CC BY
16
УДК 577.113.6, 577.151.4
ИЗУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ р-ЛАКТАМАЗ ТЕМ-1 И ТЕМ-171 МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛАССА А
В.Г. Григоренко, И.П. Андреева, М.Ю. Рубцова, В.В. Бурмакин, И.В. Упоров, А.М. Егоров
(кафедра химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова; e-mail: vitaly.grigore-nko@gmail.com)
Созданы штаммы-продуценты и получены гомогенные препараты рекомбинантных ферментов р-лактамаз класса А TEM-1 и ТЕМ-171, отличающихся аминокислотной заменой валина в положении 84 на изолейцин (Val84Ile). Определены кинетические параметры р-лактамазы ТЕМ-171 с использованием хромогенного субстрата CENTA (Km каж = 23 мкМ, Акат = 102 с-1). Установлен конкурентный тип ингибирования рекомбинантных р-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 тазобактамом; значения констант ингибирования в реакции гидролиза субстрата CENTA составили 0,057 и 0,047 мкМ для ТЕМ-1 и ТЕМ-171 соответственно. Показано, что мутация (Val84Ile) приводит к уменьшению стабильности фермента ТЕМ-171 в 1,5 раза.
Ключевые слова: рекомбинантная р-лактамаза TEM-1, TEM-171, CENTA, кинетические параметры, тазобактам, конкурентный тип ингибирования.
Устойчивость возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам является серьезной проблемой во всем мире. В последние годы эта проблема стала еще более угрожающей в связи с распространением панрезистентных микроорганизмов [1]. Самые распространенные в настоящее время виды резистентности связаны с продукцией бактериями ферментов Р-лактамаз, способных гидролизовать Р-лактамное кольцо антибиотиков. Эти ферменты образуют огромное семейство, насчитывающее уже более 1300 представителей [2]. Они эволюционируют с высокой скоростью, характеризуются высокой мутабельностью и структурной изменчивостью. В настоящее время особое внимание уделяется исследованиям структуры как активного центра, так и возможных участков ал-лостерического регулирования Р-лактамаз в целях поиска соединений - модуляторов ферментативной активности [3]. Известно, что эволюция Р-лактамаз развивается по двум основным механизмам - возникновение новых мутаций у известных ферментов и появление ферментов с новой структурой. Описано несколько мутаций Р-лактамаз, получивших название «ключевые», которые способствуют расширению спектра субстратной специфичности, изменению каталитической активности и возникновению устойчивости к ингибиторам [4]. Это подчеркивает необходимость всестороннего изучения структурных особенностей и механизма
действия Р-лакгамаз. Комплексное исследование различных мутантных форм Р-лакгамаз и установление взаимного влияния мутаций на структурные особенности и каталитические параметры ферментов позволят перейти к созданию нового типа ингибиторов, а также найти новые способы преодоления резистентности микроорганизмов к антибиотикам.
Р-Лактамаза ТЕМ-1 относится к молекулярному классу А и является первым ферментом, выделенным в начале 1960-х годов из крови инфицированного пациента [5]. Р-Лактамазы ТЕМ-типа имеют компактную структуру, образованную одной полипептидной цепью с молекулярной массой около 30 кДа, не содержат сахара и металлов в активном центре. Р-Лактамаза ТЕМ-1 является модельным ферментом для изучения влияния различных мутаций на ферментативную активность. В настоящее время в Protein Data Bank представлены 47 структур Р-лактамазы ТЕМ-1 и ее мутантов в комплексе с молекулами лекарственных средств и ингибиторов в разном разрешении [6-8]. Рентге-нокристаллографические исследования комплексов ферментов с эффекторами, в том числе с ингибиторами, являются основой для исследования механизмов их взаимодействия. Анализ кристаллических структур Р-лактамазы ТЕМ-1 и ее мутантов показывает, что точечные мутации приводят к небольшим структурным изменениям, таким как
перемещение разделенных аминокислот и молекул воды вокруг мутировавших остатков, которые влияют на каталитическую активность фермента [9, 10]. Наличие некоторых мутаций делает фермент способным расщеплять как пеницил-лины, так и цефалоспорины. Установлено, что некоторые мутации существенно изменяют конфигурацию петель активного центра [11]. Также показано, что эти сильно дестабилизирующие молекулу мутации возникают в комбинации с другими, компенсационными [7]. Существует гипотеза, что такие «вторичные» мутации способны компенсировать дефекты в каталитической активности или стабильности, вызванные первичными мутациями [12]. Подобный анализ расположения мутаций и их взаимного влияния на каталитическую активность ß-лактамаз разных типов может обеспечить получение новых данных о взаимосвязях структура-активность данного семейства ферментов.
Цель настоящего исследования - получение ре-комбинантных ß-лактамаз ТЕМ-1 и TEM-171, отличающихся заменой в положении 84 (Val84Ile), сравнительное изучение их каталитических свойств, определение типа и значения констант ингибирования тазобактамом, изучение термостабильности.
Экспериментальная часть
В работе использовали реагенты компаний «Sigma», «Fluka» и «Difco». Белковый электрофорез (ДСН-ПААГ) осуществлен по стандартной методике с применением набора белков (SM0431, MBI-Fermentas) в качестве стандартов молекулярной массы. Для работы с ДНК использованы киты QIA Spin Miniprep Kit и QIAquick Gel extraction Kit («Qiagen», Германия). Ферменты рестрикции и модификации ДНК произведены компаниями «New England Biolabs» и «MBI-Fermentas». Олигону-клеотиды для секвенирования и ПЦР заказывали в компании «Синтол» (Россия); секвенирование ДНК проводили в компании «Евроген» (Россия). Для определения концентрации белка использовали BCA тест-набор («Sigma», США); носители для хроматографической очистки SOURCE™ 15Q («GE Healthcare», Швеция). Все водные растворы готовили на деионизованной воде MilliQ («Millipore», Франция).
Микроорганизмы, среды, плазмиды и олиго-нуклеотиды. Для генетических манипуляций использованы клетки E. coli линии DH5a, плазмид-ный вектор pET-24, для экспрессии белка - E. coli BL21(DE3) («Novagen», США). Клетки культивировались в среде LB (1%-й экстракт дрожжей,
1%-й пептон, 0,5%-й NaCl), содержащей 50 мг/л канамицина.
Для получения компетентных клеток E. coli культура наращивалась до OD600 0,4-0,6 в 50 мл среды LB и отделялась от культуральной среды центрифугированием при скорости 3500*g при 4°С в течение 10 мин. Полученный осадок клеток был ресуспендирован на льду в буфере TSS (буфер на основе среды LBS, содержащий на 100 мл 10 г ПЭГ-6000, 5 мл DMSO и 0,6 г MgCl2; рН 6,5), выдержан в течение 1 ч на льду, расфасован на алик-воты по 200 мкл и быстро заморожен при -80°С.
Поиск нуклеотидных последовательностей генов Р-лактамаз осуществлялся на сайтах клиники Lahey (www.lahey.org/studies/) и Европейского института биоинформатики (www.ebi.ac.uk/). Выравнивание последовательностей Р-лакгамаз проводили с помощью программы Multiple alignment, Multaline DNA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/). Транслирование нуклеотидной последовательности ДНК в аминокислотную осуществлялось на сервере ExPASy Proteomics Server, Translate tool (http:// expasy.org/tools/dna.html)/). Расчет pi и Mw белка выполнялся также на данном сервере (http:// au.expasy.org/tools/pi_tool.html).
Праймеры для клонирования гена ТЕМ-1 Р-лактамазы в плазмидный вектор pET-24а(+) по сайтам NdeI/NotI: прямой 5'- TTATATTAACATAT GCACCCAGAAACGCTGGTGAAAG-3 ' и обратный 5 - TTTGCGGCCGCTCACCAATGCTTAATC AGTGAGGC-3'. Для амплификации ДНК использовали метод ПЦР с Pfu-полимеразой. В качестве матрицы использовали pET-15. Очистку полученных ПЦР-продуктов проводили на колонках QIAquick («PCR Purification Kit», «Qiagen», Германия) согласно протоколу производителя.
Введение мутаций методом Quick Change. Амплификацию проводили в общем объеме 25 мкл в тонкостенных пробирках (0,2 мл) в ДНК-амплификаторе по следующему протоколу: начальная денатурация при 95°С, 2 мин; амплификация, 15 циклов: денатурация при 95° С, 30 с; отжиг прай-меров при 55°С, 1 мин; элонгация при 72°С, 7 мин; конечная элонгация при 72°С, 10 мин; охлаждение смеси до +4°С. В полученную после ПЦР смесь добавляли рестриктазу DpnI и после инкубации при 37°С в течение 1 ч использовали для трансформации клеток Е. coli DH5a. Для введения мутации (Val84Ile) использовали следующие праймеры: прямой
5 ' -GTATTATCCCGT ATTGACGCCGGGC-3 ' и обратный
5 ' -GCCCGGCGTCAATACGGGATAATAC-3 '.
Культивирование клеток E. coli. Клетки E. coli наращивали в среде LB с канамицином (50 мкг/мл). В качестве индуктора использовали ИПТГ. Клетки выращивали при 30° С при перемешивании (180 об/мин) до значения оптического поглощения 0,8-1,2 ед. при 600 нм, далее индуцировали 0,1 мМ ИПТГ и продолжали культивирование в течение 5 ч. Клетки центрифугировали при 3000xg и 4°С и хранили при -20°С .
Выделение и очистка рекомбинатного фермента. Для выделения периплазматической фракции использовали метод осмотического шока. Клетки размораживали на льду и ресуспендиро-вали в буфере, содержащем 20% сахарозы, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ Трис/HCL, рН 8,0; инкубировали на льду в течение 15 мин. Образовавшиеся сферо-пласты удаляли центрифугированием при скорости 10 000xg при 4°С в течение 15 мин. Полученный супернатант диализовали против 10 мМ Трис/HCL (рН 8,0) и использовали для дальнейшей очистки. Анионообменную хроматографию проводили на колонке SOURCE™ 15Q (10 см х 0,75 см2, «GE Life Science»), уравновешенной тем же буфером; рекомбинантный препарат фермента элюировали в линейном градиенте (0-300 мМ NaCL, 2 мл/мин). Фракции, содержащие активный фермент, хранили при +4°С или замораживали при -20°С.
Измерение активности рекомбинантной ß-лактамазы. Активность ß-лактамазы по субстрату CENTA определяли на спектрофотометре «UV-1602» фирмы «Shimadzu» (Япония) при 25°С. Образование хромогенного продукта детектировали при длине волны 405 нм (Ае405 = 6400 М-1хсм-1). Измерения активности проводили в 50 мМ Na-фосфатном буферном растворе (pH 7,0).
Определение Km, V и ккат. Раствор субстрата ß-лактамазы CENTA (4 мМ в 50 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,0) и аликвоту фермента (10 мкл) добавляли к 50 мМ Na-фосфатному буферному раствору (рН 7,0). Общий объем смеси составлял 1 мл. Значения начальных скоростей ферментативной реакции определяли по начальному линейному участку кинетической кривой накопления продукта при проведении реакции гидролиза (£кат = V/[E0]). Значения кинетических параметров (Кт,и V) определяли из графиков в ко -ординатах Лайнуивера-Берка. При расчетах считали, что концентрация активных центров ферментов соответствует концентрации фермента в реакционной смеси.
Определение Кг Концентрированный раствор тазобактама (4 мМ) получали растворением определенной навески реагента в 50 мМ буферном
растворе фосфата Na (рН 7,0). Раствор CENTA (в 50 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,0), раствор ингибитора и аликвоту фермента (10 мкл) добавляли к 50 мМ Na-фосфатному буферному раствору (рН 7,0). Общий объем смеси составлял 1 мл. Значения начальной концентрации тазобактама составляли 0; 0,25; 0,05; 0,1 и 0,2 мкМ. Константы ингибирования определяли из графика, на котором экспериментальные данные были представлены в координатах (Кт каж, [I]). Каждое измерение активности проводили в трех повторах.
Результаты и обсуждение
Периплазматическая экспрессия генов ß-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 в клетках E. coli.
Гетерологическая экспрессия генов ß-лактамаз в бактериях имеет много преимуществ по сравнению с выделением соответствующих белков из клинических образцов. Для получения рекомби-натных препаратов ß-лактамаз ( ТЕМ-1 и ТЕМ-171) в растворимой и активной формах был выбран метод экспрессии в бактериальную периплазму, окислительный потенциал которой способствует формированию стабильных дисульфидных связей. С этой целью был создан экспрессионный вектор pET-bla, содержащий ген устойчивости к канамицину в качестве селективного маркера, что позволяет избежать интерференции с собственной активностью ß-лактамаз, определяющей устойчивость к ампициллину. Полноразмерный ген ТЕМ-1 ß-лактамазы, содержащий нативную сигнальную последовательность, обеспечивающую транспорт синтезированного белка в периплазму, был клонирован под контролем сильного Т7-промотора по сайтам рестрикции NdeI и NotI, введенных методом ПЦР. Секвенирование показало, что ну-клеотидные последовательности полностью соответствуют референсным последовательностям ß-лактамаз из банка данных (http://www.lahey.org/ Studies/temtable.asp/) и ни на одной из стадий клонирования не было введено случайных мутаций.
Направленный мутагенез ß-лактамазы TEM-1. Созданная конструкция pET-bla вектора для TEM-1 ß-лактамазы была использована для получения мутанта данного фермента (ТЕМ-171), содержащего единичную замену валина на изолейцин в положении 84. В настоящее время в банке данных аминокислотных последовательностей ß-лактамаз (http://www.lahey.org/Studies/ temtable.asp/) описаны 204 уникальных фермента ТЕМ-группы. При этом у пяти ферментов (ТЕМ-116, ТЕМ-157, ТЕМ-162, ТЕМ-171 и ТЕМ-205) в положении 84 находится изолейцин вместо ва-лина, причем только у ß-лактамазы ТЕМ-171 это
единственная замена (по сравнению с канонической последовательностью ТЕМ-1). Данные о фенотипе данного фермента отсутствуют. Для создания ТЕМ-171 использовали метод Quick Change. Метод заключается во введении нукле-отидной замены с помощью праймера в процессе ПЦР целой плазмиды. Дизайн праймеров был основан на том, что оба мутагенных праймера должны содержать желаемую мутацию и быть самокомплементарными для гибридизации на одном и том же участке на разных цепях плаз-мидной ДНК. Нуклеотидная замена должна находиться в середине праймера. Рестриктаза DpnI специфически расщепляет метилированную ДНК и тем самым позволяет убрать исходную матрицу ДНК, не содержащую мутаций. Данный метод характеризуется высокой эффективностью и простотой исполнения. Результаты секвенирования (для трех клонов) показали, что во всех клонах присутствует соответствующая однонуклеотид-ная замена (G/A) и что в процессе ПЦР не было введено никаких случайных мутаций.
Выделение и очистка ß-лактамаз. Созданные штаммы E. coli (продуценты ß-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171) позволяют получать ре-комбинантные препараты соответствующих ферментов в активной и растворимой формах. Очистка рекомбинантного белка после индукции ИПТГ из культуры клеток E. coli BL21(DE3)
Т а б л и ц а 1
Характеристика процессов выделения и очистки ß-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171 из клеток E. coli BL21(DE3)
Стадии выделения и очистки Общая активность Удельная активность Степень очистки Выход, %
(A) (А/мгбелка)
ß-Лактамаза TEM-1
Периплазматическая фракция 157 1,8 - 100
Диализ 144 2,1 1,2 92
Анионообменная
хроматография, SOURCE™ 15Q 68 7,7 3,6 43
ß-Лактамаза TEM-171
Периплазматическая фракция 70 1,2 - 100
Диализ 63 1,5 1,3 90
Анионообменная
хроматография, SOURCETM 15Q 30 7,7 6,4 42
Рис. 1. ДСН-ПААГ-электрофорез в 12,5%-м геле фракций рекомбинантной ß-лактамазы TEM-171 в процессе очистки: 1 - периплазматическая фракция после диализа; 2 - проскок; 3-9 - разные фракции, содержащие ß-лактамазу, элюция в градиенте NaCl (0-0,3 М); 10 -белковые стандарты молекулярного веса
включала осмотический шок в 20%-й сахарозе для выделения периплазматической фракции с последующим диализом против 10 мМ Трис/НС1 (рН 8,0). Выделение рекомбинантных ß-лактамаз проводили методом анионообмен-ной хроматографии на носителе SOURCE™ 15Q (GE Healthcare); ß-лактамазы элюировали в солевом градиенте (0-0,3 М NaCl) при концентрации соли около 80 мМ. Степень чистоты полученных препаратов TEM-1 и ТЕМ-171 составила не менее 95% по данным электрофореза (рис. 1). Характеристики процесса выделения и очистки представлены в табл. 1. Для подтверждения ами-
нокислотной последовательности рекомбинант-ных ß-лактамаз использовали масс-спектральный анализ (выполнен в лаборатории системной биологии НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Оре-ховича докт. биол. наук В.Г. Згодой).
Общий выход очищенного рекомбинантного препарата составил около 25 мг с 1 л культуры клеток E. coli для ß-лактамазы TEM-1 и 10 мг с 1 л культуры для ТЕМ-171. Стоит отметить, что при одинаковых условиях культивирования, индукции, выделения и очистки периплазматическая фракция ß-лактамазы ТЕМ-171 содержит примерно в 2 раза меньше целевого белка, чем в случае ТЕМ-1. Можно предположить, что мутация в положении 84 фермента ТЕМ-171 влияет на процесс биосинтеза данного фермента в клетке (фолдинг, транслокацию в периплазму, про-цессинг сигнальной последовательности и др.).
Определение каталитических параметров рекомбинантных ß-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171. Цель данного этапа работы состояла в определении каталитических параметров (KM, V, ккат) полученных рекомбинантных форм ß-лактамаз по хромогенному субстрату CENTA [13]. Данный субстрат является синтетическим субстратом ß-лактамаз на основе цефалотина, при гидролизе которого образуется окрашенный продукт с пиком поглощения на 405 нм. В литературе имеются данные по кинетическим кон -стантам гидролиза CENTA лишь для ограниченного количества ß-лактамаз. Значения каталитических параметров рекомбинантных ß-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 гтелставлены в табл. 2.
Т а б л и ц а 2
Каталитические параметры рекомбинантных ß-лактамаз TEM-1 и ТЕМ-171 в реакции гидролиза субстрата CENTA
ß-Лактамаза Km, мкМ k , с 1 кат' [E], нМ
TEM-1 24±2 109±2 10
TEM-171 23±2 102±2 5
Измеренные в настоящей работе величины Км и ккат для рекомбинантных форм Р-лактамаз по субстрату CENTA позволяют говорить о схожести каталитической эффективности обоих ре-комбинантных ферментов в реакции гидролиза субстрата CENTA. Это свидетельствует о том, что замена валина в положении 84 на изолейцин не оказывает существенного влияния на кон -формацию активного центра фермента и пути передачи протона.
Изучение ингибирования Р-лактамазы ТЕМ-1 и ТЕМ-171 тазобактамом. Изучено ингибирова-ние рекомбинантных Р-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 тазобактамом. В роли субстрата выступал CENTA. Каждое измерение активности проводили трижды. Полученные результаты не различались в сериях более чем на 7%. На рис. 2 представлены зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата в координатах Лаинувера-Берка в присутствии различных концентраций та-зобактама для рекомбинантных Р-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171. Линеаризацию проводили по методу наименьших квадратов. Анализ представленных результатов позволяет сделать вывод о конкурент-
[CENTA], мкМ [CENTA], мкМ
Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза субстрата CENTA ß-лактамазой ТЕМ-1 (А) и ТЕМ-171 (Б) от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (1/v0, 1/[£0]) при разной концентрации тазо-
бактама: 1 - 0,025; 2 - 0,05; 3 - 0,1; 4 - 0,2 мкМ
ном ингибировании Р-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 тазобактамом. Данный факт отражает структурное сходство тазобактама с Р-лактамными антибиотиками (пенициллины и цефалоспорины), являющимися субстратами Р-лактамаз.
Для определения константы ингибирования рекомбинантной Р-лактамазы тазобактамом строили зависимость от концентрации ингибитора (рис. 3). В настоящее время в литературе отсутствуют данные по константам ингибирования Р-лактамаз тазобактамом, измеренным по субстрату СБНТЛ. Рассчитанные значения констант ингибирования (К^ составили 0,057±0,004 мкМ для Р-лактамазы ТЕМ-1 и 0,047±0,004 мкМ для ТЕМ-171. Полученные нами значения совпадают по порядку величины с ранее опубликованными данными для ТЕМ-1 по субстрату нитроцефин (0,014 мкМ) [14].
Изучение термостабильности. Изучение термостабильности Р-лактамаз ТЕМ-1 и ТЕМ-171 проводилось при 60°С в течение 3 ч. Было показано, что замена валина в положении 84 на изолейцин приводит к уменьшению стабильности фермента ТЕМ-171 в 1,5 раза. Период полуинактивации при концентрации ферментов 1 мкМ составил 112 и
Рис. 3. Зависимость KM* от концентрации тазобактама для рекомбинантных ß-лактамаз ТЕМ-1 (1) и ТЕМ-171 (2)
Рис. 4. Зависимость остаточной активности от времени для р-лактамаз ТЕМ-1 (1) и ТЕМ-171 (2). Концентрация ферментов 1 мкМ, 50 мМ натрий-фосфатный буфер (рН 7,0), температура инкубации 60°С
166 мин для ТЕМ-171 и ТЕМ-1 соответственно (рис. 4). В настоящее время проводится изучение механизма влияния мутации (Уа18411е) на стабильность методами молекулярного моделирования и рентгеноструктурного анализа [15].
Распространение в настоящее время антибио-тикорезистентности, безусловно, связано с антропогенными факторами. Однако резистентность бактерий имеет более глубокие корни. Это явление отражает борьбу видов за ареал обитания и источники энергии и появилось намного раньше, чем человек начал использовать антибиотики. Наличие широкого полиморфизма у суперсемейства Р-лактамаз, по-видимому, играет существенную роль в адаптации и выживании микроорганизмов в изменяющихся внешних условиях. Детальное изучение влияния мутаций на свойства Р-лактамаз позволит получить новые фундаментальные знания о природе полиморфизма, а также найти новые способы преодоления резистентности микроорганизмов к антибиотикам.
Выражаем благодарность группе Виктора Ламзина из Европейской Молекулярно-Биоло-гической Лаборатории (ЕМБЛ) за обсуждение полученных результатов
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 15-14-00014).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Antimicrobial Resistance Global Report on surveillance 2014 World Health Organization (http://www.who.int/ drugresistance/en/).
2. Bush K. // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2013. Vol. 1277. P. 84.
3. Horn J.R., Shoichet B.K. // J. Mol. Biol. 2004. Vol. 336. P. 1283.
4. Bradford P. // Clin. Microbiol. Reviews. 2001. Vol. 14. P. 933.
5. Datta N., Kontomichalou P. // Nature. 1965. Vol. 208. N 5007. P. 239.
6. Wang X., Minasov G., Blazquez J., Caselli E., Prati F., Shoichet B.K. // Biochemistry. 2003. Vol. 42. N 28. P. 8434.
7. WangX., Minasov G, Shoichet B.K. // J. Mol. Biol. 2002. Vol. 320. P. 85.
8. Reichmann D., Rahat O., Albeck S., Meged R., Dym O., Schreiber G. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. Vol. 102. P. 57.
9. Stec B. // Acta Crystallogr. Sect. D. 2005. Vol. 61. P. 1072.
10. Fonze E. // Acta Crystallogr. Sect. D. 1995. Vol. 51. P. 682.
11. Dellus-Gur E., Toth-Petroczy A., Elias M., Tawfik D.S. // J. Mol. Biol. 2013. Vol. 425. P. 2609.
12. Richman D.D. // Nature. 1995. Vol. 374. P. 494
13. Bebrone C., Moali C., Mahy F., Rival S., Docquier J.D., Rossolini G.M., Fastrez J., Pratt R.F., Frère J.M., Gal-leni M. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. Vol. 45. N 6. P. 1868.
14. Caporale B., Franceschini N., Perilli M., Segatore B., Rossolini G.M., Amicosante G. // Antimicrob Agents Chemother. 2004. Vol. 48. N. 9. P. 3579.
15. Grigorenko V.G., Rubtsova M.Y., Egorov A.M., Caro-lan C.G., Kallio J., Lamzin VS. // FEBS Journal. 2013. Vol. 280. Suppl. 1. P. 373
Поступила в редакцию 01.08.15
STUDY OF CATALYTIC PROPERTIES OF RECOMBINANT P-LACTAMASES TEM-1 AND TEM-171 OF MOLECULAR CLASS A
V.G. Grigorenko, I.P. Andreeva, M.Yu. Rubtsova, V.V. Burmakin, I.V. Uporov, A.M. Egorov
(Department of Chemical Enzymology, Faculty of Chemistry, М. V. Lomonosov Moscow State University)
In this work preparation of recombinant p-lactamases TEM-1 and TEM-171 of molecular class A, characterized by a single amino acid substitution of valine at position 84 to isoleucine (Val84Ile), was studied. For the first time kinetic parameters for TEM-171 have been obtained with chromogenic substrate CENTA: K^ = 23 цM, kcat = 102 s"1. Competitive type of p-lactamases inhibition by tazobactam was ascertained. The inhibition constants for tazobactam with CENTA as a substrate were as follows: 0.057 цM and 0.047 цM for recombinant P-lactamase TEM-1 and TEM-171, respectively. It was shown that Val84Ile substitution leads to a decrease of p-lactamase TEM-171 thermostability by 1.5 times.
Key words: recombinant P-lactamase TEM-1, TEM-171, CENTA, kinetic parameters, tazobactam, competitive type of inhibition.
Сведения об авторах: Григоренко Виталий Георгиевич - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (vitaly.grigorenko@gmail.com); Андреева Ирина Петровна - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (imtek@newmail.ru); Рубцова Майя Юрьевна - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (mrubtsova@ gmail.com); Бурмакин Владислав Васильевич - студент химического факультета МГУ (dark-vaider@list.ru); Упоров Игорь Владимирович - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (iuporov@gmail.com); Егоров Алексей Михайлович -глав. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. биол. наук (alex.m.egorov@gmail.com).
