твердой матрице. Коммерческие векторные системы, позволяющие модифицировать нуклеотидную последовательность кДНК экспансией тринуклеотидов, ответственных за синтез шести и более гистидинов, необходимых для применения металл-хелатной хроматографии, как правило, сконструированы для цитоплазматической экспрессии, которая в ряде случаев приводит к резкому снижению выхода протеина из-за его протеолиза. В таких случаях деградацию рекомбинантного белка можно значительно уменьшить, если выбрать век-
тор, позволяющий экспрессировать белок в периплазматическое пространство, или применить направленный мутагенез для введения нужной последовательности нуклеоти-дов на уже сконструированном для пери-плазматической экспрессии векторе.
В настоящей работе нами проведено исследование эффективности периплазма-тической и цитоплазматической экспрессии белков, предложен оригинальный метод одностадийной модификации векторной системы экспансией тринуклеотидов, кодирующей шесть гистидинов, и подобрана система детергенов, ускоряющая процесс лизиса бактериальных клеток.
Материалы и методы
Мутагенез вектора для цитоплазматической экспрессии адренодоксина проводили, используя ПЦР с синтезированными N-концевым праймером, 5'-GGCATGCCATGGAAGATAA-AATAACAG-3' и C-концевым праймером, 5'-GCCGTATCTGATGCCTAAGCTTGGCGC-3'; кДНК адренодоксина амплифицировали с сохранением сайтов рестрикции NcoI и HindIII соответственно. 5'-Концевые участки кДНК удлиняли олиго(dA)-последова-тельностью, используя Tag ДНК полимера-зу. Подвергнутую А-тайлингу кДНК лиги-ровали с коммерческим вектором pGEM-T Easy «Novagen», имеющим резистентность к ампицилину. Полученный вектор трансформировали в клетки E.coli, штамм JM109, и селекцию положительных клонов проводили
по скринингу белых, исключая голубые, колоний на плашке с агаром, содержащим LB-среду, ампицилин, X-Gal и IPTG. Ре-портерную плазмиду из геля экстрагировали, используя набор MiniPrep (Novagen). Полученную плазмидную ДНК расщепляли смесью рестриктаз NcoI и HindIII, инкубируя реакционную смесь при 37°С в течение ночи. Очищенные с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле фрагменты ДНК гена адренодоксина лиги-ровали с коммерческим вектором pET-28b(+) (Novagen), который предварительно лианизировали соответствующими рест-риктазами. Клоны, содержащие ДНК адре-нодоксина в pET28Adx — HisC, получили путем трансформации компетентных бактериальных клеток E.coli, штамма BL21(DE3) продуктами лигирования.
Мутагенез вектора для периплазмати-ческой экспрессии адренодоксина проводили методом «кассетного» мутагенеза исходного вектора рККAdx. На первой стадии ПЦР проводили в двух отдельных реакционных сосудах, причем в одном содержался прямой праймер, во втором — обратный праймер. Пара праймеров была синтезирована на фирме «Invitek» в соответствии с выполненным нами дизайном на основании последовательности нуклеотидов в плазмиде pKKAdx и необходимости замены шести С-концевых аминокислот в молекуле адренодоксина на шесть остатков гистидина.
Adrenodoxin 122 amino asides — Asp-Ser-Ser-Lys-Ile-Glu
128
Adrenodoxin 122 amino asides — His-His-His-His-His-His
128
Cassette mutagenesis
Forward primer (Sequens 5' - 3 )
GAG TCC ATT GAT ATG GGC AT_G CAC CAC CAC CAC CAC CAC TGA TAA GCT TGG CTG TTT TGG CGG
< 22 bases of Adx
6 His
< 22 bases of Adx
Revere primer (Sequens 5' - 3 )
CCG CCA AAA CAG CCA AGC TTA TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CAT GCC CAT ATC AAT GGA CTC
Конечный объем реакционных смесей равнялся 50 мкл, в которые было внесено по 150 нг вектора pKKAdx, 10 ркмоль соответствующего праймера, 1 ед. активности ДНК полимеразы Р/и и ПЦР коктейля.
Начало реакции инициировали нагреванием смесей до 95°С в течение 30 секунд. Дальнейшая ПЦР, состоящая из 5 циклов, проводилась по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°С в течение 30 секунд,
отжиг праймеров при 55°С в течение 1 мин и ферментативная реакция при температуре 68°С в течение 8 мин. После синтеза некоторого количества кДНК из каждой реакционной смеси отбирали по 25 мкл и смешивали в общую пробирку, добавляли 1 уд. активности Pfu полимеразы и проводили 17 циклов ПЦР по стандартной схеме. Деструкцию исходной матрицы pKKAdx проводили добавлением 10 ед. активности рестриктазы Dpnl и инкубацией смеси 2 часа при 37°С.
Клонирование проводили, используя элет-ротрансформацию 5 мкл продуктов ПЦР в 50 мкл клеток Е. coli, штамм Nova-Blue (DE3), с последующим посевом на агарозу с LB-средой, содержащей ампицилин. Скрининг положительных клонов осуществляли по картам рестрикции, выделенной плазмидной ДНК, в 1,5% агарозном геле. Вектор pKKAdx-HisC, выделенный из положительных клонов, трансформировали в компетентные бактериальные клетки Е. coli, штамма RL21(DE3).
Экспрессию и очистку рекомбинант-ного His-Tag фьюжен адренодоксина проводили из бактериальных клеток Е.соН, штамм BL21(DE3), содержащих в первом случае вектор pET28Adx-HisС, а во втором — обратный праймер, pKKAdx-His^ Клеточные культуры инкубировали в объемах 2x500 мл каждые при 37°С в течение 5-6 часов в LB-среде, содержащей канамицин
для вектора рЕТ28Аёх-КвС и ампицилин для вектора рККАёх-ИвС. После индукции синтеза белка 1 мМ ГРТО инкубацию продолжали в тех же условиях в течение еще 18 часов. Собранную центрифугированием биомассу из четырех образцов отдельно ресуспензировали в 50 мл свежеприготовленного 50мМ Трис/НС1 буфера, рН 8.0. Все последующие процедуры проводили параллельно в абсолютно одинаковых условиях для четырех образцов. Для оптимизации лизиса клеток использовали подобранную нами систему детергентов (табл. 1), состоящую из 0,2% дезоксихолата натрия и 0,1% Твина. Разрушение клеточной стенки проводили добавлением 25 ед. активности лизоцима в течение 30 мин при комнатной температуре. Гидролиз геномной ДНК осуществляли добавлением 20 ед. активности ДНКазы I, с последующей инкубацией смеси при 4°С в течение 40 мин. Критерием полноты гидролиза было исчезновение вязкости раствора. Суспензию лизата центрифугировали 30 мин при 11000 об/мин, и супер-натанты наносили на колонки с аффинной матрицей №-ЫТА, уравновешенные 50 мМ Тпв/НС1 буфером, рН 8.0, содержащего 0.2М №С1 (буфер А). Неспецифическую сорбцию белков удаляли 30 мМ имидазо-лом в буфере А. Адренодоксин элюировали с №-ЫТА 200 мМ имидазолом в буфере А.
Таблица 1
Определение конечной концентрации детергентов в растворе, оптимальной для лизиса клеток
Дезоксихолат натрия, % 3 2 2 0,5 0,25 0,2 0
Твин 80, % 0 0,75 0,5 0,25 0.2 0,1 0,2
Снижение вязкости - + + + + + -
Окончательно препараты адренодок-сина очищали с помощью ионообменной хроматографии на колонке Mono Q, FF в условиях возрастающего градиента концентрации КО от 0,2М до 1,0М. В результате очистки препараты рекомбинантного адренодоксина были получены с индексом А414/А27б, равным 0,92, что соответствует степени очистки адренодоксина по стандартной методике [1]. Количество адрено-доксина определяли, используя коэффициент молярной экстинции 10 мМ-1 для максимума поглощения при 414 нм.
Ферментативную активность двух препаратов His-Tag фъюжен адрено-доксина определяли по скорости восстановления 100 мкМ цитохрома с в 30 мМ калий фосфатном буфере. рН 7.4. Реакцию инициировали добавлением КАВРН до конечной концентрации 100 мМ. Восстановление цитохрома с измеряли по величине поглощения при 550 нм, а активность рассчитывали с использованием коэффициента экстинции, равного для восстановленного цитохрома с 20 мМ-1 см-1.
Результаты и обсуждение
Адренодоксин, электрон-транспортный белок, содержащий в качестве простатической группы железосеросодержащий кластер. Адренодоксин осуществляет перенос электронов от адренодоксин редуктазы к ци-тохрому Р-450 в процессе биосинтеза стероидных гормонов. Возможность биосинтеза стероидных биорегуляторов in vitro привело к необходимости наработки и очистки ре-комбинантных белков, компонетов стероид-гидроксилирующих систем. Введение в адренодоксин His-Tag последовательности могло значительно ускорить и повысить эффективность очистки необходимого белка.
Для конструкции вектора, дающего ци-топлазматическую экспрессию рекомби-нантного адренодоксина с His-Tag на С-конце, был выбран коммерческий вектор рЕТ-28Ь(+), резистентный к капамицину и содержащий в полилинкере нужные сайты рестрикции, Hind Ш и Nco I. Амплификация кДНК адренодоксина была проведена ПЦР, с соответствующими праймерами. Последовательность С-концевых 6 аминокислот белка была заменена последовательностью 6 гистидинов с целью сохранения длины полипептидцой цепи адрено-доксина. Продукт ПЦР подвергался обработке рестриктазами Hind III и Nco I, вносимыми в реакционную смесь как в различной последовательности, так и одновременно, но лигирование рестрикта с ли-неализированным вектором рЕТ-28Ь(+) не давало положительного результата. Невозможность получения липких концов у кДНК адренодоксина, вызванное, по-видимому, недостаточной длиной последовательности нуклеотидов в гене, привело к необходимости проведения А-тайлинга продукта ПЦР с использованием pGEM-Т Easy вектора для лигирования модифицированного рестрикта. Селекция положительных клонов трансформированных JM 109 клеток была проведена с помощью скрининга белых, исключая отрицательные голубые колонии, после индукции IPTG, высеянных на агарозу клеток в LB-среде, содержащей X-Gal. Обработка амплифицированного вектора, pGEM-T-Adx, рестриктазами Hind III и Nco I позволила выделить кДРК адрено-доксина, способную к лигированию с ли-неализированным теми же рестриктазами рЕТ-28Ь(+) вектором.
Трансформация вектора, содержащего кДНК адренодоксина, была проведена в высоко амплифицируемый штамм Е. coli клеток, BL21(DE3). Процедура экспрессия His-Tag фьюжен адреподоксииа не отличалась от стандартной, а выделение и очистка белка состояли из двух стадий: лизиса клеток и металл-хелатной хроматографии. После этих стадий степень очистки адрено-доксина составляла приблизительно 85-90%. Ионообменная хроматография на MonoQ FF колонке в градиенте концентрации КС1 позволила получить гомогенный препарат. По сравнению с традиционной схемой очистки рекомбинантного адренодоксина, включающей четыре стадии: два сульфат аммонийного фракционирования, гидрофобную хроматографию на Butyl-Sepharose и ионообменную хроматографию — процесс очистки фьюжен His-Tag адренодок-сина был значительно короче и по количеству стадий (всего 2), и по времени их проведения, но не уступал по эффективности. Ферментативная активность обоих препаратов белка (с гистидинами на С-конце и без них) в анализе их восстанавливающей способности с цитохромом с была одинакова и равнялась 490 мМ-1мин. Единственным недостатком экспрессии адренодок-сина в рЕТ-28Ь(+) векторе было восьмикратное снижение выхода адренодоксина по сравнению с экспрессией белка в тех же бактериальных клетках, трансформированных исходной плазмидой pKKAdx (табл. 2). Одной из причин столь значительного снижения выхода мутированного белка могла быть цитоплазматическая экспрессия адренодоксина, который, по-видимому, чувствителен к цитоплазматическим протеазам. Такое предположение можно было сделать, основываясь на факте, что исходный вектор, pKKAdx, содержал конструкт, ответственный за периплазматическую экспрессию адренодоксина (рис. 1).
Оригинальный вектор, pKKAdx, для экспрессии рекомбинантного адренодоксина был сконструирован так, что секреция вновь синтезируемого полипептида происходила в периплазматическое пространство бактерии, где сигнальный пептид отщеплялся с сохранением N-концевой последовательности экс-прессируемого протеина. В периплазме белок в большей степени защищен от действия ци-тозольных протеаз и поэтому выход реком-
бинантного продукта значительно выше. Следовательно, получение фьюжен К8-Та§ адренодоксина необходимо было проводить с
сохранением преимуществ оригинальном плазмиды, рККЛёх, обеспечивающей пери-плазматическую экспрессию протеина.
(а) (б)
Рис. 1. Конструкция плазмиды pKKAdx (а) и коммерческого вектора рЕТ-28Ь(+) (б).
Технология QCM (QuikChange Site-Directed Mutagenesis Sistem) позволила за одну стадию провести «кассетный» мутагенез гена адренодоксина, не изолируя его из оригинальной плазмиды pKKAdx [2]. Особенностью этого метода является проведение нескольких циклов реакции ПЦР (2-5) с единичными мутагенными прайме-рами, что позволяет избежать преимущественной димеризации праймеров друг с другом, увеличивая вероятность их взаимодействия с вектором. Вновь синтезированная гибридная плазмида, содержащая одну исходную цепь нуклеотидов, а другую — вновь синтезированную мутированную, способна более эффективно взаимодействовать с комплементарным мутагенным праймером, тем самым приводя к амплификации модифицированного вектора. DpnI рестриктаза, на 100% гидролизуя
исходный метилированный вектор, к сожалению, не всегда расщепляет метилированный аденин, если тот присутствует в плазмиде, поэтому часть ампицилин-резис-тентного векторного материала не является трансформированным (мутированным), за счет чего эффективность мутагенеза снижается от 65-95%. Выбор положительных клонов осуществляли по дополнительному сор-тингу резистентных к ампицилину клонов по их рестрикционным картам.
Экспрессия, выделение и очистка His-Tag фьюжен адренодоксина, после мутагенеза вектора рККЛёх, были проведены по вышеописанной методике. Количественный анализ очищенного препарага белка показал, что выход адренодоксина с His-Tag на С-копце в условиях периплазматической экспрессии равнялся выходу немутированного рекомби-нантного адренодоксина (табл 2.)
Таблица 2
Количество рекомбинантного адренодоксина, выделяемого при гетерологической его экспрессии в векторе рККAdx и после клонирования
Рекомбинантный немодифи-цированный адренодоксин (пе-риплазматическая экспрессия) His-TagC модифицированный адренодоксин в рЕТ векторе (ци-топлазматическая экспрессия) His-TagC модифицированный адренодоксин в рККAdx векторе (периплазматическая экспрессия)
1,0-1,4 мкмоль/литр 120-180 нмоль/литр 1,2-2,0 мкмоль/литр
Еще одной проблемой, с которой часто сталкивается экпериментатор при выделении рекомбинантных белков из бактериальных клеток, является высокая вязкость лизата клеток из-за большого количества геномной ДНК. Одним из способов снижения вязкости раствора лизата является применение ДНКазы I с добавлением в среду детергента. Например, в случае ре-комбинантного адренодоксина для повышения растворимости фрагментов ДНК применяли большие концентрации дезок-сихолата натрия. Экспериментально нами было установлено, что использование смеси детергентов значительно повышает растворимость фрагментов ДНК, что значительно снижает вязкость лизатов и увеличивает степень деградации нуклеиновой кислоты. Следует отметить, что смесь ли-зоцима с ДНКазой I в растворе 0,2% дезок-сихолата натрия и 0,1% Tween 80 в лизис буфере особенно полезна при поиске высокопродуктивных клонов, проводимом с помощью электрофореза белков в ПААГ.
Выводы
Применение технологии QCM на векторе рККAdx, ответственного за эндоплаз-матическую экспрессию белка, и смеси детергентов при лизисе бактериальных клеток позволили получить гомогенный препарат рекомбинантного His-Tag фьюжен адренодоксин с высоким выходом. Анализ ферментативной активности выделенного адренодоксина с His-Tag на С-конце и способности его к белок-белковому взаимо-
действию с адренодоксин редуктазой и ци-тохромом P-450 scc показал, что выделенный препарат не уступает по этим параметрам рекомбинантному белку, полученному традиционным методом, и может успешно использоваться для биосинтеза препаратов стероидных гормонов.
Заключение
Использование технологии QCM является высокоэффективным методом направленного «кассетного» мутагенеза, который позволяет за одну стадию модифицировать ген, не изолируя его из оригинального вектора. Для получения рекомбинантных белков, отличающихся высокой чувствительностью к протеолитическому расщеплению, следует использовать векторы, обеспечивающие секрецию вновь синтезируемого полипептида в периплазматическое пространство бактерии. Применение различных видов Tag, имеющих аффинность к специфическим матрицам, и смеси детергентов в процессе лизиса бактериальных клеток значительно сокращает время очистки белка и повышает его выход.
ЛИТЕРАТУРА
1. Uhlmann H., Beckert V., Schwarz D. and Bernhardt R. Expression of bovine adrenodoxin in E. coli and site-directed mutagenesis of [2Fe-2S] cluster ligands, Biochem. Biophys // Res. Commun. — 1992. — Vol. 188. — P. 1131-1138.
2. Wang W. and Malcolm B.A. Two-Stage PCR protocol allowing introduction of multiple mutations, deletions and insertions using QuikChange Site-Direction Mutagenesis // BioTechniques. — 1999. — Vol. 26. — № 4. — Р. 680-682.
Поступила 02.12.2005
