CC BY
56
БИОХИМИЯ, БИОТЕХНОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ
УДК579.64: 631.85
А. И. Ахметова, А. Д. Сулейманова, Н. П. Балабан, А. А. Тойменцева, И. И. Каюмов, Е. О. Михайлова, М. Р. Шарипова
КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА ФИТАЗЫ БАЦИЛЛ
Ключевые слова: фитаза, кормовая добавка, клонирование, вектор экспрессии.
С целью получения рекомбинантного штамма с высоким уровнем экспрессии фитазыбацилл был проведен подбор оптимальной системы экспрессии. Векторы серииpQLink на основе плазмидыpQE-2 (pQlinkH, pQLinkG), а также векторpTZ57R/T оказались не эффективными для для клонирования гена фитазыбацилл. Использование экспрессионной системы pET позволило получить рекомбинантный штамм Escherichiacoliс экспрессией гена фитазыбацилл.
Key words: phytase, feed addtitive, cloning, expression vectors.
With the purpose of obtaining a recombinant strain with a high level of expression of bacilli phytase the selection for optimal expression system was performed. The vector series pQLink based on plasmids pQE-2 (pQlinkH, pQLinkG), and the vector pTZ57R/T was not effective for gene cloning of the bacilli phytase. The use of pET gene-expression system allowed us to obtain a recombinant strain of Escherichia coli with the gene expression of the bacilli phytase.
Введение
Фитазы - бактериальные ферменты утилизации фитата в качестве источника фосфора. Это особая группа фосфомоноэстераз, способных гидро-лизоватьфитат на более доступные фосфатсодержа-щие соединения. Фитазы практически не вырабатываются в пищеварительном тракте свиней, птицы и других животных с однокамерным желудком. Как правило, в условиях низкой активности или полного отсутствия фитаз фитиновый фосфор, и связанный с ним конгломерат полезных питательных веществ, проходит желудочно-кишечный тракт транзитом.
Фитаза может применяться в биотехнологии и пищевой промышленности при производстве продуктов питания [1; 2]. Однако производство фитазы в промышленных масштабах стало возможным только с использованием соответствующей генетической модификации микроорганизмов.
Инновации в агробиотехнологии имеют определенную целевую направленность, экономическую выгодность и потенциальную общественно-полезную ценность. Существует острая необходимость в разработке новых актуальных и наукоемких технологий, соответствующих современному направлению развития определенной области хозяйствования. В век постгеномных технологий использование нововведений невозможно без знания молекулярных механизмов их действия в биоценозе. Поэтому вопросы, связанные с поиском фитат-гидролизующих микроорганизмов, изучением структуры, свойств и функциональной роли фитазы, а также созданием на их основе актуальных биотехнологических обьектов представляют принципиальную научную новизну в решении этой проблемы.
Для получения ферментов с модифицированными и желаемыми функциями могут быть использованы разные стратегии, в основе которых лежит клонирование гена в вектор экспрессии.
Материалы и методы
1. Штаммы бактерий и векторы Клонирование фрагментов геномной ДНК бацилл проводили в штамме E. coli XLI-Blue (recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lac "Stratagene"). В работе также использовали штаммы и векторы, которые любезно предоставлены проф. UdoHeinemann (Институт молекулярной медицины Макса Дельбрука, Германия): E. coliDH5a (recAl endAl gyrA96 thihsdR17(rK mK+) relAl supE44
ф80ДlacZДM15 A(lacZYA-argF)U169), E.coli, вектора - pTZ57R/T, pQlinkH, pQLinkG, pET-46.
2. Определение фитазной активности Активность фитазы определяли по количеству высвободившегося фосфора при гидролизе фи-тата по методу Грайнера[3, 4]. Реакционная смесь включала 250 мкл 0.1М ацетата натрия рН 5.5, 100 мкл субстрата (10 мМфитат натрия в 0.1М ацетате натрия рН 5.5) и 10 мкл ферментного раствора. Смесь инкубировали 30 мин при температуре 37°С, реакцию останавливали добавлением 1.5 мл раствора (1 М СэНаО, 5 N H2SÜ4,10 мМ (NH^MoO^. Далее в смесь добавляли 100 мкл 1 М лимонной кислоты и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре SmartSpecPlus (BioRad, USA) опытной пробы и контрольной пробы при 355 нм в 1 см кювете. В контрольную пробу, содержащую 250 мкл 0.1 М ацетата натрия и 100 мкл субстрата, вносили 10 мкл фермента после инкубации при 37°С. За единицу активности принимали количество фермента, гид-ролизующего в условиях эксперимента 1 мМ субстрата за 1 мин. Удельную активность выражали в ед/мг белка.
3. Выделение ДНК из клеток бацилл проводили с помощью реактивов " Gene JetGenomicDNAPurificationKit" (Fermentas) согласно прилагаемому протоколу. Предварительно готовили буфер для лизиса грамположительных бактерий, состоящий из 20 мМТрис-НС1, pH 8.0, 2
мМ EDTA, 1.2% Тритон Х-100 и лизоцима в концентрации 20 мг/мл. 1.5 мл ночной культуры осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 5000 об/мин, клетки ресуспендировали в 180 мкл буфера для лизиса и инкубировали 30 мин при 37°С. К содержимому пробирки добавляли 200 мкл буфера для лизиса II, 20 мклпротеиназы К и аккуратно перемешивали. Инкубировали при 56°С в течение 30 минут. Далее добавляли 20 мкл раствора РНКазы А и инкубировали смесь 10 мин при комнатной температуре. Добавляли 400 мкл 50% спирта и перемешивали. Приготовленный лизат переносили на колонку (GeneJetGenomic DNA Purificationcolumn) и центрифугировали 1 минуту при 6 тыс. об/мин. Колонку промывали 500 мкл буфера для промывки I, центрифугировали 1 минуту при 8 тыс. об/мин. Далее промывали с 500 мкл буфера для промывки II и центрифугировали 3 минуты при 12 тыс. об./мин. GeneJet колонку переносили в чистую 1.5 мл пробирку и элюировали ДНК 200 мкл буфером для эл-люции. Инкубировали 2 минуты при комнатной температуре и центрифугировали 1 мин при 8 тыс. об/мин.
4. Выделение плазмидной ДНКпроводили с помощью набора реактивов GeneJETPlasmidMiniprepKit (Fermentas). 1.5 мл ночной культуры центрифугировали в течение 1 мин на центрифуге «Эппендорф» при 12 тысяч оборотов в минуту. Осадок ресуспендировали в 250 мкл раствора I (с добавлением РНКазы). К суспензии добавляли 250 мклресуспендирующего раствора II. Эппендорф переворачивали 3-4 раза в течение 3 мин. Добавляли 350 мклнейтрализирующего раствора III, тщательно перемешивали 4-6 раз. Смесь центрифугировали 5 мин до выпадения в осадок клеток и хромосомной ДНК. Супернатант переносили на GeneJET колонку, избегая задевания белого осадка. Центрифугировали в течение 1 мин. Колонку промывали, добавляя 500 мкл промывающего раствора и центрифугировали в течение 30-60 секунд. Далее GeneJET колонку промывали 2 раза и переносили в чистый 1.5 мл эпендорф. Добавляли 50мкл буфера для элюции в центр колонки. Инкубировали в течение 2 минут при комнатной температуре и центрифугировали 2 минуты при 12 тыс.об./мин. Выделенную плазмидную ДНК хранили при -20° С.
5. Конструирование плазмидpTZ57R/T-Phy, pQLinkH-Phy, pQLinkG-Phy, pET-LIC/Phy, несущих ген фитазыбацилл
Клонирование гена фитазы проводили в различные векторные системы экспрессии.
5.1 Конструирование плазмидыpTZ5ZR/T-
Phy
С помощью праймеровORF и NCBI синтезировали ПЦР-продукты содержащие последовательность гена фитазы. С помощью кита InsT/Aclone™. Клонировали ген в вектор pTZ57R/T. Лигазной смесью трансформировали штамм E.co/iXL1 Blue с добавлением ампициллина. Реком-бинатные штаммы высевали на идентификационную среду с IPTG и X-Gal. Отбирали белые колонии, выделяли плазмидную ДНК. Проводили ПЦР-анализ в агарозном геле по сравнению с исходным
вектором pTZ57R/T, рестрикционный анализ по сайтам XbaI, PstI и секвенировали.
5.2 Конструирование плазмидpQLinkH-Phy, pQLinkG-Phy
На первом этапе с использованием праймеровPhy-ORF-dir и Phy-ORF-rev с геномной ДНК при помощи ПЦР синтезировали последовательность ДНК, содержащую ген фитазы. Поскольку праймерыамплификата уже содержали последовательности, комплиментарные вектору, pQLinkHрестрицировали по сайтам BamHI и NotI. Полученные рестрикты были очищены из агарозно-го геля после электрофореза, дефосфорилированы и лигированы. Лигазной смесью трансформировали лабораторный штамм E.coliDH5a. Из выросших на селективной среде с ампициллином трансформантов выделяли плазмиды, проводили ПЦР-анализ, рест-рицировали по сайтам BamHI и NotI и секвенирова-лии.
5.3 Конструирование плазмидыpET-LIC/Phy
Для клонирования фитазы в вектор pET-
46LIC были сконструированы 2 специальные пары праймеров, содержащие не только комплиментарные нуклеотиды для отжига праймеров, старт- и стоп-кодоны, последовательности, экспрессирую-щие His-tag на С-конце. Проводили клонирование амплификата в вектор, трансформацию в компетентные клетки E.coliDH5a. Выделяли плазмиды из трансформантов. Анализировали плазмиды с помощью ПЦР и праймеровPhy_ORF, Phy_LIC и ферментов рестрикции BamHI и NotI. ПлазмидыpET-LIC/Phy №5,7 содержащие ген вставки использовали для дальнейшей работы.
6. Рестрикционное картирование ДНК
Рестрикцию ДНК проводили набором рест-
риктаз фирмы "Fermentas" в течение 2 ч при 37°С в условиях, рекомендованных производителем. 10 мкл реакционной смеси включали 1 мклплазмидной ДНК pQLink, 3 мкламплификата, 1 мкл фермента, 1 мкл буфера для рестриктазы, 4 мклН20.
7. Лигирование ДНК проводили при температуре 40С в течение ночи в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкллигазного буфера и 5 ед.акт. лигазы Т4 («Сибэнзим») на 1 мкг ДНК.
8. Трансформация клеток E.col/'плазмидной ДНК [5,6]
Для приготовления компетентных клеток 1 колонию с чашки переносили в 2 мл L-бульона, инкубировали 20 ч при 370С. 0.5 мл ночной культуры засевали в 50 мл L-бульона, выращивали 3 ч на качалке при 370С со скоростью 200 об/ мин до достижения оптической плотности 0.4. 1 мл культу-ральной жидкости центрифугировали 2 мин при 10000 об/ мин, надосадочную жидкость сливали. Осадок ресуспендировали в 200 мклСаС12 (0.1 М), выдерживали 2 ч во льду.
При трансформации к 200 мкл клеток добавляли 1 мкг плазмидной ДНК и перемешивали. Клетки подвергали температурному шоку, выдерживая во льду в течение 15 мин, а затем на водяной бане при 420С в течение 5 мин. Процедуру завершали выдерживанием во льду в течение 15 мин. К клеткам добавляли 800 мкл теплого L-бульона, ин-
кубировали в течение 1 ч при 370С. Суспензию высевали по 100-200 мкл на чашки с агаризованной средой (L-агар) и соответствующим антибиотиком.
9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразную цепную реакциюДНК проводили в термоциклере «MJ mini» производства фирмы «BioRad» (США) с использованием Pfu-полимеразы и Taq-полимеазы фирмы «Сибэнзим» (Россия), как описано [6]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 0.03-0.04 мкг плазмидной ДНК, 10 пикамоль каждого праймера, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 20 mMTris-HCl (pH 8.8), 10 mMKCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100 и 2.0 ед. полимеразы. Режим ПЦР: денатурация ДНК при 95°С в течение 4 минут, затем: 94°С - 40 сек, отжиг олигонуклеоти-дов - 1 мин., 72°С - время из расчета 500 нуклеоти-дов в мин для Pfu -полимеразы и 1000 нуклеотидов в мин для Taq -полимеразы, всего - 30 циклов, с заключительным синтезом при 72°C в течение 7 мин. Температуру отжига праймеров считали по формуле T = 2(A+T)+3(G+C), где A, T, G, С - количество соответствующих нуклеотидов в синтетическом олигонуклеотиде.Последовательности прайме-ров приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Олигонуклеотиды, использованные в работе
10. Электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле (7х 4,5 х0,5 см). Концентрация агарозы в геле составляла 1%. В качестве электродного буфера использовали 0,04М трис-ацетатный буфер (рН 7,5-7,8), содержащий 0,002М ЭДТА, рН 8,0. Буфер для нанесения проб: 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина в воде (температура хранения 4° С). Пробу с краской смешивали в соотношении 3:1(6 мкл пробы и 2 мкл краски). Электрофорез проводили при силе тока 50 мА. По окончании гель в течение 15 мин выдерживали в растворе бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл.
11. Иммуноблоттинг
15 мл культурально жидкости освобождали от клеток центрифугированием в течение 20 мин при 8 тыс. об./мин. Разрушение клеток проводили с помощью ультразвука. Белки лизатов разделяли в SDS-ПААГ как описано в [7]. После электрофореза гель уравновешивали в буфере (15,2 гТрис, 72.1 г глицина, 750 мл метанола (100%) в общем объёме 5 л) и переносили на PVDF мембрану. Westernblot проводили в камере Bio-Rad как описано в [7]. По-ликлональные кроличьи LiaH-антитела к белку His10-LiaH, моноклональные антитела к белку GFP (Epitomics), вторичные антитела (коньюгат anti-rabbitlgGHRP, Promega) разводили 1:20000, 1:30000 и 1:100000, соответственно. Для детекции LiaH/GFP белков, использовали набор AceGlowTM (PeqLab). Визуализацию проводили на хемилюминесцентной системе QUANTUM-ST4-3026 (PeqLab).
Результаты и обсуждение
Для клонирования гена подбирали оптимальную систему экспрессии.
Для целевой экспрессии создан набор векторов под названием pQLink на основе плазмиды pQE-2 (Qiagen, Hilden, Germany) [8]. Гены ферментов, содержащие последовательности из семи остатков гистидина 7xHis-tag, клонируют в вектора pQLinkH или pQLinkG по сайтам BamHI и NotI. В векторе имеются другие специфичные сайты рестрикции, такие как Pad и SwaI, использующиеся для сцепления единственной последовательности белка с помощью лигазо-независимого клонирования. Конструкция имеет дополнительные участки: attB1 и attB2 праймеры для амплификации N-концевой или С-концевой последовательности гена; TEV (TobaccoEtchVirus) - протеаза вируса табачной мо-зайки, которая определяет консервативную последовательность из семи аминокислот (Glu-X-X-Tyr-X-Gln/Ser) и расщепляет участок строго между глу-тамином и серином; полилинкер (MCS). Вектор pQLinkG отличается от pQLinkH наличием GST-группы. Глутатион^-трансфераза (GST) - это белок, состоящий из 211 аминокислотный остатков (26 кДа), соответствующая которым последовательность ДНК интегрирована в вектора экспрессии для получения рекомбинантных белков. При экспрессии образуется GST-меченный фьюжн - белок, где функциональный GST-сайт сшит с N-концевым участком рекомбинантного белка. GST-последовательность способствует фолдингу молекулы белка и стимулирует образование стабильного и высоко растворимого белка, ее наличие во фьюжн-белке позволяет получить лучшую экспрессию и растворимость рекомбинантных белков по сравнению с экспрессией в отсутствие этой последовательности. Кроме того, GST-меченные фьюжн-белки могут быть идентифицированы по способности глутатион-синтетазы связывать субстрат глута-тион (GSH). Очистка, основанная на высоком сродстве к глутатиону позволяет GST-меченные белки связывать с лигандомглутатиона, а примеси удалять в процессе промывки. Затем целевые белки элюи-руют в денатурирующих условиях, сохраняющих структуру и функцию белков.
Название Последовательность праймера
ORF-rev 5'ctagccgtcagaacggtctttca 3'
ORF-dir 5 'atgaaggttccaaaaacaatgctg3'
NCBI-rev 5 'gccgtcagaacggtctttcagctt3'
NCBI-dir 5' gctaagcactgccgcgggtt3'
M13/pUC-rev 5'gtaaaacgacggccagt3'
M13/pUC-dir 5' caggaaacagctatgac 3'
Phy-ORF-dir 5'caggatccatgaaggttccaaaaacaatgctgc 3'
Phy-ORF- rev 5'gactgactgcggccgctcactagccgtcagaacg gtctttcagc 3'
Phy_LIC_f w 5'gacgacgacaagatggagaatctttattttcaggg atatgtgaatgaggaacatcat'3
Phy_LIC_r ev 5' gaggagaagcccggttactagccgtcagaacggtct ttcagc 3'
Были оценены вектора pQLinkH и pQLinkG для экспрессии фьюжн-белков с His-tag и Gst-tag, а также белков без tag концов [8].
Рис. 1 - Электрофорез ПЦР-продуктов конструкций на основе векторов pQLinkН и pQLinkG. М -маркер, 1-9 - амплификаты гена фитазы
В ходе экспериментов выяснилось, что клонирование гена фитазы в вектора экспрессии pQLink оказалось малоэффективным. После трансформации в клетки E.coliDH5a и дальнейшей очистки плазмид ПЦР-анализ подтвердил наличие гена-вставки в векторе (рис. 1), но активность фитазы отсутствовала.
Второй исследуемой системой был вектор для клонирования рТ257К/Т. Данный вектор представлен линейной молекулой двуцепочечной ДНК и содержит дидезокситимидин на З'-концах обеих цепей, что предотвращает рециклизацию вектора в процессе лигирования и обеспечивает высокий выход продуктов клонирования с низким уровнем побочных продуктов. ПлазмидарТ257И/Т реплицируются в клетках E.coli и несет ген альфа-субъединицы p-галактозидазыlac-оперона и ген устойчивости к ампициллину.
В ходе экспериментов с системой экспрессии pTZ57R/T активность фитазы отсутствовала. В связи с этим использовали другую систему экспрессии, в основе которой заложен принцип лигазонеза-висимого клонирования.
Продукт амплификации гена фитазы лиги-ровали в вектор pET-46 Ek/LIC. Экспрессионная системар ЕТ обеспечивает экспрессию целевого белка с His-tag на ^Т-конце, следующим за сайтом расщепления ТЕУ, под контролем промотора фага Т7, специфически связываемого с Т7 РНКП [9]. Клонирование в такой вектор обеспечило высокую точность и выход целевого белка на основе аффинной хроматографии. В основе лежит клонирование без использования ферментов рестрикции и реакций лигирования. ЫС вектора создаются путем обработки линейных участков последовательности Т4 ДНК-полимеразы в присутствие только одного свободного нуклотидтрифосфата. В ходе 3' 5' экзонуклеазной активности ДНК-полимераза удаляет нуклеотиды в цепи до тех пор, пока не встретит соответствующий нуклеотидтрифосфат. В этот момент 5', 3' полиме-разная активность фермента предотвращает дальнейшее удаление последовательности. Очистка и
обработка ПЦР-продукта происходила по той же схеме, но в присутствие соответственного комплиментарного нуклеотида. Такой метод клонирования является эффективным, поскольку образование целевого продукта происходит при отжиге.
Лигазной смесью трансформировали штамм E.coliDH5a. E. coli являются наиболее часто используемыми микроорганизмами - хозяевами для экспрессии рекомбинантного белка. Различные факторы могут влиять на уровень продукции белка и на его растворимость. Это важно для оптимизации производства белковых комплексов с использованием стратегий коэкспрессии [10].
Рекомбинантые штаммы высевали на среду с добавлением ампицилина. Отбирали ампициллин устойчивые колонии и выделяли из клеток плазмид-ную ДНК. Для выявления плазмид, содержащих ген фитазы, проводили рестрикционый анализ. Плаз-мидную ДНК расщепляли с помощью рестриктазы Bcl1 и анализировали ее размер в агарозном геле. Параллельно проводили ПЦР с праймерами, комплиментарными гену фитазы (рис.2).
Рис. 2 - Электрофорез ПЦР-продуктов конструкций и рестриктов. М - маркер; 2-5 - pQLinkH/Phy, 6-9 pET-LIC/Phy: c праймеры ORF fw/rev; 10 -К+; 11-14 - pQLinkH/Phy , 15-18 - pET-LIC/Phy: праймерыРЬу-LIC fw/rev
По данным, представленным на рисунке 2 видно, что реакция амплификации наиболее эффективна в образцах 6, 9, 15 и 18.
Таким образом, с помощью рестрикционно-гои ПЦР-анализа был отобран вектор pET-LIC/Phy №7 со вставкой гена фитазы бацилл. Экспрессию гена фитазы изучали в рекомбинантном штамме EscherichiacoliRosseta, несущим ген резистентности к хлорамфениколу. Штамм не содержит специфичных протеаз, влияющих на деградацию белков, что способствовало экспрессии гетерогенных генов. Рекомбинантный вектор pET трансформировали в штамм E.coliRosseta. Трансформанты выращивали на специализированной среде культивирования ТВ. Эта среда обеспечила высокий уровень продукции белка в pET системах, как и в других IPTG-индуцируемых бактериальных системах экспрессии. В необходимом соотношении добавили антибиотики: хлорамфеникол и карбоницилин. На 24-ый час роста отбирали пробы, которые анализировали на SDS-ПААГ - электрофорезе (рис. 3).
50кДа
37кДа
25кДа
Рис. 3 -Электрофорез белковых препаратов на среде ТВ. М - маркер, 4.1 - 4.10 - белковые продукты рекомбинантных штаммов E.coli
SDS-электрфорез позволил обнаружить белковые полосы, среди которых выявлен белок, молекулярная масса которого соответствовала молекулярной массе бациллярной фитазы и составляла 41кДа.
Таким образом, в результате подбора системы экспрессии нами получен рекомбинантный штамм E. coli, несущий ген фитазыбацилл.
Работа поддержана грантом РФФИ № 12-08-00942a и средствами субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности (проект №14-83). Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского)
федерального университета среди ведущих мировых
научно-образовательных центров.
Литература
1. U. Konietzny, R. Greiner,Encyclopedia of Food Science and Nutrition. Elsevier, London, 2003.
2. X.W. Shi, M.L. Sun, B. Zhou, X.Y. Wang Can. J. Microbiol,55, 5, P.599-604 (2009).
3. R. GreinerProtein J., 23, 8, P. 567-76 (2004).
4. А.Д. Сулейманова, А.А.Тойменцева, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, Вестник Казанского технологического университета, 20, 188-191 (2013).
5. А.А. Тойменцева, А.М. Черёмин, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, Вестник Казанского технологического университета, 20, 191-194 (2013).
6. J. Sambrook, E.F. Fritsch, S.T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989, 2344 p.
7. J. Sambrook, D.W. Russell,Molecular Cloning - a laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold, 2001, 2344 p.
8. C. Scheich, D. Kümmel, D. Soumailakakis, U. Heinemann, K. Büssow, Nucleic Acids Res, 35, P.43 (2007);
9. J. Yin, G. Li, X. Ren, G. Herrler, J. Biotechnol, 127,3, P.335-47 (2007).
10. D. Busso, Y. Peleg, T. Heidebrecht, C. Romier, Y. Jacobovitch, A. Dantes, L. Salim, E. Troesch, A. Schuetz, U. Heinemann, G.E. Folkers, A. Geerlof, M. Wilmanns, A. Polewacz, C. Quedenau, K. Büssow, R. Adamson, E. Blagova, J. Walton, J.L. Cartwright, L.E. Bird, R.J. Owens, N.S. Berrow, K.S. Wilson, J.L. Sussman, A. Perrakis, P.HN. Celie, Journal of Structural Biology, 175, P. 159-170 (2011).
© А. И. Ахметова, к.б.н., м.н.с. кафедры микробиологии К(П)ФУ, akhmetova.alina@gmail.com; А. Д. Сулейманова, к.б.н., н.с. той же кафедры, aliya.kzn@gmail.com; Н. П.Балабан, к.б.н., с.н.с. той же кафедры, nellybalaban@yandex.ru; А. А. Тойменцева, к.б.н., н.с. той же кафедры, tojmencevaaa@mail.ru; И. И.Каюмов, студент к той же кафедры, ilhamen@mail.ru; Е. О.Михайлова, к.б.н., доцент кафедры БСМЭ, КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com; М. Р. Шарипова, д.б.н., профессор кафедры микробиологии К(П)ФУ, marsharipova@gmail.com.
© A. I. Akhmetova, PhD, j.res. of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, akhmetova.alina@gmail.com; A. D. Suleimanova, PhD, res. of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university,aliya.kzn@gmail.com; N. P. Balaban, PhD, sen. res. of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, nellybalaban@yandex.ru; A. A. Tojmenceva, PhD, res. of Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, tojmencevaaa@mail.ru; I.I.Kayumov, student of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university,ilhamen@mail.ru; E.O. Mikhailova, PhD, associate professor of BSME department, KNRTU, katyushka.glukhova@gmail.com; M.R. Sharipova, PhD, professor of Microbiology dep., Institute of fundamental medicine and biology, Kazan federal university, marsharipova@gmail.com.
