CC BY
24
УДК 577.113.6, 577.151.4
ИЗУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ Р-ЛАКТАМАЗЫ КЛАССА А TEM-1 И ЕЕ ИНГИБИРОВАНИЯ СУЛЬБАКТАМОМ, ТАЗОБАКТАМОМ И КЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТОЙ
А.М. Луговая, В.Г. Григоренко
(кафедра химической энзимологии; e-mail: [email protected])
Изучен гомогенный препарат рекомбинантного фермента р-лактамазы TEM-1 класса А, используемый в различных экспрессионных конструкциях в качестве гена-маркера для обеспечения устойчивости клеток к ампициллину; определены его кинетические параметры с использованием хромогенного субстрата CENTA (КМ = 22 мкМ, V =
-1 -1 —1 М 0,39 мкМ/с, Акат = 31,2 с , ккат/КМ =1,4 мкМ -с ). На основании сравнения определенного в работе значения КМ с литературными данными для нативного фермента (КМ = 70 мкМ) показано, что рекомбинантный фермент в 3 раза более специфичен по отношению к субстрату CENTA. Установлен конкурентный тип ингибирования рекомбинантной р-лак-тамазы для сульбактама, тазобактама, клавулановой кислоты. Впервые определены значения констант ингибирования по субстрату CENTA для сульбактама, тазобактама и клаву-
лановой кислоты (К (Сульбактам) = 0,43 мкМ, К (тазобактам) = 0,041 мкМ, KI (клавулановая кислота)
= 0,046 мкМ). Показано, что наиболее эффективными ингибиторами для рекомбинантной Р-лактамазы являются тазобактам и клавулановая кислота, причем их ингибирующее действие можно считать одинаковым.
Ключевые слова: рекомбинантная ft-лактамаза TEM-1, CENTA, кинетические параметры, сульбактам, тазобактам, клавулановая кислота, конкурентный тип ингибирования.
Основным фактором, ограничивающим клиническую эффективность антибактериальных препаратов, является способность микроорганизмов вырабатывать устойчивость к их действию. Этот биологический феномен называется антибиотикорезистентнос-тью. Известно несколько механизмов резистентности микроорганизмов к пенициллинам и цефалоспоринам, охватывающим более половины всех используемых в настоящее время антибиотиков, однако основным из них является гидролиз антибиотика ферментами Р-лактамазами, образующимися в клеточной стенке. Р-лактамазы разрушают р-лактамное кольцо, в результате чего антибиотик теряет свою антимикробную активность [1]. Детальное исследование механизмов каталитической активности Р-лактамаз позволяет выявить их важнейшие функциональные особенности и является обязательным для описания новых ферментов и изучения их роли в формировании резистентности [2].
Расщепление Р-лактамных антибиотиков в растворе обычно сопровождается снижением его оптической плотности в ультрафиолетовом диапазоне, поэтому для
определения активности Р-лактамаз наиболее удобен метод спектрофотометрии [2]. Использование хромо-генных субстратов (СЕКТА, нитроцефин, цефалоспо-рин, цефалотин и др.) позволяет работать в видимом диапазоне.
Впервые субстрат СЕКТА был испытан в работе [3] как субстрат для ТЕМ-1 и некоторых других Р-лактамаз. Клавулановая кислота, сульбактам и тазобактам - вещества, эффективно инактивирующие Р-лактамазы и не обладающие антибактериальной активностью сами по себе. Они используются в комплексах с антибиотиками. Одним из первых примеров такой комбинации является лекарственное средство "Аугментин", представляющее смесь клаву-лановой кислоты и амоксициллина.
В настоящее время в литературе отсутствуют сведения о константах ингибирования для сульбактама, тазобактама и клавулановой кислоты, измеренных при использовании субстрата СЕКТА.
Цель настоящего исследования - изучение каталитических свойств рекомбинантной Р-лактамазы ТЕМ-1 класса А, определение типа ингибирования
сульбактамом, тазобактамом, клавулановой кислотой и соответствующих значений констант ингибирования (К); анализ полученных результатов и их сравнение с литературными данными для нативного фермента ТЕМ-1.
Методы
Измерение активности рекомбинантной ¡3-лактамазы
Активность Р-лактамазы по субстрату СЕНТА определяли на спектрофотометре "ИУ-1б02" ("Бкшайт", Япония) при 25°С. Образование хромо-генного продукта детектировали при длине волны 405 нм (Ав405 = 6400 М-1-см-1). Измерение активности проводили в 50 мМ На-фосфатном буферном растворе (рН 7,0).
В работе использовали препарат рекомбинантного фермента Р-лактамазы (гомогенный по электрофорезу), полученный ранее в лаборатории инженерной эн-зимологии кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.
Определение КМ V и Акат
Раствор субстрата Р-лактамазы СЕНТА (5 мМ в 50 мМ На-фосфатном буфере; рН 7,0) и аликвоту фермента (10 мкл; 1,2 мкМ) добавляли к 50 мМ натрий-фосфатному буферному раствору (рН 7,0). Общий объем смеси составлял 1 мл. Измерения проводили при начальной концентрации СЕНТА, равной 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 мкМ. Значения кинетических параметров (КМ -константа Михаэлиса, V - максимальная скорость реакции) определяли по графикам, где экспериментальные данные представлены в координатах Лайну-ивера-Берка и в прямых координатах. Значения начальных скоростей ферментативной реакции определяли по начальному линейному участку кинетической кривой накопления продукта при проведении реакции гидролиза (£кат= ^/[Е0]), где £кат - каталитическая константа скорости реакции, [Е0] - начальная концентрация фермента [4, 5].
Определение К1
Концентрированные растворы ингибиторов (5 мМ) получали растворением определенной навески реагента в 50 мМ буферном растворе фосфата На (рН 7,0). Раствор СЕОТА (5 мМ в 50 мМ На-фосфатном буфере при рН 7,0), раствор ингибитора и аликвоту фермента (10 мкл) добавляли к 50 мМ На-фосфатному
буферному раствору (рН 7,0). Общий объем смеси 1 мл. Измерения проводили при начальной концентрации CENTA, равной 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200 мкМ. Начальную концентрацию ингибитора подбирали в зависимости от силы ингибирования; для сульбактама она составила 0, 10, 20, 50 мкМ, для клавулановой кислоты - 0; 0,07; 0,15; 0,25; 0,6; 0,8 мкМ, для тазо-бактама - 0; 0,03; 0,06; 0,2; 0,6 мкМ.
Константы ингибирования определяли по графику, на котором экспериментальные данные представлены в координатах (^м,каж, С1]), где Км,каж - кажущаяся (эффективная) константа Михаэлиса, [I] - концентрация ингибитора [5]. Каждое измерение активности проводили трижды.
Обработка и представление результатов экспериментов
При расчете использовали свободно распространяемое программное обеспечение на операционной системе "Линукс"; пакет прикладных программ (текстовые, табличные, графические) "Open Office 3.01".
Результаты и их обсуждение
На рис. 1, a приведен график зависимости начальной скорости реакции (мкМ/с) от концентрации субстрата. На 1, б представлена данная зависимость в координатах Лайнуивера-Берка.
Как упоминалось выше, расщепление Р-лактамных антибиотиков в растворе обычно сопровождается снижением оптической плотности в ультрафиолетовом диапазоне, что позволяет спектрофотометрически определять активность Р-лактамаз [2]. Использование хромогенных субстратов (CENTA, нитроцефин, цефа-лоспорин, цефалотин и др.) позволяет работать в видимом диапазоне. Впервые субстрат CENTA был испытан в работе [3] как субстрат для TEM-1 и некоторых других Р-лактамаз. В настоящей работе были получены следующие значения кинетических параметров для рекомбинантной Р-лактамазы: КМ = 22 мкМ, V = 0,39 мкМ/с, ¿кат = 31,2 с-1, £каАм = 1,4 мкМ 1-c 1.
Измеренная величина КМ для рекомбинантной Р-лактамазы по синтетическому хромогенному субстрату CENTA составляет 22 мкМ, что в 3,2 раза ниже значения, приведенного в работе [3]; значение ¿кат/КМ = 1,4, что близко к значению данного отношения для нативного фермента, что позволяет говорить об их схожей каталитической эффективности для субстрата CENTA. Численные расхождения в значениях констант Михаэлиса можно объяснить ами-
Рис. 1. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза субстрата Р-лактамазы (мкМ/с) от концентрации субстрата (a), зависимость начальной скорости реакции гидролиза субстрата Р-лактамазы CENTA (мкМ/с) от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (1/v0, 1/[S0]), где v0 - начальная скорость реакции; [S0] - начальная концентрация субстрата (б)
Рис. 2. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза субстрата Р-лактамазы СЕКТА (мкМ/с) от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка (1/у0, 1/Р0Р при разных концентрациях ингибитора (мкМ): а - сульбактама (1 - 0; 2 - 10; 3 - 30; 4 - 50); б - тазобактама (1 - 0; 2 - 0,03; 3 - 0,06; 4 - 0,20; 5 - 0,60); в - клавулановой кислоты (1 - 0;
2 - 0,07; 3 - 0,15; 4 - 0,25; 5 - 0,60; 6 - 0,80)
нокислотным полиморфизмом в первичной структуре Р-лактамазы TEM-1. Так, в нашем случае в положении 82 находится Val, а по информации банка данных - Ile. Возможны также влияния различных посттрансляционных модификаций.
Анализ результатов, представленных на рис. 2, a, б, в позволяет говорить о конкурентном ингибирова-нии для рекомбинантной Р-лактамазы сульбактамом, тазобактамом и клавулановой кислотой. Данный факт отражает структурное сходство трех изученных ингибиторов с гидролизуемыми субстратами Р-лактамных антибиотиков (пенициллины и цефалоспо-рины). Рассчитанные по экспериментальным данным константы ингибирования составляют 0,43; 0,041 и
0,046 мкМ для сульбактама, тазобактама и клавулановой кислоты соответственно. Опубликованные значения констант ингибирования для ТЕМ-1 составляют (мкМ) 0,45 (субстрат-пенициллин) для сульбактама [6]; 0,014 (субстрат-нитроцефин) для тазобактама [7], 0,07 (субстрат-пенициллин) для клавулановой кислоты [6].
Полученные и литературные значения констант ингибирования совпадают по порядку величины. Для рекомбинантной Р-лактамазы самыми эффективными ингибиторами являются тазобактам и клавулановая кислота как обладающие наименьшими значениями К1, причем значения констант ингибирования практически совпадают.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП "Национальная технологическая база" на
2007-2011 годы (контракт ГП/07/442/НТБ/К).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fink A.L. // Pharmaceutical Research. 1985. 2. N 2. P. 55.
2. Эйделъштейн М.В. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. 3. № 3. С. 223.
3. Bebrone C., Moali C., Mahy F. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. 45. N 6. P. 1868.
4. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кенетики. М., 1979. С. 36, 80.
5. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М., 1977. С. 216.
6. Delaire M., Labia R., Samama J.-P., Masson J.-M. // J. Biol. Chem. 1992. 267. N 29. P. 20600.
7. Caporale B., Franceschini N., Perilli M. et al. // Antimicrob. Agents Chemother. 2004. 48. N 9. P. 3579.
Поступила в редакцию 20.01.10
STUDY OF CATALYTIC PROPERTIES OF RECOMBINANT CLASS A TEM-1 p-LACTAMASE AND ITS INHIBITION BY SULBACTAM, TAZOBACTAM AND CLAVULANIC ACID
A.M. Luhavaya, V.G. Grigorenko
(Division of Chemical Enzymology)
In this work was studied homogeneous preparation of recombinant class A TEM-1 p-lactamase; kinetic parameters obtained with chromogenic substrate CENTA are as follows: KM = 22 mM, V = 0,39 ^M/s, kcat = 31,2 s-1, kca/KM =1,4 ^M-1s-1. Based on the comparison of determined Michaelis constant (KM = 22 pM) with literature data it is approved that recombinant enzyme is about 3 times more specific against CENTA than the native one (KM = 70 pM). It was ascertained competitive type of inhibition for sulbactam, tazobactam and clavulanic acid. For the first time the inhibition constants for recombinant p-lactamase TEM-1 with CENTA as a substrate for
sulbacta^ tazobactam clavulanic acid (^(sulbactam) = 0,43 Kj(tazobactam) = 0,041
K/(ciavuianic acid) = 0,046 p,M) have been determined. It was shown that tazobactam and clavulanic acid are the most effective inhibitors for the recombinant p-lactamase as having the least value of Kj and their inactivation influence can be accepted as identical.
Key words: recombinant в-lactamase TEM-1, CENTA, kinetic parameters, sulbactam, tazobactam, clavulanic acid, competitive type of inhibition.
Сведения об авторах: Луговая Анна Михайловна - студентка 4 курса кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ ([email protected]); Григоренко Виталий Георгиевич - науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук ([email protected]).
